고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석
Summary
이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.
Abstract
이식된 생체 재료에 대한 지속적인 염증 성 숙주 반응은 이물질 반응으로 알려져 있으며 생물 의학 장치 및 조직 공학 구조의 개발 및 구현에 중요한 과제입니다. 대식 세포, 타고난 면역 세포, 그들은 장치의 수명 동안 임 플 란 트 사이트에 남아 있기 때문에 이물질 반응에 주요 선수, 그리고 일반적으로이 해로운 호스트 응답의 이해를 얻기 위해 공부. 많은 생체 재료 연구원은 이식된 물질에 흡착된 단백질 층이 대식세포 행동에 영향을 미치고, 이어서 호스트 반응에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 이 백서의 방법은 중합체 생체 재료 표면에 세포 손상 분자를 포함하는 흡착 된 단백질 층을 사용하여 대식세포 반응을 평가하는 생체 외 내 모델을 설명합니다. NF-θB/AP-1 리포터 대식세포주 세포주 및 관련 반색 알칼리성 인산염 분석법은 생체물질 표면에 형성된 복합 흡착 단백질 층과 손상 관련 분자 패턴을 포함하는 복잡한 흡착 단백질 층에 반응하여 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 간접적으로 검사하는 신속한 방법으로 사용되었다.
Introduction
이물질 반응(FBR)은 염증 성 매개체의 지속적인 방출을 통해 이식된 물질 또는 장치(예를 들어, 약물 전달 장치, 바이오센서)의 성능에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 만성 숙주 반응이며, 이식된 물질과 주변 조직 사이의 통합을 방해한다1. 이러한 선천성 면역 반응은 이식 절차에 의해 시작되며 임플란트1주위의 선천성 면역 세포 및 섬유질 캡슐 형성의 장기적인 존재를 특징으로 한다. 재료 호스트 응답의 맥락에서, 대식세포-물질 상호 작용은 FBR1의호스트 반응 및 개발의 진행에 상당한 영향을 미친다. 대식세포는 다양한 선천성 면역 세포 집단으로, 조직 상주 대식세포 집단또는 단핵구 유래 대식세포로서 혈액에서 임플란트 부위로 모집된다. 그(것)들은 이식 직후에 임플란트 사이트에 축적하기 시작하고, 며칠 안에 임플란트 미세 환경에서 지배적인 세포 인구가 됩니다. 물질-부착 대식세포는 대식세포 융합을 통해 형성된 이물질 거대 세포(FBGC)와 함께, 임플란트의 수명 동안 물질 표면에서 지속될 수 있다2,3. 결과적으로, 대식세포는 급성 염증 반응, 조직 리모델링 및 섬유조직의 형성과 같은 FBR의 특징적인 단계를 조율하는 역할로 인해 이물질 반응의 핵심 플레이어로 간주됩니다1.
톨-유사 수용체(TLRs)는 대식세포를 포함한 많은 면역 세포에 의해 발현되는 패턴 인식 수용체의 가족이며, 염증 및 상처 치유에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 병원균 유래 리간드 이외에, TLRs는 세포 괴사 동안 방출되는 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)으로 알려진 내인성 분자를 결합할 수 있으며, 이로 인해 염증성 사이토카인의 생산을 초래하는 염증 성 신호 경로를 활성화할 수있다 4. 당사와 다른 사람들은 연조직 생체물질 이식 시 발생하는 손상이 DP를 방출하고, 이에 따라 혈액 단백질 이외에 생체물질 표면에 흡착하고 후속 세포-물질 상호작용을 조절하는것을제안했다5,6. 대식세포가 임플란트의 흡착 된 단백질 층과 상호 작용할 때, 표면 TRS는 흡착 된 DAMPs를 인식하고 전염증성 신호 캐스케이드를 활성화하여 NF-θB 및 AP-1 전사 인자 활성화 및 전염증성 사이토카인 생산을 유도 할 수 있습니다. 우리는 이전에 뮤린 대식세포가 NF-θB/AP-1 활성및 종양 괴사 인자 α(TNF-α, proinflammatory cytokine) 흡착 된 혈청 또는 플라즈마만을 가진 표면에 비해 다양한 중합체 표면에 DAMP 함유 흡착 단백질 층에 대한 분비 (즉, DAMPs가 존재하지 않는다), 이러한 반응은 TLR2에 의해 주로 매개되는 반면, TLR4는 더 적은 역할을 한다5.
