Summary
أنشأنا الظروف لثقافة الخلايا السلف العصبي من المنطقة دون البطينية و gyrus dentate من الدماغ الكبار من فولز، كدراسة تكميلية في المختبر، لتحليل الاختلافات التي تعتمد على الجنس بين المنافذ العصبية التي يمكن أن تكون جزءا من التغييرات البلاستيكية الوظيفية المرتبطة بالسلوكيات الاجتماعية.
Abstract
المغنطيس العصبي هي مجاميع الخلايا الأولية التي تضم الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف. هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد هي أداة ممتازة لتحديد التمايز واحتمالات الانتشار للخلايا الجذعية العصبية ، وكذلك لتوليد خطوط الخلايا مما يمكن أن يكون مقايسة مع مرور الوقت. أيضا، يمكن أن تخلق neurospheres مكانة (في المختبر) الذي يسمح نموس بيئة متغيرة ديناميكية، مثل عوامل النمو المختلفة، والهرمونات، والناقلات العصبية، من بين أمور أخرى. ميكروتوس ochrogaster (المرج فول) هو نموذج فريد لفهم الأساس العصبي البيولوجي للسلوكيات الاجتماعية والجنسية والإدراك الاجتماعي. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية المشاركة في هذه السلوكيات ليست معروفة جيدا. ويهدف البروتوكول إلى الحصول على خلايا السلف العصبي من محاريب عصبية من فول البراري الكبار، التي يتم استزراعها في ظل ظروف غير منسجمة، لتوليد الخلايا العصبية. يعتمد حجم وعدد الخلايا العصبية على المنطقة (المنطقة دون البطينية أو الجيروسكوبات) وجنس المرج. هذه الطريقة هي أداة رائعة لدراسة الاختلافات المعتمدة على الجنس في المنافذ العصبية في المختبر وتغيرات المرونة العصبية المرتبطة بالسلوكيات الاجتماعية مثل الترابط بين الزوجين والرعاية بين الوالدين. أيضا، يمكن فحص الظروف المعرفية التي تنطوي على العجز في التفاعلات الاجتماعية (اضطرابات طيف التوحد والفصام).
Introduction
و vole المرج(ميكروتوس ochrogaster)، وهو عضو في الأسرة Cricetidae ، هو الثدييات الصغيرة التي تتطور استراتيجية الحياة كنوع أحادية الزواج اجتماعيا ومؤنس للغاية. كل من الذكور والإناث إقامة علاقة الزوج دائم بعد التزاوج أو فترات طويلة من التعايش التي تتميز تقاسم العش، والدفاع عن أراضيهم، وعرض الرعاية بين الوالدين لذريتهم1،2،3،4. وهكذا، فإن المرج فول هو نموذج قيم لفهم الأساس العصبي البيولوجي للسلوك الاجتماعي والجنسي والعاهات في الإدراك الاجتماعي5.
النشوء العصبي للبالغين هي واحدة من العمليات الأكثر أهمية لللدونة العصبية التي تؤدي إلى تغييرات سلوكية. على سبيل المثال، ذكرت مجموعتنا البحثية في ذكور أن التعايش الاجتماعي مع التزاوج يزيد من انتشار الخلايا في المنطقة دون البطينية (VZ) والمنطقة دون الرعية في الجيروسكوب (DG) من قرن آمون، مما يشير إلى أن التكاثر العصبي للبالغين يمكن أن يلعب دورًا في تكوين الترابط الناجم عن التزاوج في البراري (البيانات غير المنشورة). من ناحية أخرى، على الرغم من أن مناطق الدماغ حيث يتم توليد الخلايا العصبية الجديدة ومتكاملة معروفة جيدا، والآليات الجزيئية والخلوية المشاركة في هذه العمليات لا تزال غير محددة بسبب العيوب التقنية في نموذج الدماغ كله6. على سبيل المثال، مسارات الإشارة التي تتحكم في التعبير الجيني والأنشطة الخلوية الأخرى لها فترة تنشيط قصيرة نسبيا (الكشف عن phosphoproteome)7. نموذج بديل واحد هو الخلايا الجذعية العصبية البالغة المعزولة والمزاجة أو الخلايا السلف لتوضيح المكونات الجزيئية المشاركة في تكوين الأعصاب للبالغين.
