Summary
Här presenterar vi ett detaljerat förfarande för att köra en design av experiment i en automatiserad mikro-bioreaktor följt av cellskörd och proteinkvantifiering med hjälp av en Protein A-kolumn.
Abstract
Optimering av bioprocesser för att öka avkastningen av önskade produkter är av betydelse inom den biofarmaceutiska industrin. Detta kan uppnås genom stamval och genom att utveckla bioprocessparametrar. Shake kolvar har använts för detta ändamål. De saknar dock förmågan att kontrollera processparametrar som pH och upplöst syre (DO). Denna begränsning kan övervinnas med hjälp av en automatiserad mikrobioreaktor. Dessa bioreaktorer efterliknar odling i större skala. En av de stora fördelarna med detta system är integrationen av Design of Experiment (DOE) i programvaran. Den här integreringen gör det möjligt att upprätta en design där flera processparametrar kan varieras samtidigt. De kritiska processparametrarna och optimala bioprocessförhållanden kan analyseras inom programvaran. Fokus för det arbete som presenteras här är att introducera användaren till de steg som ingår i processdesign i programvaran och införlivandet av DOE inom odlingskörningen.
Introduction
Den globala biofarmaceutiska marknaden var värd mer än 250 miljarder DOLLAR under 2018 och har kontinuerligt expanderat1. Läkemedelsföretag är på väg bort från att producera små molekylära läkemedel till biotekniskt producerade therapeutics såsom rekombinanta proteiner. Dessa ensam är ansvariga för en omsättning på mer än $ 150 miljarder1. Däggdjursceller används nu i stor utsträckning för produktion av dessa farmaceutiska rekombinanta proteiner. Under innevarande period, bland de 68 godkända produkter som produceras av däggdjursceller, produceras 57 av kinesiska hamsteräggstockar (CHO)2. CHO-celler används specifikt för produktion av rekombinanta proteiner som kräver post-translationella modifieringar. Dessa celler är att föredra när de växer i en suspension och därmed möjliggöra reproducerbara resultat i ett serum fritt kemiskt definierat medium3,4. Den andra fördelen med att använda CHO-celler är att produktens glykanstruktur liknar den mänskliga monoklonala antikroppen (mAb) och resulterar i högre rekombinant proteinavkastning och specifik produktivitet på grund av genförstärkning5.
Avkastningen av rekombinant CHO (rCHO) cellkultur har ökat med hundra gånger under de senaste två decennierna. Denna förbättring tillskrivs optimering av processparametrar, utfodring strategi och utveckling av serum fritt kemiskt definierade medium6. Med de ökade kraven på läkemedelsprodukterna ökar trycket på kostnads- och tidseffektiviteten för utvecklingen av produktionsprocessen7. För att minska trycket samtidigt säkerställa produktkvalitet har omdirigerat fokus för läkemedelsindustrin på Kvalitet by Design (QbD). QbD används för att förstå såväl produktproduktionen som processen. Ett viktigt verktyg som används i ObD är Design of Experiment (DOE). Det bidrar till att öka förståelsen för processen genom att avslöja förhållandet mellan olika indatavariabler och resulterande utdata. Att tillämpa DOE-metoden för att optimera bioprocess är fördelaktigt under de tidiga stadierna av projektet när det gäller att tillgodogöra sig processförhållandena och öka titerkvantiteten och kvaliteten. Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt jämfört med den gammaldags strategin: en faktor-i-taget (OFAT). De statistiska metoderna för att göra med klassisk, Shainin eller Taguchi är vida överlägsen OFAT8.
Processen och medieoptimering kan utföras i skaka flaskor. Kolvarna är relativt billiga. Det är dock inte möjligt att kontrollera parametrar som temperatur, pH och upplöst syre (DO). För att övervinna dessa nackdelar kan multiuse bänk-top bioreaktorer från arbetsvolym på 0,5 L till 5 L användas. Reaktorerna ger en omfattande on-line övervakning och processkontroll. Användningen av multiusende bioreaktorn är dock tids- och arbetsintensiv. För att komma till rätta med dessa nackdelar används en ny bioreaktor för engångsbruk som kombinerar den omfattande processen att övervaka bioreaktorn med bänkskiva och enkel hantering av skakkolven. Screeningsystemet för hög genomströmning och teknik för engångsbruk har bidragit till att effektivisera processprestanda och utveckling9.
