A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

Published: January 07, 2020

doi:

Laura A. McKiel, Kimberly A. Woodhouse, Lindsay E. Fitzpatrick

¹Department of Chemical Engineering,Queen’s University

Summary

Ce protocole fournit aux chercheurs une méthode rapide et indirecte de mesure de l’activité du facteur de transcription NF-B/AP-1, dépendante de TLR, dans une lignée de cellules macrophages murines en réponse à une variété de surfaces polymères et de couches protéiques adsorbées qui modélisent le microenvironnement de l’implant biomatériau.

Abstract

La réponse inflammatoire persistante d’hôte à un biomatériau implanté, connu sous le nom de réaction de corps étranger, est un défi significatif dans le développement et la mise en œuvre des dispositifs biomédicaux et des constructions d’ingénierie de tissu. Les macrophages, une cellule immunitaire innée, sont des acteurs clés dans la réaction du corps étranger parce qu’ils restent au site de l’implant pendant toute la durée de vie de l’appareil, et sont couramment étudiés pour acquérir une compréhension de cette réponse néfaste de l’hôte. De nombreux chercheurs en biomatériaux ont montré que les couches de protéines adsorbées sur les matériaux implantés influencent le comportement des macrophages, et par la suite ont un impact sur la réponse de l’hôte. Les méthodes de cet article décrivent un modèle in vitro utilisant des couches de protéines adsorbed contenant des molécules de dommages cellulaires sur les surfaces de biomatériaux polymères pour évaluer les réponses macrophages. Une lignée de cellules macrophages de journaliste de NF-B/AP-1 et l’essai colorimétrique associé de phosphatase alkaline ont été employés comme méthode rapide pour examiner indirectement l’activité de facteur de transcription de NF-B/AP-1 en réponse aux couches complexes de protéine adsorbée contenant des protéines sanguines et des modèles moléculaires dommages-associés, comme modèle des couches complexes de protéine adsorbed formées sur des surfaces de protéine de biomatériau in vivo.

Introduction

La réaction du corps étranger (FBR) est une réponse chronique de l’hôte qui peut avoir un impact négatif sur la performance d’un matériau ou d’un dispositif implanté (p. ex. dispositifs d’administration de médicaments, biocapteurs), par la libération persistante de médiateurs inflammatoires et en empêchant l’intégration entre le matériau implanté et le tissu environnant¹. Cette réponse immunitaire innée est initiée par la procédure d’implantation et se caractérise par la présence à long terme de cellules immunitaires innées et la formation de capsules fibreuses autour de l’implant¹. Dans le contexte des réponses matérielles de l’hôte, les interactions macrophage-matérielle ont un impact significatif sur la progression de la réponse de l’hôte et le développement d’un FBR¹. Les macrophages sont une population de cellules immunitaires innées diversifiées, recrutées au site de l’implant soit à partir de populations de macrophages résident de tissus ou du sang comme macrophages dérivés de monocytes. Ils commencent à s’accumuler sur le site de l’implant peu de temps après l’implantation, et en quelques jours deviennent la population cellulaire prédominante dans le microenvironnement implantaire. Les macrophages matériels, ainsi que les cellules géantes du corps étranger (FBGC) formées par la fusion des macrophages, peuvent persister à la surface du matériau pendant toute la durée de vie de l’implant²^,³. Par conséquent, les macrophages sont considérés comme des acteurs clés dans la réponse du corps étranger en raison de leurs rôles orchestrant les étapes caractéristiques de la FBR: réponse inflammatoire aigue, remodelage des tissus, et la formation de tissu fibrotique¹.

Les récepteurs de péage-comme (TLRs) sont une famille des récepteurs de reconnaissance de modèle qui sont exprimés par beaucoup de cellules immunitaires, y compris des macrophages, et ont été montrés pour jouer un rôle significatif dans l’inflammation et la guérison de blessure. En plus des ligands dérivés d’agents pathogènes, les TLR sont capables de lier les molécules endogènes, connues sous le nom de modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), qui sont libérés pendant la nécrose cellulaire et d’activer les voies de signalisation inflammatoires entraînant la production de cytokines proinflammatoires⁴. Nous et d’autres avons proposé que les dommages encourus pendant les procédures d’implantation de biomatériaux mous libèrent des DAMPs, qui adsorbent alors aux surfaces de biomatériaux en plus des protéines de sang et modulent les interactions suivantes de cellules-matériel⁵^,⁶. Lorsque les macrophages interagissent avec la couche protéique adsorbed sur un implant, leurs TLR de surface peuvent reconnaître les DAMP adsorbés et activer les cascades de signalisation pro-inflammatoire, conduisant à nf-B et AP-1 transcription facteur d’activation et de production de cytokines proinflammatoires. Nous avons précédemment montré que les macrophages murines ont considérablement augmenté l’activité de NF-B/AP-1 et le facteur de nécrose de tumeur (TNF-, cytokine proinflammatoire) sécrétion en réponse à DAMP-contenant des couches de protéines adsorbed sur une variété de surfaces polymères par rapport aux surfaces avec sérum adsorbed ou plasma seulement (c.-à-d., pas de DAMPs présents), et que cette réponse est largement médiée par TLR2, tandis que TLR4 joue un rôle moindre⁵.