كان النهج الأول للحفاظ على السلائف العصبية في المختبر من الثدييات البالغة (الفأرة) الدماغ هو مقايسة من الخلايا العصبية ، والتي هي المجاميع الخلوية التي تنمو في ظل ظروف غير مطيعة التي تحافظ على إمكاناتها متعددة القدرات لتوليد الخلايا العصبية ، وكذلك الخلايا الفلكية8،9،10. خلال تطورها، وهناك عملية اختيار حيث السلائف فقط سوف تستجيب لميوجين مثل عامل النمو البشرة (EGF) وعامل النمو الليفي 2 (FGF2) لتكاثر وتوليد الخلايا العصبية8،9،10.
على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكول في الأدب للحصول على السلف العصبية الكبار من voles. هنا، أنشأنا ظروف الثقافة لعزل السلف العصبية من المنافذ العصبية وصيانة في المختبر من خلال فحص تشكيل الغلاف العصبي. وهكذا، يمكن تصميم التجارب لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تشارك في انتشار وهجرة وتمايز وبقاء الخلايا الجذعية العصبية وذرية، وهي عمليات لا تزال غير معروفة في المرج. وعلاوة على ذلك، يمكن توضيح الاختلافات في المختبر في خصائص الخلايا المستمدة من VZ وDG تقديم معلومات حول دور المنافذ العصبية في اللدونة العصبية المرتبطة بالتغيرات في السلوك الاجتماعي والجنسي والسلوكيات المعرفية، والعجز في التفاعلات الاجتماعية (اضطراب طيف التوحد والفصام)، والتي يمكن أن تكون أيضا تعتمد على الجنس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على الدراسة لجنة أخلاقيات البحوث التابعة لـ معهد علم الأعصاب، وجامعة المكسيك الوطنية المستقلة، والمكسيك، والمعهد الوطني للبيطن (2018-1-163). وقد أنشئت النهايات الإنجابية والرعاية والإنسانية للحيوانات وفقا للمعيار المكسيكي الرسمي (NOM-062-Z00-1999) القائم على "القانون العام لـ Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (القانون العام للصحة للبحوث الصحية) الذي وضعه الأمين المكسيكي للصحة.
1- الحلول وإعداد المخزونات
- إعداد متوسط ثقافة N2 مع 485 مل من Dulbecco معدلة النسر متوسط F12 (DMEM-F12), 5 مل من الملحق N2 (100x), 5 مل من الملحق الجلوتامين (100x) و 5 مل من مضاد للمضادات الحيوية (100x).
- إعداد ثقافة B27 المتوسطة مع 480 مل من المتوسط العصبي، 10 مل من ملحق B27 (50x)، 5 مل من الملحق الجلوتامين، و 5 مل من المضادات الحيوية المضادة للحمامي (100x).
- إعادة تكوين مسحوق الكولاجين في 1x PBS (الفوسفات المخزنة المالحة) للحصول على aliquots مع نشاط 100 وحدة / μL (1000x) وتخزينها في -20 درجة مئوية. إشعار، والنشاط collagenase يعتمد على عدد الكثير من الشركات.
- إعداد الأسهم dispase aliquots عن طريق حل 5 ملغ من مسحوق dispase في 1x PBS (50 ملغ / مل). يُخزن عند -20 درجة مئوية.
- إعداد محلول انزيمي مع 100 مل من DMEM-F12 المتوسطة، 50 ميكرولتر من الكولاجيناز المخزون (100 وحدة/ميكرولتر) أن يكون تركيز النهائي من 50 U/ مل و 333 μL من dispase الأسهم (50 ملغ / مل) أن يكون تركيز النهائي من 0.33 ملغ / مل.
