Avaliação das taxas de síntese de proteínas de novo em Caenorhabditis elegans
Summary
Aqui, introduzimos e descrevemos um método nãoradioativo e não invasivo para avaliar a síntese de proteína de novo in vivo, utilizando o nematode Caenorhabditis elegans e recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Este método pode ser combinado com telas genéticas e/ou farmacológicas para identificar novos moduladores da síntese proteica.
Abstract
Manter um proteome saudável é essencial para a homeostase celular e organismo. A perturbação do equilíbrio entre controle translacional de proteínas e degradação instiga uma infinidade de doenças relacionadas à idade. O declínio dos mecanismos de controle de qualidade da proteostase é uma marca do envelhecimento. Os métodos bioquímicos para detectar a síntese de proteínas de novo ainda são limitados, têm várias desvantagens e não podem ser realizados em células vivas ou animais. Caenorhabditis elegans, sendo transparente e facilmente geneticamente modificado, é um excelente modelo para monitorar as taxas de síntese proteica usando técnicas de imagem. Aqui, introduzimos e descrevemos um método para medir a síntese de proteína de novo in vivo utilizando a recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP). Animais transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em células ou tecidos específicos são irradiados por uma poderosa fonte de luz que resulta em fotobleaching de fluorescência. Por sua vez, a avaliação da recuperação da fluorescência significa nova síntese proteica em células e/ou tecidos de interesse. Assim, a combinação de nematoides transgênicos, intervenções genéticas e/ou farmacológicas, juntamente com imagens vivas das taxas de síntese proteica podem lançar luz sobre mecanismos que mediam o colapso da proteostase dependente da idade.
Introduction
A síntese e a degradação da proteína são essenciais para a homeostase do organismo. Uma infinidade de doenças relacionadas à idade são instigadas pela produção de proteína defeituosa1,,2. Para medir as taxas globais de tradução de proteínas, existem técnicas bioquímicas, como o perfil ribossômico, que envolve sequenciamento profundo de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomos para monitorar a expressão, bem como a nova síntese proteica3. Este método, além de ser uma leitura indireta das taxas translacionais, uma vez que o aumento da associação do RNA aos ribossomos não significa necessariamente aumento da tradução, tem desvantagens técnicas, como alto custo e exigência de uma grande quantidade de material inicial. Por outro lado, os métodos baseados em proteômica permitem quantificação direta da proteína por perfil metabólico de pulso seguido de análise de espectrometria de massa4,,5. No entanto, trata-se de uma abordagem semi-quantitativa com resolução temporal limitada que não pode ser facilmente utilizada in vivo. Além disso, a rotulagem da proteína pode ser desigualmente distribuída no animal/tecido de interesse. É importante ressaltar que ambos os métodos podem ocultar variações específicas de tecidos ou células nas taxas de tradução de proteínas em animais ou tecidos inteiros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans é um organismo modelo fácil de usar que pode ser cultivado em grande número6. Além disso, sua comodidade genética e transparência permitem imagens ao vivo in vivo. Este protocolo descreve a metodologia para detectar taxas de síntese proteica usando recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Aproveitamos a expressão transgênica de proteínas fluorescentes, seja em todo o organismo ou em tecidos/células específicas. Animais transgênicos podem expressar GFP usando o promotor de um gene, que é amplamente/globalmente expresso ou um promotor específico do tecido para atingir tipos de células específicas. Esta técnica pode ser estendida a um promotor específico para examinar as taxas de síntese proteica de uma proteína específica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A modulação da síntese proteica é essencial para a homeostase do organismo. Durante o envelhecimento, a síntese de proteínas globais e específicas é perturbada. Estudos recentes revelam que o equilíbrio da tradução proteica controla diretamente a senescência e o envelhecimento não é meramente um subproduto do processo de envelhecimento. Em particular, componentes centrais da máquina de tradução, como o fator de iniciação eucariótica 4E (eIF4E), que facilita o capping de mRNA durante a iniciação da t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Chaniotakis M. e Kounakis K. pela gravação e edição de vídeo. K.P. é financiado por uma bolsa da Fundação Helênica de Pesquisa e Inovação (HFRI) e da Secretaria Geral de Pesquisa e Tecnologia (GSRT). A N.T. é financiada por subvenções do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC – GA695190 – MANNA), dos Programas-Quadro da Comissão Europeia e do Ministério da Educação grego.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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