Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가
Summary
여기서, 우리는 선충 표백 후 선충근 및 형광 회복을 활용하여 생체 내에서 드 노보 단백질 합성을 평가하는 비방사성 및 비침습적 방법을 소개하고 설명합니다(FRAP). 이 방법은 단백질 합성의 새로운 변조기를 확인하기 위하여 유전 및/또는 약리학 스크린과 결합될 수 있습니다.
Abstract
건강한 프로테아메를 유지하는 것은 세포와 유기체 항상성에 필수적입니다. 단백질 번역 제어와 저하 사이의 균형의 왜곡은 연령 관련 질병의 무리를 선동. 프로테오스타증 품질 관리 메커니즘의 감소는 노화의 특징입니다. 드 노보 단백질 합성을 검출하는 생화학적 방법은 여전히 제한되어 있으며, 몇 가지 단점이 있으며 살아있는 세포 나 동물에서 수행 할 수 없습니다. 투명하고 쉽게 유전자 변형되는 Caenorhabditis elegans는 이미징 기술을 사용하여 단백질 합성 속도를 모니터링하는 훌륭한 모델입니다. 여기서, 우리는 광표백 후 형광 회복을 이용한 생체 내 드 노보 단백질 합성을 측정하는 방법을 소개하고 설명한다(FRAP). 특정 세포 또는 조직에서 형광단백질을 발현하는 형질전환 동물은 광표백의 결과로 강력한 광원에 의해 조사된다. 차례로, 형광 회복의 평가는 관심의 세포 및/또는 조직에 있는 새로운 단백질 합성을 의미합니다. 따라서, 단백질 합성 비율의 살아있는 화상 진찰과 더불어 형질 전환선색선골, 유전 및/또는 약리학적 인 내정간섭의 조합은 나이 의존적인 proteostasis 붕괴를 중재하는 기계장치에 빛을 비출 수 있습니다.
Introduction
단백질 합성 및 분해는 유기체 항상성에 필수적입니다. 다양한 연령 관련 질병은 결함이 있는 단백질 생산1,,2에의해 선동된다. 글로벌 단백질 번역 율을 측정하기 위해, 리보솜 보호 mRNA 단편의 깊은 시퀀싱을 수반하는 리보솜 프로파일링과 같은 생화학적 기술이 있으며, 이는 새로운 단백질 합성3뿐만아니라 발현을 모니터링한다. 이 방법은, 번역 속도의 간접적인 판독이외에, 리보솜에 대한 증가된 RNA 협회가 반드시 증가된 번역을 의미하지 않기 때문에, 높은 비용 및 다량의 시작 물질의 요구 사항과 같은 기술적 단점이 있다. 한편, 프로테오믹스 기반 방법은 맥박 대사 프로파일링에 의한 직접 단백질 정량화를 허용한 후 질량 분석 분석4,,5. 그러나, 이것은 생체 내에서 쉽게 사용할 수 없는 제한된 시간적 해상도를 가진 반정적 접근법이다. 더욱이, 단백질의 라벨링은 관심있는 동물/조직에 불평등하게 분배될 수 있다. 중요하 군데, 이 두 가지 방법은 조직별 또는 세포별 변이를 전체 동물 또는 조직에서 각각 은폐할 수 있다.
Caenorhabditis elegans는 대량으로 재배 할 수있는 사용하기 쉬운 모델 유기체입니다6. 추가적으로, 그것의 유전 편의성과 투명성은 생체 내의 살아있는 화상 진찰을 허용합니다. 이 프로토콜은 광표백 후 형광 복구를 사용하여 단백질 합성 속도를 검출하는 방법론을 설명합니다(FRAP). 우리는 전체 유기체 또는 특정 조직/세포에서 형광 단백질의 형질전환 발현을 이용합니다. 형질전환 동물은 유전자의 프로모터를 사용하여 GFP를 발현할 수 있는데, 이는 광범위/전 세계적으로 표현되거나 특정 세포 유형을 표적으로 하는 조직 별 프로모터이다. 이 기술은 특정 단백질의 단백질 합성 비율을 검토하기 위하여 특정 프로모터로 확장될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 합성 변조는 유기체 항상성에 필수적입니다. 노화 하는 동안, 글로벌 뿐만 아니라 특정 단백질 합성 혼란. 최근 연구에 따르면 단백질 번역 균형이 노화와 노화를 직접 제어하는 것은 단순히 노화 과정의 부산물이 아니라는 사실을 보여줍니다. 특히, 진핵 개시인자 4E(eIF4E)와 같은 번역 기계류의 핵심 성분은 번역 개시 시 mRNA 캡핑을 용이하게 하고, 따라서 캡 의존성 단백질 번역의 속도를 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Génétique. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
