Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans
Summary
Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.
Abstract
Het handhaven van een gezond proteoom is essentieel voor cel- en organismale homeostase. Verstoring van het evenwicht tussen eiwit translationele controle en afbraak veroorzaakt een veelheid van leeftijdsgebonden ziekten. De achteruitgang van de proteostasekwaliteitscontrolemechanismen is een kenmerk van veroudering. Biochemische methoden om de novo eiwitsynthese te detecteren zijn nog steeds beperkt, hebben verschillende nadelen en kunnen niet worden uitgevoerd in levende cellen of dieren. Caenorhabditis elegans, transparant en gemakkelijk genetisch gemodificeerd, is een uitstekend model om eiwitsynthese tarieven te controleren met behulp van beeldvormende technieken. Hier introduceren en beschrijven we een methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te meten met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Transgene dieren die fluorescerende eiwitten uitdrukken in specifieke cellen of weefsels worden bestraald door een krachtige lichtbron die resulteert in fluorescentie fotobleaching. Op zijn beurt betekent de beoordeling van fluorescentieherstel nieuwe eiwitsynthese in cellen en/of weefsels van belang. Vandaar dat de combinatie van transgene aaltjes, genetische en/of farmacologische interventies samen met live beeldvorming van eiwitsynthesesnelheden licht kan werpen op mechanismen die leeftijdsafhankelijke proteostaseinstorten.
Introduction
Eiwitsynthese en afbraak is essentieel voor organismale homeostase. Een veelheid van leeftijdsgebonden ziekten wordt aangespoord door gebrekkige eiwitproductie1,2. Om de wereldwijde eiwitvertalingssnelheden te meten, zijn er biochemische technieken zoals ribosomale profilering, waarbij diepe sequencing van ribosoom-beschermde mRNA-fragmenten wordt betrokken om expressie te monitoren, evenals nieuwe eiwitsynthese3. Deze methode, naast het feit dat een indirecte uitlezing van de translationele tarieven, zoals toegenomen RNA associatie met ribosomen betekent niet noodzakelijkerwijs meer vertaling, heeft technische nadelen, zoals hoge kosten en een eis van een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal. Anderzijds maken proteomics-gebaseerde methoden directe eiwitkwantificering mogelijk door metabole pulsprofilering, gevolgd door massaspectrometrieanalyse4,5. Dit is echter een semi-kwantitatieve benadering met beperkte temporele resolutie die niet gemakkelijk in vivo kan worden gebruikt. Bovendien kan de etikettering van het eiwit ongelijk worden verdeeld in het dier/weefsel van belang. Belangrijk is dat beide methoden weefselspecifieke of celspecifieke variaties in eiwitvertalingssnelheden in respectievelijk hele dieren of weefsels kunnen verbergen.
Caenorhabditis elegans is een gebruiksvriendelijk modelorganisme dat in grote aantallen kan worden geteeld6. Bovendien zorgen de genetische besneerbaarheid en transparantie voor live beeldvorming in vivo. Dit protocol beschrijft de methodologie om eiwitsynthesesnelheden te detecteren met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). We maken gebruik van de transgene expressie van fluorescerende eiwitten, hetzij in het hele organisme, hetzij in specifieke weefsels/ cellen. Transgene dieren kunnen GFP uitdrukken met behulp van de promotor van een gen, dat op grote schaal/wereldwijd wordt uitgedrukt, ofwel een weefselspecifieke promotor om specifieke celtypen aan te pakken. Deze techniek kan worden uitgebreid tot een specifieke promotor om eiwitsynthese tarieven van een specifiek eiwit te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eiwitsynthese modulatie is essentieel voor organismale homeostase. Tijdens de vergrijzing wordt zowel de wereldwijde als de specifieke eiwitsynthese verstoord. Recente studies tonen aan dat eiwitvertaalbalans senesescentie en veroudering direct controleert, is niet alleen een bijproduct van het verouderingsproces. In het bijzonder, kerncomponenten van de vertaalmachines zoals eukaryotische initiatiefactor 4E (eIF4E), die mRNA-aftopping tijdens de inleiding van de vertaling vergemakkelijkt, en dus de snelheid van cap-afha…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Chaniotakis M. en Kounakis K. voor het opnemen en bewerken van video’s. K.P. wordt gefinancierd met een subsidie van de Helleense Stichting voor Onderzoek en Innovatie (HFRI) en het Secretariaat-generaal voor Onderzoek en Technologie (GSRT). N.T. wordt gefinancierd door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC – GA695190 – MANNA), de kaderprogramma’s van de Europese Commissie en het Griekse ministerie van Onderwijs.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Génétique. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
