Évaluation des taux de synthèse des protéines de novo à Caenorhabditis elegans
Summary
Ici, nous introduisons et décrivons une méthode non radioactive et non invasive pour évaluer la synthèse de la protéine de novo in vivo, en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans et la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Cette méthode peut être combinée avec des écrans génétiques et/ou pharmacologiques pour identifier de nouveaux modulateurs de synthèse protéique.
Abstract
Le maintien d’un protéome sain est essentiel pour l’homéostasie cellulaire et organisationnelle. La perturbation de l’équilibre entre le contrôle translationnel des protéines et la dégradation provoque une multitude de maladies liées à l’âge. Le déclin des mécanismes de contrôle de la qualité de la protéostase est une caractéristique du vieillissement. Les méthodes biochimiques de détection de la synthèse des protéines de novo sont encore limitées, présentent plusieurs inconvénients et ne peuvent pas être effectuées dans des cellules vivantes ou des animaux. Caenorhabditis elegans, transparent et facilement génétiquement modifié, est un excellent modèle pour surveiller les taux de synthèse des protéines en utilisant des techniques d’imagerie. Ici, nous introduisons et décrivons une méthode pour mesurer la synthèse de la protéine de novo in vivo en utilisant la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Les animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules ou des tissus spécifiques sont irradiés par une source lumineuse puissante ayant pour résultat le photobleachage de fluorescence. À son tour, l’évaluation de la récupération de fluorescence signifie une nouvelle synthèse des protéines dans les cellules et/ou les tissus d’intérêt. Par conséquent, la combinaison de nématodes transgéniques, d’interventions génétiques et/ou pharmacologiques ainsi que d’imagerie vivante des taux de synthèse des protéines peut faire la lumière sur les mécanismes de médiation de l’effondrement de la protéostase dépendante de l’âge.
Introduction
La synthèse et la dégradation des protéines sont essentielles à l’homéostasie organisationnelle. Une multitude de maladies liées à l’âge sont provoquées par la production de protéinesdéfectueuses 1,2. Afin de mesurer les taux mondiaux de traduction des protéines, il existe des techniques biochimiques telles que le profilage ribosomal, qui implique le séquençage profond des fragments d’ARNm protégés par le ribosome pour surveiller l’expression ainsi que la synthèse des protéinesnouvelles 3. Cette méthode, en plus d’être une lecture indirecte des taux de traduction, comme l’association accrue de l’ARN aux ribosomes ne signifie pas nécessairement une traduction accrue, a des inconvénients techniques, tels que le coût élevé et une exigence d’une grande quantité de matériel de départ. D’autre part, les méthodes à base de protéomique permettent une quantification directe des protéines par le profilage métabolique des impulsions suivie d’une analyse de spectrométrie de masse4,5. Cependant, il s’agit d’une approche semi-quantitative avec une résolution temporelle limitée qui ne peut pas être facilement utilisée in vivo. En outre, l’étiquetage de la protéine peut être inégalement réparti dans l’animal/tissu d’intérêt. Fait important, ces deux méthodes peuvent dissimuler des variations spécifiques aux tissus ou des cellules dans les taux de traduction des protéines chez des animaux entiers ou des tissus, respectivement.
Caenorhabditis elegans est un organisme modèle facile à utiliser qui peut être cultivé en grand nombre6. En outre, son agrément génétique et sa transparence permettent l’imagerie vivante in vivo. Ce protocole décrit la méthodologie pour détecter les taux de synthèse des protéines à l’aide de la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Nous profitons de l’expression transgénique des protéines fluorescentes, soit dans l’organisme entier, soit dans des tissus/cellules spécifiques. Les animaux transgéniques peuvent soit exprimer le GFP en utilisant le promoteur d’un gène, qui est largement/globalement exprimé ou un promoteur spécifique aux tissus pour cibler des types de cellules spécifiques. Cette technique peut être étendue à un promoteur spécifique pour examiner les taux de synthèse des protéines d’une protéine spécifique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La modulation de synthèse protéique est essentielle à l’homéostasie organisationnelle. Pendant le vieillissement, la synthèse globale ainsi que spécifique des protéines est perturbée. Des études récentes révèlent que l’équilibre de traduction de protéine contrôle directement la sénescence et le vieillissement n’est pas simplement un sous-produit du processus de vieillissement. En particulier, les composants de base des machines de traduction tels que le facteur d’initiation eucaryote 4E (eIF4E), q…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Chaniotakis M. et Kounakis K. pour l’enregistrement vidéo et le montage. K.P. est financé par une subvention de la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (HFRI) et du Secrétariat général de la recherche et de la technologie (GSRT). N.T. est financé par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC – GA695190 – MANNA), des programmes-cadres de la Commission européenne et du ministère grec de l’Éducation.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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