卡诺哈布迪蒂斯 伊利根斯新蛋白合成率评估
Summary
在这里，我们介绍和描述一种非放射性和非侵入性的方法，以评估体内的去新蛋白合成，利用线虫 卡诺 哈布迪炎和荧光漂白后恢复（FRAP）。该方法可与遗传和/或药理学屏幕相结合，识别蛋白质合成的新调制器。
Abstract
保持健康的蛋白质组对细胞和有机体平衡至关重要。蛋白质转化控制和降解之间的平衡的扰动引发了许多与年龄相关的疾病。蛋白位虫质量控制机制的减少是老龄化的一个标志。检测新蛋白合成的生化方法仍然有限，有几个缺点，不能在活细胞或动物中进行。 卡诺哈布迪蒂斯，透明 和容易转基因，是一个极好的模型，以监测蛋白质合成率使用成像技术。在这里，我们介绍并描述了一种利用光漂白后荧光回收（FRAP）测量体内新蛋白合成的方法。在特定细胞或组织中表达荧光蛋白的转基因动物被强大的光源照射，从而产生荧光光漂白。反过来，荧光恢复的评估意味着新的蛋白质合成在细胞和/或组织感兴趣。因此，将转基因线虫、遗传和/或药理干预与蛋白质合成率的活成像相结合，可以揭示调解年龄依赖性蛋白酶崩溃的机制。
Introduction
蛋白质的合成和降解对于有机体平衡至关重要。许多与年龄相关的疾病是由有缺陷的蛋白质生产1，2,引起的。为了测量全球蛋白质的转化率，有生化技术，如核糖体分析，其中包括核糖体保护mRNA片段的深度测序，以监测表达以及新的蛋白质合成3。这种方法除了间接读出转化率外，因为增加RNA与核糖体的关联并不一定意味着翻译增加，因此具有技术缺点，例如成本高和大量起始材料的需求。另一方面，基于蛋白质组学的方法允许通过脉冲代谢分析直接蛋白质定量，然后进行质谱分析4，5。,5然而，这是一种半定量方法，具有有限的时间分辨率，在体内不容易使用。此外，蛋白质的标签可以在感兴趣的动物/组织中不均匀分布。重要的是，这两种方法可以分别隐藏整个动物或组织中蛋白质转化率的组织特异性或细胞特异性变异。
卡诺哈布迪蒂斯埃利 根是一种易于使用的模型生物体，可以大量生长6。此外，其遗传的适用性和透明度允许在体内进行活成像。该协议描述了光漂白（FRAP）后使用荧光回收检测蛋白质合成率的方法。我们利用荧光蛋白的转基因表达，无论是整个生物体还是特定的组织/细胞。转基因动物可以使用基因的启动子表达GP，该基因被广泛/全球表达，或者使用组织特异性启动子来靶向特定细胞类型。此技术可以扩展到特定启动子，以检查特定蛋白质的蛋白质合成率。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛋白质合成调制对机体平衡至关重要。在衰老期间，全球和特定的蛋白质合成受到干扰。最近的研究表明，蛋白质转化平衡直接控制衰老和衰老不仅仅是衰老过程的副产品。特别是，真核启动因子4E（eIF4E）等翻译机制的核心成分，在翻译启动过程中促进mRNA封顶，从而降低依赖帽的蛋白质转化率，诱发氧化应激，加速衰老过程1。此外，神经元特异性EDC-3，它与mRNA处理体、P体相互…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢查尼奥塔基斯 M. 和库纳基斯 K. 的录像录制和编辑。K.P. 由希腊研究和创新基金会（HFRI）和研究与技术总秘书处（GSRT）提供赠款。N.T. 的资金来自欧洲研究理事会 （ERC – GA695190 – MANNA）、欧盟委员会框架方案和希腊教育部的赠款。
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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