- لإعداد محلول الغسيل، إلى 1000 مل من 1x PBS، إضافة 0.4766 غرام من HEPES (التركيز النهائي 2 mM)، 3.6 غرام من د-جلوكو (التركيز النهائي 20 مل م) و 2.1 غرام من NAHCO3 (التركيز النهائي 25 mM).
- إعداد بولي-L-ornithine الأسهم aliquots (1 ملغ / مل) باستخدام الماء المعقم وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد حل عمل من بولي-L-أورنيثين. تخفيف aliquot الأسهم (1mg / مل) في 49 مل من الماء المعقم لتركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل.
- إعداد حل العمل من اللامينين. تخفيف 25 ميكرولتر من اللامينين (1 ملغ / مل المخزون الأصلي) في 5 مل من الماء المعقم لتركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: بعد التحضير، قم بتصفية وسائل الإعلام الثقافية، وحلول العمل والأسهم لتجنب التلوث. استخدام محاقن أو زجاجة أعلى فراغ مرشحات (غشاء polyethersulfone مع حجم المسام 0.2 μm). يمكن تخزين وسائل الإعلام والثقافة وحلول العمل لمدة تصل إلى 30 يوما في 4 درجة مئوية، في حين يمكن تخزين المخزونات لمدة تصل إلى أربعة أشهر في -20 درجة مئوية.
2. التحضير قبل البدء في microdissection
- تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق autoclaving أو مع مع تعقيم الزجاج الساخن الخرز الجاف.
- تنظيف مساحة سطح microdissection في ظل ظروف مطهرة ومطهرة صارمة (على سبيل المثال، مع المياه ozonized).
ملاحظة: توقيت microdissection من كل من المنافذ العصبية من كل الدماغ فول هو ما يقرب من 30 دقيقة. ينصح العمل مع 1-4 الحيوانات لإجراء كامل.
3. استخراج الدماغ كله
- تخدير فول الكبار (12-16 أسبوعا) مع جرعة زائدة من pentobarbital (6.3 ملغ / حيوان) من خلال الحقن داخل الصفاق. تحقق من عمق التخدير عن طريق عدم وجود رد فعل دواسة ردا على قرصة إصبع القدم شركة.
- مرة واحدة vole هو تخدير تماما، والحث القتل الرحيم عن طريق قطع الرأس واستعادة الرأس.
- تشريح الجلد من الجمجمة مع مقص، مما يجعل شق السدية -مجرى (15 مم طويلة) لفضح الجمجمة.
- قطع العظام القذالي والبطني وتتبع شق في الجمجمة على طول الغرز القوس والجرايلي.
- جعل ثقب في الجمجمة عند تقاطع العظام الأمامية والضجيجة باستخدام مقص، مع الحرص الشديد على عدم تلف أنسجة الدماغ.
- لفضح الدماغ، وإزالة شظايا الجمجمة المتبقية التي تغطي نصفي الكرة الأرضية في الدماغ مع ملاقط حادة وأشار.
- استخدم ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ لرفع الدماغ بأكمله من قاعدة الجمجمة.
- جمع الدماغ في أنبوب الطرد المركزي (50 مل) مع 20 مل من محلول غسل الباردة.
- غسل الدماغ مرتين مع محلول غسل الباردة.
4. ميكروديستيكشن من الأنسجة العصبية
- ضع طبق بيتري على سطح محاط بالثلج.
- إيداع الدماغ على الطبق وإضافة 20 مل من محلول غسل الباردة.
- مع مشرط، في الطائرة التاجية، وتقسيم الدماغ إلى كتلتين من الأنسجة (روسترال وcaudal). كمرجع عصبي، تنفيذ قطع التاجية على مستوى Bregma في المحور الأمامي11 (الشكل 1A، خط صلب).
- من كتلة rostral، واستخراج VZ الأنسجة (الشكل 1B)، في حين من كتلة السد إزالة DG (الشكل 1C).
- تشريح VZ تحت مجهر ستيريو.
- مع ملقط دومون، عقد واحد من نصفي الكرة الأرضية. ثم، إدراج، في ذروة البطين، نصائح غرامة من ملقط Dumont الثانية تحت الأنسجة التي خطوط caudate-putamen (الشكل 2A).