I den här artikeln listas riktlinjerna för att läsa in receptet i den automatiserade programvaran micro-bioreactor (AMBR). Påverkan av olika omrörningshastigheter och pH på den livsdugliga cellkoncentrationen (VCC) och titer studeras under detta experiment. Det experimentella resultatet och analysen utförs med design av experimentprogramvara MODDE 12. Produktanalysen utförs i ett HPLC-system (High Pressure Liquid Chromatography) med en Protein A-kolonn. Den bygger på principen att Fc-regionen i mAb binder till protein A med hög affinitet10,11. Med denna metod är det möjligt att identifiera och kvantifiera mAb. Kvantifieringen utförs över de uppmätta eluionstoppområdena på 280 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Odlingsförfarande
OBS: Rekombinanta CHO DG44 celler med en livskraftig cellkoncentration på 1 x 107 celler/ml används för detta protokoll.
- Tina flaskan som innehåller 1,2 ml celler till rumstemperatur och överför omedelbart cellupphängningen till ett koniskt centrifugrör på 15 ml som innehåller 10 ml kallfederium.
- Centrifugera det koniska centrifugröret i 5 minuter vid 190 x g och rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Förvärm 150 ml av frömediet i en 500 ml skakakolv till 36,8 °C.
- Försiktigt återsuspend cellpellet i 10 ml förvärmt frö medium och överföra cellerna i skaka kolven.
- Använd 1 ml av provet från kolven för att mäta den ursprungliga VCC och livskraften med hjälp av en cellräknare.
OBS: Lönsamheten bör vara över 70% efter upptining för framgångsrik odling. - Inkubera skakkolven i en omloppsbanor (skakdiameter på 19 mm) vid 36,8 °C och 7,5 % CO2 med en skakningshastighet på 120 varv/min.
OBS: Dessa förhållanden varierar beroende på cellstam och medium. - Tre dagar efter att cellerna har godkänts, ta bort skakkolven från skakapparaten och placera den under det laminära flödesskåpet. Ta 1 ml prov för att mäta den slutliga cellkoncentrationen. Beräkna den volym som ska överföras till färskt förvärmt frömedium så att den ursprungliga cellkoncentrationen i den nya passagen är 2 x 105 celler/ml.
- Passage cellerna 5 gånger totalt innan du överför till bioreaktorn för huvudodlingen.
2. Huvudsaklig odling
- Mät den slutliga cellkoncentrationen av förkulturen. Beräkna den volym som ska överföras till bioreaktorn så att den ursprungliga cellkoncentrationen i reaktorn är 3 x 105 celler/ml.
- Fyll reaktorn med produktionsmedium en dag före inokulering för att balansera reaktorn och ställa in processparametrar som temperatur, pH och DO.
OBS: Odlingsförhållandena är 36,8 °C och 60% upplöst syrekoncentration (DO). Vi testade omrörningshastigheter på 1050 rpm och 1300 rpm tillsammans med pH på 6,9, 7,1 och 7,3. Den totala varaktigheten av odlingen är 12 dagar tills cellerna skördas. Batchprocessen pågår i 72 timmar varefter matningsmediet tillsätts var 24:e timme. Det protokoll som ska användas för odlingen visas i detalj i nästa segment.
3. Skriva receptet i automated micro-bioreactor Software
OBS: Det finns två sätt att skriva ett recept i AMBR cell kultur programvara: det skapas antingen med hjälp av en guide eller genom att lägga till varje steg manuellt. I det här protokollet visas steg med guiden.
- Skapa ett nytt experiment
- Öppna AMBR cell kultur programvara och i fliken Introduktion klicka på Skapa nytt experiment.
- Laddar receptet
- På fliken Nytt experiment anger du namnet på experimentet tillsammans med det datum då det ska utföras.
- Aktivera kontrollpunkten för odlingsstationen och de fartyg som ska användas under odlingen. Auto Lägg DOE Taggar kommer också att aktiveras för en enkel övergång under programmering av DOE experiment. Klicka på Nästa för att växla till nästa flik.
- Ange information om tillsats av media i kärlet tillsammans med antifoam, inokulat, foder och glukos.
- Aktivera kontrollpunkten Lägg till medieplatta. Definiera plattans typ, namn och placering av plattan som innehåller mediet.
