カエノハブディティス・エレガンスにおけるデノボタンパク質合成率の評価
Summary
ここでは、光漂白後の線虫 カエノールハブディティス・エレガン スおよび蛍光回復(FRAP)を利用して、インビボでのデノボタンパク合成を評価するための非放射性および非侵襲的な方法を紹介し、説明する。この方法は、タンパク質合成の新しいモジュレーターを識別するために、遺伝的および/または薬理学的スクリーンと組み合わせることができます。
Abstract
細胞および体性恒常性に不可欠なタンパク質を維持することは、健康なプロテオームを維持する必要があります。タンパク質の翻訳対照と分解のバランスの摂動は、多くの年齢関連疾患を引き起こします。プロテオスタシスの品質管理機構の低下は老化の特徴である。デノボタンパク質合成を検出する生化学的方法は依然として限定的であり、いくつかの欠点を有し、生きた細胞または動物では行うことができない。 カエノハブディティス・エレガンスは、 透明で遺伝子組み換えが容易であり、イメージング技術を用いてタンパク質合成速度を監視する優れたモデルです。ここでは、光漂白後の蛍光回収(FRAP)を利用した生体内でのデノボタンパク質合成を測定する方法について紹介する。特定の細胞または組織で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物は、蛍光光化をもたらす強力な光源によって照射される。次に、蛍光回復の評価は、目的の細胞および/または組織における新しいタンパク質合成を意味します。したがって、遺伝子導入線種、遺伝的および/または薬理学的介入とタンパク質合成速度の生画像化の組み合わせは、年齢依存性プロテオスタシス崩壊を媒介するメカニズムに光を当てることができる。
Introduction
タンパク質合成と分解は、生体恒常性に不可欠です。多数の年齢関連疾患が、欠陥タンパク質産生11,22によって引き起こされている。世界的なタンパク質翻訳速度を測定するために、リボソームプロファイリングなどの生化学的手法があり、リボソーム保護されたmRNA断片の深いシーケンシングを伴い、発現をモニタリングし、新しいタンパク質合成3を監視する。この方法は、翻訳速度の間接読み出しであることに加え、リボソームへのRNA関連の増加は必ずしも翻訳の増加を意味するわけではないので、高コストおよび大量の出発材料の要件などの技術的な欠点を有する。一方、プロテオミクスベースの方法は、パルス代謝プロファイリングによる直接タンパク質定量を可能にし、続いて質量分析分析44、55を行う。しかし、これは、生体内で簡単に使用できない限られた時間分解能を持つ半定量的なアプローチです。さらに、タンパク質の標識は、対象の動物/組織に不均等に分布することができる。重要なことに、これらの方法は、それぞれ動物全体または組織におけるタンパク質翻訳速度における組織特異的または細胞特異的な変動を隠すことができる。
カエノハブディティス・エレガンス は、6個の数で成長させることができる使いやすいモデル生物です。さらに、その遺伝的異常性および透明性は、生体内での生画像化を可能にする。このプロトコルは、光漂白後の蛍光回復(FRAP)を用いてタンパク質合成速度を検出する方法論を説明する。私たちは、生物全体または特定の組織/細胞における蛍光タンパク質のトランスジェニック発現を利用します。トランスジェニック動物は、遺伝子のプロモーターを用いてGFPを発現するか、特定の細胞タイプを標的とする組織特異的プロモーターを発現させる。この技術は、特定のタンパク質のタンパク質合成速度を調べるために特定のプロモーターに拡張することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質合成変調は、生体恒常性に不可欠です。老化の間に, グローバルだけでなく、特定のタンパク質の合成が摂動されます。.最近の研究では、タンパク質翻訳バランスが老化と老化を直接制御することは、単なる老化過程の副産物ではないことが明らかになっている。特に、真核生物開始因子4E(eIF4E)のような翻訳機械のコア成分は、翻訳開始時にmRNAキャッピングを容易にし、したがっ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
チャニオタキス・Mとクナキス・Kのビデオ録画と編集に感謝します。K.P.は、ギリシャ研究イノベーション財団(HFRI)と研究技術総事務局(GSRT)からの助成金を受けています。N.T.は欧州研究評議会(ERC – GA695190 – MANNA)、欧州委員会枠組みプログラム、ギリシャ教育省からの助成金によって資金提供されています。
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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