- فتح ملقط على طول محور دورسوفينتورال لفصل الأنسجة.
- جمع VZ الأنسجة للفرد الواحد في أنبوب الطرد المركزي مع 2 مل من محلول غسل الباردة. لا تجمع نسيج أكثر من حيوانين.
- كرر microdissection في نصف الكرة الأرضية الأخرى.
- تخزين أنبوب يحتوي على أنسجة VZ الثنائية على الجليد ومواصلة تشريح DG.
- تشريح DG من كتلة caudal تحت مجهر ستيريو.
- مع مشرط، وجعل قطع التاجية في كتلة للحصول على شريحتين، والتي لوحظ تشكيل قرن آمون. كمعلم, يتم قطع في -2 مم Bregma إحداثيات في المحور الأمامي الأمامي وفقا لأطلس دماغ الماوس11 (الشكل 1A, خط منقط والشكل 1C).
- مع ملقط Dumont، عقد واحدة من شرائح، ومع غرامة نقطة دومون ملقط جعل قطع أفقي بين DG وCA1 ثم تنفيذ شق عمودي بين DG وCA3 لفصل DG (الشكل 2B).
- كرر التشريح في الشريحة الأولى من نصف الكرة الأرضية الآخر.
- كرر التشريح في نصفي الكرة الأرضية في الشريحة الثانية.
- جمع أربع قطع DG من كل فول في أنبوب الطرد المركزي. لا تجمع أنسجة DG لأكثر من حيوانين.
ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى تشريح أكثر من واحد، قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي مع أنسجة VZ أو DG على الجليد مع الاستمرار في تشريح بقية الأدمغة. إزالة جميع الأوعية الدموية التي تغطي أنسجة الدماغ أثناء تشريح. إذا لم يتم التخلص من الأوعية ، يمكن خلط الثقافة مع فائض من كريات الدم الحمراء وتشكيل الغلاف العصبي الانزعاج.
5. عزل الخلايا العصبية
- ضع أنابيب الطرد المركزي داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية وانتظر حوالي 10 دقائق لشظايا الأنسجة للترسب بالجاذبية.
- إزالة محلول غسل وإضافة 1 مل من محلول الأنزيمية الدافئة لكل أنبوب.
- احتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تفكيك شظايا الأنسجة؛ ماصة صعودا وهبوطا مع طرف 1 مل. لا الماصات أكثر من 30x.
- تنفيذ حضانة ثانية من 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- في نهاية الحضانة الثانية، ماصة لتفريق الأنسجة. لا الماصات أكثر من 30x.
ملاحظة: بعد الأنابيب، يجب أن تتفكك تماما شظايا الأنسجة؛ إذا لم يتم تفكيكها، احتضان لآخر 10 دقيقة في 37 درجة مئوية وإعادة ماصات. يجب أن لا تتجاوز فترة الهضم 30 دقيقة. - إضافة 9 مل من N2 المتوسطة في أنبوب لتخفيف العلاج الأنزيمية.
- الطرد المركزي الأنابيب في 200 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل افرا وغسل مع 10 مل من N2 المتوسطة.
- أجهزة الطرد المركزي في نفس الظروف التي كانت عليها الخطوة 5-8.
- إزالة افرنح من كل أنبوب وإعادة الكريات الخلية من VZ وDG في 2 مل و 1 مل من متوسطة B27، على التوالي.
- لإزالة أي أنسجة غير مفككة، قم بتصفية كل تعليق خلوي باستخدام مصفاة خلايا (مقاس 40 ميكرومتر).
6. تشكيل المغنطيس العصبي
- الثقافة مرت الخلايا من خلال مصفاة في مرفق منخفضة جدا، لوحة 24-جيدا. استخدام اثنين من الآبار لVZ وبُرّة واحدة لـ DG (1 مل من B27 متوسطة / بئر).
- إضافة 20 نانوغرام/مل من FGF2 و 20 نانوغرام/مل من EGF إلى كل بئر (التركيز النهائي 1x).
- احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 والرطوبة العالية (90-95٪). لا تزعج لمدة 48 ساعة (اليوم 1 واليوم 2 من الثقافة، D1-D2).
- في اليوم الثالث (D3)، إزالة نصف المتوسط الثقافة واستبدالها بـ B27 المتوسطة الطازجة (500 ميكرولتر في البئر) تستكمل مع تركيز مزدوج (2x) من عوامل النمو.
- كرر كل يوم ثالث، وتغيير الوسط الثقافة (نصفه) واستبدالها مع متوسطة B27 جديدة تكملها مع تركيز مزدوج (2x) من عوامل النمو.
- في الأيام التي لا يكون فيها من الضروري تغيير الوسط الثقافي، أضف عوامل نمو إلى تركيز نهائي قدره 1x.
- تأكد من تشكيل الـ neurospheres حول D8-D10.
- في D10، قم بتغيير الوسيلة الكاملة للثقافة لإزالة جميع الحطام.
- جمع الوسيط والغلاف العصبي بشكل فردي من كل بئر في أنابيب الطرد المركزي.
- احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يسمح هذا الإجراء بتساقط الأمطار بواسطة الجاذبية في المناطق العصبية.
- إزالة افرا و resuspend في 1 مل من B27 المتوسطة الطازجة تكملها عوامل النمو.
- ضع الـ neurospheres مرة أخرى في نفس لوحة المرفق المنخفضة للغاية واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- من D10 إلى D15، استمر في تغيير نصف المتوسط وإضافة عوامل النمو.
7- مرور الـ"اعصاب"
- في D15 من الثقافة الأولية، وجمع neurospheres في أنابيب الطرد المركزي باستخدام ماصة 1 مل. قطع تلميح ماصة لزيادة حجم فتحة لتجنب تلف في neurospheres.
- احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تترسب المغنطيس العصبي بالجاذبية.
- إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من متوسطة مفرزة الخلية لكل أنبوب.
- احتضان الأنابيب لمدة 7 دقائق في 37 درجة مئوية.
- الماصات صعودا وهبوطا مع طرف 1 مل لتفكيك neurospheres.
- تخفيف الخلية مفرزة المتوسطة مع 3 مل من B27 المتوسطة لكل أنبوب.
- الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
- تجاهل افرا و resuspend كل بيليه الخلية مع متوسطة B27 جديدة تستكمل مع عوامل النمو.
- resuspend الخلايا المشتقة من VZ في 4 مل من المتوسطة والخلايا المستمدة من DG في 2 مل من المتوسطة.
- زراعة الخلايا (المقطع 1) في لوحة مرفقات جديدة منخفضة للغاية بمضاعفة عدد الآبار التي استخدمت في الثقافة الأولية (4 و 2 بئرين لـ VZ و DG على التوالي).
- تغيير نصف المتوسط كل ثلاثة أيام وإضافة عوامل النمو يوميا.
- بعد 10 أيام (D10) في مرور 1، تغيير إلى شروط التمسك في المقطع التالي.
8. مرور في شروط مُتَلَكِمَة
- قبل تنفيذ الممر 2، إعداد لوحات المغلفة مع بولي-L-أورنيثين واللامينين.
- في 24-صحون جيدا، إضافة 500 ميكرولتر من 1x بولي-L-أورنيثين (20 ميكروغرام/مل) في البئر. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة بولي-L-ornithine وغسل 4x مع 1X PBS (500 ميكرولتر/ جيدا).
- إضافة 200 ميكرولتر (الحد الأدنى لحجم لتغطية سطح بئر واحد) من 1x لامينين (5 ميكروغرام / مل) في البئر واحتضان لمدة 2-3 ساعة في 37 درجة مئوية قبل زراعة الخلايا.
- جمع neurospheres مع ماصة 1 مل مع نصائح قطع في أنبوب الطرد المركزي.
- احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لترسب في neurospheres الجاذبية.
- تخلص من اابر و اعادة اأطنان الاعصاب في طازج B27 المتوسطة بدون عوامل نمو.