VARNING: Beroende på typ av platta och om plattan innehåller ett lock, aktivera kontrollen Är lidded för att säkerställa att vätskehandtaget fungerar smidigt - Klicka på Lägg till media till fartyg. Ange volymen på det medium som ska läggas till i kärlen. Definiera mappningen av överföringen av mediet från plattan till kärlen. Klicka på Nästa för att växla till nästa flik.
- Aktivera kontrollpunkten Lägg till medieplatta. Definiera plattans typ, namn och placering av plattan som innehåller mediet.
- Ställ in odlingsförhållandena i reaktorn.
- När medieinformationen har matats in i programvaran, tilldela odlingsvillkoren. Klicka på Condition Media och fyll i temperatur, mål DO, övre pH-gräns och omrörning RPM (Upp omrörning eller Ned omrörning).
- Sätt tillsats av inokulat i kärlen.
- Aktivera Lägg till cellplatta. Definiera skylttyp, namn och placering av plattan som innehåller mediet.
- Klicka på Lägg till celler i fartyg. Ange tidpunkten för inokulering och volymen på det medium som ska läggas till i fartygen.
- Definiera den väg som den flytande hanteraren färdas till överföringen av cellen från plattan till kärlen. Klicka på Nästa för att växla till nästa flik.
OBS: Se till att pipettspetsarna inaktiveras för att undvika korskontaminering och felaktig initial livsduglig cellkoncentration.
- Ställ in tillsats av foder, glukos och antifoam.
OBS: Förfarandet för tillsats av foder, glukos och antifoam liknar varandra. Av hänsyn till detta protokoll anges proceduren för "Feed". Detta kan replikeras för glukos och antifoam.- Aktivera lägg till matningsplatta och definiera plåttyp, namn och plats. Klicka på Lägg till matning till fartyg och ange volymen på det foder som ska läggas till fartygen. Definiera kartläggningen av överföringen av matningen från plattan till kärlen.
- Beroende på odling, lägg till antalet fodertillsats. För denna odling matas reaktorn efter 72 timmar för varje 24 timmar.
- Lägg manuellt till tidsfördröjningen mellan matningen genom att mata in data i Fördröjning från celler som lagts till. Den första dagen av utfodring är efter 72 timmars inokulering och nästa är efter 96 timmar och så vidare.
OBS: Antifoam tillägg är programmerad att läggas till varje dag för att undvika skumbildning under odlingen.
- Ställ in provtagning under odlingen.
- Aktivera lägg till provplatta och definiera plåttyp, namn och plats.
- Kontrollera Ta prov från fartyg och ange volymen på det prov som skall avlägsnas från kärlen. Definiera kartläggningen av överföringen av provet från kärlen till plattan. Se till att volymen inte minskar under 10 ml under hela odlingsförloppet.
- Lägg till antalet prover som ska tas under odlingen. I likhet med utfodring, tillsätt tiden för provet som tas bort från fartyget för varje ingångsprovpunkt.
- Spara processen. Den är nu klar för avrättning.
OBS: Om du vill säkerställa att protokollet fungerar smidigt växlar du till fliken Processsteg i AMBR-cellkulturens programvara och väljer vyn Processsteg för att visualisera flödet av receptet.
- På fliken Nytt experiment anger du namnet på experimentet tillsammans med det datum då det ska utföras.
- Design av experiment i den automatiserade mikrobioreaktorn
- För att köra BIOREAKTORNS DOE-programvara, se till att receptet i huvudprogramvaran sparas och är klart att användas.
- Öppna AMBR 15 DOE programvara och klicka på Utredning och välj Ny.
- Ange namnet på den nya DOE-undersökningen i dialogrutan Skapa undersökning.
- För att tilldela ett experiment till DOE undersökningen, öppna receptet som skapats för att studera de olika parametrarna. Klicka på Bläddra och välj respektive experiment.
- Definiera DOE-faktorn.
- Fartygstaggarna är redan skrivna i kolumnen. Om du vill definiera önskad DOE-faktor markerar du parametern och klickar på kolumnen DOE-faktorn. Välj Ny och lägg till enheterna, förkortningen, den nedre och övre gränsen för faktorerna (t.ex. temperatur, DO, pH).
- Definiera svarsfaktorn.