La lignée de cellules macrophages de reporter NF-B/AP-1 (Tableau des matériaux) utilisée dans ce protocole est une méthode pratique pour mesurer l’activité relative de NF-B et d’AP-1 dans les macrophages⁵^,⁷^,⁸. En combinaison avec les inhibiteurs de voie de TLR, cette ligne de cellules est un outil utile pour étudier l’activation de TLR et son rôle dans l’inflammation en réponse à une série de stimulus⁵^,⁷^,⁸. Les cellules de journaliste sont une ligne cellulaire macrophage-like de souris modifiée qui peut produire de façon stable la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) sur l’activation de facteur de transcription NF-B et AP-1⁹. L’analyse colorimétrique enzymatique de phosphatase alcaline(tableau des matériaux)peut alors être utilisée pour quantifier les quantités relatives d’expression SEAP comme mesure indirecte de l’activité NF-B/AP-1. Comme nf-B et AP-1 sont en aval de nombreuses voies de signalisation cellulaire, neutraliser les anticorps et les inhibiteurs ciblant des TLR spécifiques (p. ex. TLR2) ou des molécules adaptatrices TLR (p. ex. MyD88) peuvent être utilisés pour vérifier le rôle d’une voie spécifique. La méthodologie décrite dans cet article fournit une approche simple et rapide pour évaluer la contribution de la signalisation de TLR dans les réponses de macrophage murine à une série de surfaces polymères avec des couches de protéine adsorbées contenant des protéines de sang et des DAMPs comme modèle in vitro des biomatériaux implantés.

Protocol

1. Préparation des médias et des réactifs Préparer les médias fibroblastes. Combinez 450 ml du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 ml de pénicilline/streptomycine. Conserver à 4 oC jusqu’à 3 mois. Préparer les médias de croissance macrophage journaliste en 50 ml aliquots. Combiner 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS, 5 g/mL de réactif d’élimination du mycoplasme(tableau des matériaux),et 200 g/mL de phléomycine D1(Tableau des …

Representative Results

Des méthodes de nettoyage des surfaces recouvertes de polymères ont été testées pour s’assurer qu’il n’y avait pas de perturbation du revêtement, ce qui serait considéré comme un changement dans l’angle de contact avec l’eau à un bordereau de verre non couché (Figure 2). Des lames de microscope recouvertes de PMMA dans 70 % d’éthanol pendant 1 h ont été trouvés pour enlever le revêtement PMMA(figure 2, panneau gauche), probablement en raison de la…

Discussion

L’un des principaux objectifs de notre laboratoire est la réponse de l’hôte aux implants solides de tissus mous biomatériaux, et en particulier comment les dommages cellulaires encourus pendant la procédure d’implantation influe sur la réponse de l’hôte. Les travaux présentés ici décrivent des expériences préliminaires utilisant une lignée de cellules macrophages reporter et du lysate cellulaire contenant du DAMP généré sin in vitro, afin d’étudier l’influence des molécules libérées lors de dommages ce…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le financement opérationnel du Projet de recherche des Instituts de santé du Canada (PTJ 162251), du Comité consultatif du Sénat de l’Université Queen’s et du soutien à l’infrastructure du Fonds de leadership de la Fondation canadienne pour l’innovation John Evan (projet 34137) et du Fonds de recherche du ministère de la Recherche et de l’Innovation de l’Ontario (projet 34137). L.A.M. a reçu l’appui d’une bourse R. Samuel McLaughlin de l’Université Queen’s, d’une maîtrise en études supérieures du Conseil canadien des études supérieures en sciences naturelles et en génie du Canada et d’une bourse d’études supérieures de l’Ontario. Les auteurs tient à remercier le Dr Myron Szewczuk pour son généreux don de la lignée de cellules macrophages journaliste NF-B/AP-1 et les Drs Michael Blennerhassett et Sandra Lourenssen pour l’utilisation de leur système d’imagerie gel et lecteur de plaques.

Materials

*Cell culture reagents*
anti-mouse/human CD282 (TLR2)	Biolegend	121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor)	Invivogen	TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin	InnovativeResearch	IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml	Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Fisher Scientific	14190250	No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade	Wisent	98150
LPS-EK	Invivogen	TLRL-EKLPS	Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts	ATCC	CRL-1658
Pam3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-100ML
Plasmocin	Invivogen	ANT-MPP	Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells	Invivogen	raw-sp	NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061
TrypLE express enzyme (1X)	Fisher Scientific	12604021	animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin	Invivogen	ANT-ZN-1
*Kits and assays*
ELISA precoated plates, mouse IL-6	Biolegend	B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α	Biolegend	B220233
Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE)	Associates of Cape Cope Inc.	E0005-5	Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL	Associates of Cape Cope Inc.	WP1001	Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay	Fisher Scientific	PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit	Associates of Cape Cope Inc.	C1500-5	Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium	Invivogen	rep-qb2	Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
*Polymeric coating reagents*
Chloroform, anhydrous	Sigma Aldrich	288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous	Commercial Alcohols	P006EAAN	Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps	Fisher Scientific	16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent	Sigma Aldrich	F9755-100ML	Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free)	Fisher Scientific	SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA)	Sigma Aldrich	182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit	Fisher Scientific	50822180
Teflon-AF (fPTFE)	Sigma Aldrich	469610-1G	Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
*Consumables*
Adhesive plate seals	Fisher Scientific	AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps	Fisher Scientific	03-337-4
Clear PS 48-well plate	Fisher Scientific	08-772-52
Clear TCPS 96-well plate	Fisher Scientific	08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate	Fisher Scientific	08-772-1C
Cover glasses, circles	Fisher Scientific	12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25	Fisher Scientific	10-126-10
sticky-Slide 8 Well	Ibidi	80828
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150	Fisher Scientific	08-772-48

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Citer Cet Article

McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).