Ein Makrophagen-Reporter-Zell-Assay zur Untersuchung der toll-like Receptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalisierung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen
Summary
Dieses Protokoll bietet Forschern eine schnelle, indirekte Methode zur Messung der TLR-abhängigen NF–B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität in einer murinen Makrophagenzelllinie als Reaktion auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen und adsorbten Proteinschichten, die die Mikroumgebung des Biomaterials Implantate modellieren.
Abstract
Die anhaltende Entzündungswirtsreaktion auf ein implantiertes Biomaterial, die sogenannte Fremdkörperreaktion, stellt eine große Herausforderung bei der Entwicklung und Umsetzung biomedizinischer Geräte und Gewebetechnikkonstrukte dar. Makrophagen, eine angeborene Immunzelle, sind Schlüsselakteure in der Fremdkörperreaktion, weil sie während der Lebensdauer des Geräts an der Implantatstelle bleiben und häufig untersucht werden, um ein Verständnis dieser schädlichen Wirtsreaktion zu erlangen. Viele Biomaterialforscher haben gezeigt, dass adsorbierte Proteinschichten auf implantierten Materialien das Makrophagenverhalten beeinflussen und anschließend die Wirtsreaktion beeinflussen. Die Methoden in diesem Papier beschreiben ein In-vitro-Modell mit adsorbierten Proteinschichten, die zelluläre Schadensmoleküle auf Polymerbiomaterialoberflächen enthalten, um Makrophagenreaktionen zu bewerten. Als schnelles Verfahren zur indirekten Untersuchung der NF–B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität als Reaktion auf komplexe adsorbierte Proteinschichten, die Blutproteine und schadensassoziierte molekulare Muster enthalten, wurden eine NF-B/AP-1-Makrophagen-Zelllinie und der zugehörige farbmetrische alkalische Phosphatase-Assay als schnelle Methode verwendet, um indirekt die Aktivität des NF–B/AP-1-Transkriptionsfaktors als Reaktion auf komplexe adsorbierte Proteinschichten mit Blutproteinen und schadensassoziierten molekularen Mustern als Modell der komplexen adsorbierten Proteinschichten zu untersuchen, die auf biomaterialen Oberflächen in vivo gebildet wurden.
Introduction
Die Fremdkörperreaktion (FBR) ist eine chronische Wirtsreaktion, die sich negativ auf die Leistung eines implantierten Materials oder Geräts (z. B. Arzneimittelabgabegeräte, Biosensoren) auswirken kann, durch die anhaltende Freisetzung von Entzündungsmediatoren und durch Behinderung der Integration zwischen dem implantierten Material und dem umgebenden Gewebe1. Diese angeborene Immunantwort wird durch das Implantationsverfahren eingeleitet und zeichnet sich durch die langfristige Präsenz angeborener Immunzellen und faseriger Kapselbildung um das Implantat1aus. Im Kontext von materialbasierten Host-Antworten haben Makrophagen-Material-Wechselwirkungen einen signifikanten Einfluss auf den Verlauf der Host-Antwort und die Entwicklung eines FBR1. Makrophagen sind eine vielfältige angeborene Immunzellpopulation, die entweder aus geweberesidenten Makrophagenpopulationen oder aus dem Blut als monozytenabgeleitete Makrophagen an die Implantatstelle rekrutiert wird. Sie beginnen sich kurz nach der Implantation an der Implantatstelle anzusammeln und werden innerhalb weniger Tage zur vorherrschenden Zellpopulation in der Mikroumgebung des Implantats. Materialhafte Makrophagen, zusammen mit Fremdkörper-Riesenzellen (FBGC), die durch Makrophagenfusion gebildet werden, können an der Materialoberfläche über die Lebensdauer des Implantats2,3bestehen bleiben. Makrophagen gelten daher aufgrund ihrer Rolle bei der Orchestrierung der charakteristischen Schritte des FBR als Schlüsselakteure in der Fremdkörperreaktion: akute Entzündungsreaktion, Gewebeumbau und Bildung von fibrotischem Gewebe1.
Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind eine Familie von Mustererkennungsrezeptoren, die von vielen Immunzellen ausgedrückt werden, einschließlich Makrophagen, und haben gezeigt, dass eine bedeutende Rolle bei Entzündungen und Wundheilung spielen. Zusätzlich zu pathogenen Liganden sind TLRs in der Lage, endogene Moleküle, sogenannte damage-associated molecular patterns (DAMPs), zu binden, die während der Zellnekrose freigesetzt werden, und entzündliche Signalwege zu aktivieren, die zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen führen4. Wir und andere haben vorgeschlagen, dass Schäden, die während der Implantation von Weichgewebebiomaterial entstehen, DAMPs freisetzen, die dann zusätzlich zu Blutproteinen auf biomateriale Oberflächen adsorbieren und nachfolgende Zell-Material-Wechselwirkungen modulieren5,6. Wenn Makrophagen mit der adsorbierten Proteinschicht auf einem Implantat interagieren, können ihre Oberflächen-TLRs adsorbierte DAMPs erkennen und proinflammatorische Signalkaskade aktivieren, was zur Aktivierung des NF-B- und AP-1-Transkriptionsfaktors und zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen führt. Wir haben bereits gezeigt, dass murine Makrophagen die NF-B/AP-1-Aktivität und den Tumornekrosefaktor proinflammatorischezytokin) Sekretion als Reaktion auf DAMP-haltige adsorbierte Proteinschichten auf einer Vielzahl von polymeren Oberflächen im Vergleich zu Oberflächen mit nur adsorbiertem Serum oder Plasma (d. h. keine DAMPs vorhanden), und dass diese Reaktion weitgehend durch TLR2 vermittelt wird, während TLR4 eine geringere Rolle spielt5.
Die in diesem Protokoll verwendete Makrophagen-Zelllinie nF–B/AP-1-Reporter (Tabelle der Materialien) ist eine praktische Methode, um die relative NF-B- und AP-1-Aktivität in den Makrophagen5,7,8zu messen. In Kombination mit TLR-Signalweg-Inhibitoren ist diese Zelllinie ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der TLR-Aktivierung und ihrer Rolle bei Entzündungen als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen5,7,8. Die Reporterzellen sind eine modifizierte Mausmakrophagen-ähnliche Zelllinie, die bei NF-B und AP-1 Transkriptionsfaktoraktivierung9stabil abgesonderte embryonale alkalische Phosphatase (SEAP) erzeugen kann. Der kolorimetrische enzymatische alkalische Phosphatase-Assay (Materialtabelle) kann dann verwendet werden, um relative Mengen der SEAP-Expression als indirektes Maß für die NF-B/AP-1-Aktivität zu quantifizieren. Da NF-B und AP-1 nach geschaltet von vielen Zellsignalsignalpfaden sind, können neutralisierende Antikörper und Inhibitoren, die auf bestimmte TLRs (z. B. TLR2) oder TLR-Adaptermoleküle (z. B. MyD88) abzielen, verwendet werden, um die Rolle eines bestimmten Signalwegs zu überprüfen. Die in diesem Artikel beschriebene Methodik bietet einen einfachen und schnellen Ansatz zur Bewertung des Beitrags der TLR-Signalisierung in murinen Makrophagenreaktionen zu einer Vielzahl von polymeren Oberflächen mit adsorbierten Proteinschichten, die sowohl Blutproteine als auch DAMPs als In-vitro-Modell implantierter Biomaterialien enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Schwerpunkt unseres Labors ist die Wirtsreaktion auf Feststoff-Weichteilimplantate und insbesondere, wie sich die zellulären Schäden, die während des Implantationsverfahrens entstehen, auf die Wirtsreaktion auswirken. Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt vorläufige Experimente mit einer Reporter-Makrophagen-Zelllinie und in vitro-generiertem DAMP-haltigem Zelllysat, um den Einfluss von Molekülen zu untersuchen, die während zellulärer Schäden (d. h. aus der Implantatchirurgie) auf Makrophagenreaktionen auf …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die operative Finanzierung durch das Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), das Queen es University Senate Advisory Research Committee und die Infrastrukturunterstützung durch den Leadership Fund der Canadian Foundation for Innovation John Evan (Projekt 34137) und den Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Projekt 34137). L.A.M. wurde von einem Queen es University R. Samuel McLaughlin Fellowship, einem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Canadian Graduate Scholarship Master es Award und einem Ontario Graduate Scholarship unterstützt. Die Autoren danken Dr. Myron Szewczuk für sein großzügiges Geschenk der NF-B/AP-1 Reporter Makrophagenzelllinie und Drs. Michael Blennerhassett und Sandra Lourenssen für den Einsatz ihres Gel-Bildgebungssystems und Plattenlesers.
Materials
| Cell culture reagents | |||
| anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
| Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
| NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
| Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| Kits and assays | |||
| ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
| Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
| LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
| Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
| QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
| Polymeric coating reagents | |||
| Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
| Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
| Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
| Consumables | |||
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
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