- När DOE-faktorerna har definierats definierar du det svar baserat på vilket den experimentella analysen skulle struktureras.
- På fliken Svar definierar du de värden som ska beaktas för analys av data.
- Klicka på Redigera DOE-svar och definiera namnet på svaret, förkortningen, enheterna, minimi- och maximigränserna (t.ex. titer, livsduglig cellkoncentration).
- När svaren har definierats väljer du AMBR-variabeln för varje svar och definierar variabeln. Ett svar kan automatiskt associeras med en mikrobioreaktorvariabel, Välj önskad variabel i listrutan.
- Ändra ekvationen för var och en av svaren beroende på behovet. Valet står mellan minimi-, max-, första-, sista- och genomsnittsdata.
- Skapa en design.
- Använd guiden Starta design för att välja typ av experimentell design för att lägga till eller ta bort antalet replikerade och mittpunkter.
- Välj målet, som avgör valet av mönster och modeller:
Screening: Använder linjära och interaktionsmodeller för att hitta de viktiga faktorerna
Optimering (RSM), Använder kvadratiska och kubiska modeller för detaljerad modellering och optimering
Delat mål: Modeller för formulerings- och processfaktorer kan väljas separat - När målet har beslutats väljer du modellen och designen tillsammans med antalet mittpunkter och replikerar.
- Klicka på Slutför och växla till nästa flik.
- Definiera experimentet.
OBS: DOE-faktorerna listas i den högra kolumnen i programvaran. Vid val av önskade faktorer markeras de fartyg som körs som experimenterar med den önskade parametern. Fartygen inom kulturstationen kan flyttas runt genom att högerklicka på fartyget och flytta den till önskad plats.- Skapa arbetspaket som kan importeras i AMBR-cellodlingsprogrammet. Beroende på antalet experiment skapas och lagras de olika arbetspaketen för vidare implementering
- Körning av experimentet i arbetspaketen som skapats på den bärbara datorn för AMBR-kontroll
- På fliken Experiment klickar du på Skapa DOE-experiment och bläddrar efter arbetspaketet som skapats med DOE-programvaran.
- Initiera processen genom att klicka på Start.
- Analys av experimentella resultat
- När experimentet har utförts exporterar du data med hjälp av Export DOE-resultat. Fönstret Export DOE Resultat öppnas och raderna som anger kulturfartyg och station visas i tabellen.
- Markera önskade rader och klicka på Exporterade valda rader eller Exportera experimentella data för att lagra alla resultat och spara filen för vidare analys.
- Importera data till AMBR DOE-modulen genom att växla till fliken Resultat och välja Importera resultat.
- Bläddra efter önskad datafil och klicka på analysresultaten.
- Analysera resultaten ytterligare i MODDE.
4. Utförande av odling i den automatiserade mikrobioreaktorn
OBS: Följande steg utförs av användaren med hjälp av protokollet skrivet i ovannämnda programvara. Stegen utförs av användaren om inte annat anges.
- Lastning av fartyg
- Öppna gammasteriliserade kulturkärl under ett laminärt flödesskåp och orientera i kulturstationen enligt figur 2.
- Rengör klämplattan med 70% etanol och dubbeldestillerat vatten. Sedan autoklav plattan och placera ovanpå fartyget.
- Montera klämplattan med en omrörningsplatta, se till att varje stift sitter fast ordentligt.
- Dra åt både omrörningsplattan och klämplattan på omrörningsenheten.
- Köra mikrobioreaktorprogramvaran
- Använd programmet skrivet i avsnitt 3 för att köra odlingen.
- Visualisera de processsteg som schemalagts eller slutförts på fliken Process. Ändra odlingsstegen under processens körning efter behov genom att först pausa vätskehanteraren och sedan redigera processreceptet.
- Tillsätt antifoam till kärlen innan omröraren startas för att säkerställa att det inte finns någon överdriven skumbildning under odlingen. Den antifoam kommer att läggas regelbundet, och skummet upptäcks visuellt.
- Tillsats av media i fartyget
- Fyll den 24-brunnsplatta som är försedd med mikrobioreaktorerna manuellt med sterila medier och placera den i systemets särskilda däck. Se till att plattan är placerad i det däck som det skriftliga programmet (avsnitt 3). Fartygets fyllning skall ske enligt punkt 3.2.2.