- التعرق في laminin من لوحة المغلفة وإيداع الاعصاب في الآبار باستخدام ماصات 1 مل مع نصائح قطع.
ملاحظة: منع الآبار المغلفة من الجفاف بين إزالة اللامينان والطلاء العصابي. - تقسيم الثقافة إلى شرطين:
- الحفاظ على القطاعات العصبية المتمايزة لمدة 6 أيام (D6). تغيير الوسط كل يوم ثالث وإضافة عوامل النمو يوميا.
- مراقبة تمايز الخلايا المشتقة من الغلاف العصبي بنسبة 12 يوما (D12). تغيير الوسط كل ثلاثة أيام دون عوامل النمو.
ملاحظة: في نهاية D6 لD12 أو غير متمايزة لشروط التمايز، يمكن استخدام الخلايا للكيمياء المناعية التقليدية، وتحليل فرز الخلايا، 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) تلطيخ، استخراج RNA، من بين أمور أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشكلت الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية المعزولة عن VZ وDG لكل من الإناث والذكور الكبار البراري voles. حوالي 8-10 أيام بعد بدء الثقافة، يجب أن تكون الخلايا قد شكلت neurospheres. لاحظ أن اللوحة قد تحتوي على حطام في الثقافة الأولية (الشكل 3A). ومع ذلك، في مرور 1 يجب أن تتكون الثقافة فقط من neurospheres (الشكل 3B).
تم الحصول على عدد أكبر من neurospheres من VZ الإناث بالمقارنة مع الذكور VZ وDG من كل من الإناث والذكور(الشكل 4A). وتشير هذه البيانات إلى أن عدد الفيرات العصبية التي يتم الحصول عليها يعتمد على منطقة الانتشار وجنس الجِد. وبمجرد ظهور الـ "هـزفيرات العصب" (D8-D10)، تم الاحتفاظ بها لمدة سبعة أيام أخرى في الثقافة، وتم رصد نموها خلال هذه الفترة. تم قياس قطر الـ neurospheres على D8، D11، D14 (الجدول 1 والشكل 4B). ازداد حجم الغلاف العصبي (قطر) تدريجيا وفقا لأيام الثقافة لفولات الذكور والإناث في كل من المناطق العصبية. وكانت المغنطيس العصبي المستمدة من أدمغة الذكور أصغر بالمقارنة مع المغنطيس العصبي المستمدة من دماغ الإناث في كلا المجالين العصبي(الشكل 4B).
وبعد 15 يوما من الاستزراع الأولي على الظروف العائمة، تم توسيع نطاقات الأعصاب في المقطع 1 تحت نفس الظروف. بالنسبة للممر التالي 2 ، نمت الخلايا في ثقافة لاصقة ، على الرغم من أنها كانت قادرة على الالتزام منذ مرور 1. وقد تميزت neurospheres الملتزم في اليوم السادس (D6) في وجود عوامل النمو (حالة غير متمايزة، الشكل 5A)أو بدلا من ذلك حتى اليوم 15 (D15) دون عوامل النمو (حالة متفاوتة، الشكل 5B).
في D6 في ظل ظروف غير متمايزة، أعربت الخلايا المشتقة من الغلاف العصبي عن النسجين (علامة للنسل العصبي)(الشكل 6). أيضا، كان من الممكن تحديد الخلايا الإيجابية المزدوجة الكورتين (DCX) (خلايا الهجرة) وعلامة الانتشار Ki67، والتي تشير إلى وجود إما السلائف العصبية أو الخلايا العصبية غير ناضجة. ومع ذلك ، فإن عدم وجود الكولوكية من Ki67 مع DCX يشير إلى وجود الأروميستات العصبية بعد التشنج (الشكل 7). وأخيرا، في D15 في ظل ظروف التمايز، تم العثور على الخلايا العصبية الناضجة (الخلايا الإيجابية MAP2)، وكذلك الخلايا ذات النمط الظاهري الدغلي (الخلايا الإيجابية GFAP)، الذي يدل على إمكانات التمايز للخلايا المعزولة(الشكل 8).