본 프로토콜에 사용되는 NF-θB/AP-1 리포터 대식세포주(표오브 머티리얼)는대식세포5,7,8에서상대적인 NF-θB 및 AP-1 활성을 측정하는 편리한 방법이다. TLR 통로 억제제와 조합하여, 이 세포주들은 다양한자극5,7,8에반응하여 염증에서 TLR 활성화 및 그 역할을 조사하는 데 유용한 도구이다. 리포터 세포는 NF-θB 및 AP-1 전사 인자 활성화시분비된 배아 알칼리성 인산염(SEAP)을 안정적으로 생성할 수 있는 변형된 마우스 대식세포형 세포주이다. 색색 효소 알칼리성 인산염 분석법(물자표)은NF-θB/AP-1 활성의 간접 측정으로서 SEAP 발현의 상대적 양을 정량화하는데 사용될 수 있다. NF-θB 및 AP-1은 많은 세포 신호 경로의 다운스트림으로서, 특정 TLR(예를 들어, TLR2) 또는 TLR 어댑터 분자(예를 들어, MyD88)를 표적화하는 항체 및 억제제 중화는 특정 경로의 역할을 검증하는데 사용될 수 있다. 이 문서에 기술된 방법론은 이식된 생체 재료의 체외 모델로서 혈액 단백질과 DAMPs를 모두 포함하는 흡착단백질 층을 가진 다양한 중합체 표면에 대한 뮤린 대식세포 반응에서 TLR 신호의 기여도를 평가하기 위한 간단하고 신속한 접근법을 제공한다.
Protocol
1. 미디어 및 시약 준비 섬유아세포 매체를 준비합니다. Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM), 태아 소 혈청 50 mL (FBS), 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 mL를 결합하십시오. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오. 50 mL aliquots에서 리포터 대식세포 성장 매체를 준비합니다. 45 mL의 DMEM, 5 mL의 FBS, 5 μg/mL 마이코플라즈마 제거 시약(재료 표),200 μg/mL phleomycin D1(재료 표)을?…
Representative Results
폴리머 코팅 표면에 대한 세정 방법은 코팅의 중단이 없는지 확인하기 위해 시험되었으며, 이는 코팅되지 않은 유리 커버슬립에 대한 물 접촉각의 변화로 볼 수있다(도 2). PMMA 코팅 된 현미경 슬라이드를 1 시간 동안 70 % 에탄올에 담그면 PMMA 코팅(그림 2, 왼쪽 패널)을 제거하는 것으로 나타났으며, 80 wt % 에탄올13에서PMMA의 용해도로 인…
Discussion
우리 실험실의 주요 초점은 고체 생체 재료 연조직 임플란트에 대한 숙주 반응이며, 특히 이식 절차 중에 발생한 세포 손상이 숙주 반응에 미치는 영향입니다. 여기에 제시된 일은 생체 재료에 대한 대식세포 반응에 대한 세포 손상(즉, 임플란트 수술)중에 방출된 분자의 영향을 조사하기 위해 리포터 대식세포 주및 시험관내 생성 된 DAMP 함유 세포 용해제를 이용한 예비 실험을 설명합니다. 섬유?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감사하게도 건강 연구 프로젝트의 캐나다 연구소에서 운영 자금을 인정 (PTJ 162251), 혁신 존 에반의 리더십 기금에 대한 캐나다 재단의 여왕의 대학 상원 자문 연구위원회 및 인프라 지원 (프로젝트 34137) 및 연구 및 혁신 온타리오 연구 기금의 교육부 (프로젝트 34137). L.A.M.은 퀸즈 대학교 R. 새뮤얼 맥러플린 펠로우십, 캐나다 캐나다 대학원 장학금 석사 상 및 온타리오 대학원 장학금의 자연 과학 및 공학 연구 위원회의 지원을 받았습니다. 저자는 NF-θB/AP-1 리포터 대식세포 주현의 그의 관대 한 선물에 대한 박사 마이런 Szewczuk 감사하고 박사 마이클 블레너 하셋과 산드라 루렌센 은 젤 이미징 시스템과 플레이트 리더의 사용에 대한.
Materials
| Cell culture reagents | |||
| anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
| Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
| NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
| Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| Kits and assays | |||
| ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
| Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
| LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
| Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
| QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
| Polymeric coating reagents | |||
| Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
| Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
| Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
| Consumables | |||
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
References
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Citer Cet Article
McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).