OBS: Temperaturen och omröraren startar omedelbart efter tillsats av media och antifoam. Sensorläsaren aktiveras 1 timme efter att kärlet är fyllt (startövervakaren). Gasningen till varje kärl påbörjas när läsaren har aktiverats. Media lämnas att balansera i minst 6 timmar före pH-omkalibrering och inokulering. Processparametrarna kan ändras i programvaran enligt avsnitt 3.2.3.
- Fyll den 24-brunnsplatta som är försedd med mikrobioreaktorerna manuellt med sterila medier och placera den i systemets särskilda däck. Se till att plattan är placerad i det däck som det skriftliga programmet (avsnitt 3). Fartygets fyllning skall ske enligt punkt 3.2.2.
- Inympning
- Mät den livsdugliga cellkoncentrationen efter den5:e passagen. Beräkna antalet celler som ska överföras till kärlen för att säkerställa att den ursprungliga cellkoncentrationen i alla kärl är 3 x 105 celler/ml.
- Överför cellerna till en 24 djup brunnsplatta så att suspensionens volym är minst 1,6 gånger den volym som krävs. För en erforderlig volym på 2 ml inokulat, överför 3,2 ml cellfjädring till varje brunn i plattan.
- Placera 24 brunnsplattan i det angivna däcket. Fartygen skall vaccineras enligt punkt 3.2.4.
- Daglig provtagning och analys
- Ta bort ett 460 μL prov från kärlen varje dag med hjälp av vätskehanteraren. Späd 200 μL av provet med 800 μL filtrerad 1x PBS-buffert (5x utspädning) och placera sedan i cellräknaren.
- Centrifugera det återstående provet i 5 min vid 190 x g och rumstemperatur och förvara supernatanten för vidare analys (glukos, laktat, glutamin och glutamat).
- Frys 100 μl av supernatanten vid -20 °C fram till slutet av odlingen för proteinkvantifiering.
- Slutet av odlingen
- När processparameterkontrollen (dvs. temperatur, agitation, pH och DO) har avslutats, stoppa övervakningen av processen.
- Skruva loss omrörningsplattan och klämplattan.
- Ta bort kulturfartygen och rengör kulturstationerna. Placera torkplattorna på kulturstationerna och skruva fast dem.
- Under tiden rengör klämplattorna noggrant med 70% etanol och dubbelt destillerat vatten.
- Klicka på Stopp i bioreaktorprogramvaran när torkcykeln är klar.
- Cellodlingsskörd
- Skörda celler dag 12 av odlingen genom att manuellt avlägsna innehållet i kärlen i 50 ml centrifugrör. Centrifugera cellbuljongen vid 190 x g i 30 min.
- Kasta cellpelleten och förvara supernatanten vid -20 °C.
5. Mätning mAb Koncentration
- Använd en 1,7 ml Protein A-kolonn för kvantifiering av proteinet under odlingskörningen.
-
Förbered ekvilibrations- och elueringsbufferten innan proverna tinas upp.
- Använd en lösning på 0,5 M Na2HPO4 som innehåller 0,5 M NaCl med ett pH-värdet på 7,9 som ekvilibrationsbuffert och en lösning på 100 mM glycin som innehåller 0,5 M NaCl med ett pH-kol på 2 som elueringsbuffert.
- Filtrera båda buffertarna genom ett 0,2 μm membran och avgas innan de placeras för analysen.
- Rensa det högpresterande vätskekromatografisystemet (HPLC) med nyberedd ekvilibrationsbuffert.
- Ladda proteinet A-kolonnen på HPLC-systemet.
- Utför kromatografi med ett flöde på 1 ml/min. Ställ in kolonnugnstemperaturen vid 30 °C och autosamplertemperatur vid 10 °C
- Tina upp de frysta proverna i rumstemperatur och filtrera 225 μL av varje prov genom ett 0,22 μm PVDF-membran. Späd proverna med högre koncentration av det önskade proteinet är i ett 1:20-förhållande med jämviktsbuffert och filtrera genom membranet innan de placeras i autosampler.
- Placera exemplen i autosamplern. Ladda metod och sekvens i programvaran och starta sekvensen.
OBS: Metoden består av tre faser (se figur 1): injektion av provet i kolonnen under de första två minuterna. följt av elueringsbuffert i 8 min och kolonnregenerering med jämviktsbuffert i 10 min.
Figur 1: Protein A-kromatogram, som representerar de olika faserna under en enda körning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt över den odling som utförs i denna studie presenteras i figur 2.
Figur 2: Schematisk representation av försöksförhållandena för att testa pH- och omrörningshastighetsprofiler i kulturstationerna. Figuren representerar också rätt layout för att placera fartygen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Celltillväxten hos de automatiserade mikrobioreaktorerna är jämförbar med bioreaktorerna för flera användningsområden. Detta avbildas i figur 3. Cellkoncentrationen från de tre olika skalorna jämförs och det observeras att den 15 ml-automatiserade mikrobioreaktorn härmar bioreaktorn på 2 L glas. Resultaten från shake-kolven jämförs också med fördelen med AMBR.
Figur 3: Jämförelse av den livsdugliga cellkoncentrationen i olika skalor. 15 ml mikrobioreaktor, 150 ml skakkolv och 2 L multi-use glasbioreaktor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Påverkan av olika omrörningshastighet och pH studeras i de automatiserade mikrobioreaktorerna. Livskraftig cellkoncentration (VCC) är en av de viktigaste parametrarna för att jämföra odlingen. Figur 4 representerar jämförelsen av VCC-koncentrationen och den monoklonala antikroppskoncentrationen hos de olika mikrobioreaktorerna. Figur 5 representerar responskonturområdet för de två svar som beaktas för jämförelsen, nämligen VCC- och mAb-koncentrationen. Värdena är jämförbara i kärlen med samma pH och olika omrörningshastighet, vilket indikerar att den omrörningshastighet som valts för denna process inte har någon betydande inverkan på processutgången. För framtida odlingar skulle omrörningshastigheten på 1050 varv/min användas för att undvika skumbildning.
PH har dock en iögonfallande inverkan på processutdata. Den negativa påverkan av pH 6.9 på VCC kan observeras i figur 4A. Tillväxten av cellerna förbättrades avsevärt under kulturen vid pH 7,3 jämfört med pH 7.1. I figur 5Bjämförs de monoklonala antikroppskoncentrationen i de olika odlingarna. Produktionen av mAb är långsammare i de fartyg som hålls vid pH 7.3; Koncentrationen av slutprodukten är dock jämförbar med det kärl som hålls vid pH 7.1.
Figur 4: Resultat av DOE-experimentet. a)Livskraftig cellkoncentrationsprofil för odlingen för att studera pH-värdets och omrörarhastigheten(B)Monoklonal antikroppskoncentrationsprofil över den utfodrade satsprocessen under respektive odlingsförhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Responskonturområde som anger pH-värdets och omrörarnas hastighets inverkan på den maximala livsdugliga cellkoncentrationen respektive monoklonal antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En av fördelarna med att använda AMBR är kontinuerlig övervakning och kontroll av odlingen. Övervakningen av pH-värdet kan observeras i figur 6. PH-värdet styrs vid börpunkten med CO2. Bolusmatningen från dag 3 är ansvarig för spiken i värdena.
Figur 6: pH-övervakning i de automatiserade mikrobioreaktorerna för odling, med börspunkter på pH 6.9, 7.1 och 7.3 och en omrörningshastighet på 1050 varv/min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De processparametrar som användes för framtida tester begränsades till en omrörningshastighet på 1050 varv/min och pH-värdet på 7,1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimering av processen för att öka avkastningen är av avgörande betydelse i den biofarmaceutiska industrin. Skakkolvar skulle kunna användas för att avskärma stammen. Övervakningen av processparametrarna, såsom pH och DO, är dock inte tillgänglig i kolvarna. Mikrobioreaktorerna har en fördel eftersom de möjliggör kontinuerlig övervakning och kontroll av processen. Dessa kontrollslingor i mikrobioreaktorn ger också ett tillstånd som liknar dem i större skala och därmed ger resultat som är jämförbara med de större bioreaktorerna. En annan fördel med mikrobioreaktorn är det breda utbudet av förhållanden som kan testas inom samma tidsram och till en lägre kostnad jämfört med bänkskivan bioreaktorer i form av tid och arbete12,13 . Den mindre storleken är också fördelaktig när det gäller lägre driftskostnader på grund av den minskade mängden substrat och minskat utrymmeskrav för parallella operationer. Kostnaden för fartygen måste dock anses, eftersom det kan vara dyrare att driva en odling i mikrobioreaktorerna för engångsbruk jämfört med bioreaktorn med bänkskiva med flera användningsområden.
Även om det finns flera fördelar med systemet, det finns några betydande nackdelar med att använda mikro-bioreaktorer. Det är möjligt att ändra pH och DO för varje fartyg inom en kulturstation. omrörningshastigheten och temperaturen kan dock inte ändras för ett enskilt kärl. Detta ökar antalet experiment som utförs för att fastställa den optimala omrörningshastighet och temperatur. Onlinemätningarna är begränsade till pH och DO. Övervakning av de kritiska processparametrarna (CPP), såsom temperatur, pH, DO, skulle vara fördelaktigt för att undvika fördröjningen mellan provtagning och analys. Det har potential att vara ett användbart verktyg för att optimeraproduktiviteten 14. Utveckling inom området spektroskopiska mätningar hos mikrobioreaktorer kan visa sig vara till nytta i de framtida modellerna.
Fördelarna överväger nackdelarna med att använda den automatiserade mikrobioreaktorn. Det finns dock några kriterier som bör beaktas när du använder dessa system. Först och främst är utformningen av skriptet för att framgångsrikt köra odlingen. Det är av avgörande betydelse att manuset som skrivs inkluderar alla avgörande steg såsom definition av plattorna tillsammans med korrekt kartläggning av plattan och kärl. Alla parametrar måste kontrolleras innan experimentet startas. Se till att inga processsteg är schemalagda att ske samtidigt. Detta kommer att resultera i att arbetsstationen väljer ett steg över det andra.
Ett annat viktigt kriterium att fokusera på är användningen av klämplattorna. Plattorna är autoklaverade före varje odling; detta kan leda till skador på O-ringarna. Kontrollera O-ringarna visuellt innan du autoklaverar. Felaktiga O-ringar kan resultera i oväntade variationer i DO- och pH-kontrollen. Den andra faktorn för felaktiga avläsningar kan vara en lös anslutning mellan klämplattan och kärlen. Se till att klämplattan och omrörningsplattorna sitter ordentligt fast i omrörningsenheten. Använd det åtdragningsverktyg som medföljer systemet.
Under odlingen är det viktigt att visuellt övervaka skummet. Minst 20 μl antifoam krävs i början av odlingen. Skumbildning kommer att resultera i vätska som finns i tråg av klämplattan. Överskott av skummet i klämplattan kommer att leda till spill, vilket leder till att skummet samlas in längst ner på kulturstationen, skymmer pH och DO fläckar som ska läsas av sensorn.
En annan viktig faktor att fokusera på är användningen av DOE programvara. Den integrerade DOE-programvaran möjliggör snabb utformning av processen som innehåller relevanta villkor. Visualiseringen av de fartyg som används säkerställer att ingen faktor har förbisetts. En av fördelarna med DOE-analys är att experimenten kan konfigureras via arbetspaket, vilket konfigurerar varje bioreaktor med definierade bioprocessingparametrar. Alla data som genereras analyseras med MODDE. Programvaran hanterar den stora mängden data som genereras under experimentet. En generaliserad delmängd design setup genererar en sekvens av minskad design uppsättning, därmed lösa problemet med multivariat kalibrering.
Ett detaljerat förfarande för att köra en design av experiment i en automatiserad mikro-bioreaktor visas i den här artikeln. Protokollet har utformats för att fokusera på matningsbatchen. DOE-programvaran har med hjälp av att fastställa optimala processparametrar för att öka biomassan och titerkoncentrationen. Odlingsdata jämfördes också med ett experiment som utfördes i en shakekolv och en 2 L bänkskiva bioreaktor. Resultaten visar reproducerbarhet och skalbarhet av processen. Målet med protokollet var att demonstrera användningen av automatiserade mikrobioreaktorer i en fodersatsprocess och att analysera bioprocessparametrarna med hjälp av DOE-programvaran. Slutsatsen kan dras att de automatiserade mikrobioreaktorerna är användbara för processutvecklingen och att dessa kan utvidgas till ett halvfusionssystem15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), det federala ministeriet för utbildning och forskning, Tyskland, och BioProcessing team av Sartorius Stedim Biotech GmbH, Tyskland, för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G.
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al.
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