الشكل 1: عرض الظهري للدماغ البالغ ومناطقه العصبية. (أ)كان الخط الصلب عند مستوى بريغما هو المرجع التشريحي لفصل الدماغ إلى كتلتين، روسترالي وcaudal. وكان الخط المنقط هو الإشارة إلى تقسيم كتلة السد للحصول على شريحتين تحتويان على DG. (B) منظر كورونال للمناطق العصبية المكشوفة مع الشق الأول، حيث يقع VZ. (C)منظر إكنولوجي للمناطق التشريحية التي تتعرض لها الشق الثاني، حيث يقع DG. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المراجع التشريحية لتشريح المناطق العصبية. (أ) مخطط وصورة من المقطع التاجي من كتلة rostral تظهر موقع VZ (خط منقط). (ب) مخطط وصورة من القسم التاجي من كتلة caudal تظهر تشريح DG. CPu، caudate putamen؛ V, البطين; VZ، منطقة البطين، DG، gyrus دنت؛ CA1 و CA3، مناطق الحصين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ميكروجرافات تمثيلية لثقافة الخلايا العصبية المستمدة من محاريب عصبية من الكبار. (أ)الثقافة الأولية للغلاف العصبية المعزولة عن VZ من فولس الإناث في D10. (ب) مرور 1 من neurospheres المستمدة من VZ من فولس الإناث في D10. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. ن = 3 لكل منطقة عصبية وجنس الفول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عدد وحجم الفيرات العصبية يعتمد على كل من الجنس ومصدر العصبية. (أ)عدد الفرفس العصبية في الثقافة الأولية التي تم الحصول عليها من VZ وDG في كل من الإناث والذكور في D10. تم تحليل البيانات مع ANOVA في اتجاه واحد تليها اختبارات ما بعد توكي المخصصة. تم العثور على اختلافات كبيرة بين الإناث VZ وبقية المجموعات، *** p<0.001. (B) قطر الاعصاب في جميع أنحاء D8-D14 في الثقافة الأولية تعتمد على الجنس vole. تم تحليل البيانات مع ANOVA ذات الاتجاهين تليها اختبارات توكي بعد المخصصة. وأظهرت المقارنات داخل المجموعة (الاختلافات داخل نفس المجموعة) زيادة في حجم الغلاف العصبي بين D8 مقابل D11 وD14، (*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001); وD11 مقابل D14 (+++ ف < 0.001) في VZ وDG من الإناث والذكور voles. وأظهرت المقارنة بين المجموعات (الاختلافات بين المجموعات في نفس المنطقة) أن الفئات العصبية للإناث في المنطقة الوسطى وDG أكبر من الفئات العصبية لدى الذكور عند D11 و D14. ### p<0.0001. تم الحصول على VZ من الذكور والإناث فولز (n = 3، لكل مجموعة). تم تحليل 15 أنثى و10 neuro ذكور. تم الحصول على DG من الذكور والإناث voles (n = 3، لكل مجموعة). وتمت معالجة 8 من 8 مناطق عصبية أنثوية و5 مغنطات عصبية ذكورية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تمثيلية لـ neurosphers مشتقة من أنثى VZ مثقفة في ظروف التصاق في المقطع 2. (أ)المغنطيس العصبية التي تم الالتزام بها في المقطع 2 مع عوامل النمو في D2. (ب)الخلايا المشتقة من الغلاف العصبي التي تم الالتزام بها في المقطع 2 بدون عوامل نمو عند D10. شريط مقياس = 200 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التعبير عن النسستين في الفئات العصبية. ممثل، epifluorescence المجهري صور الخلايا الإيجابية nestin المستمدة من VZ من كل من الإناث والذكور أدمغة البالغين في مرحلة غير متمايزة. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التعبير عن DCX وKi67 في الـ neurospheres. تمثيل epifluorescence- microscopy الصور من DCX-, Ki67 إيجابية الخلايا ودمج المستمدة من VZ من كل من العقول البالغة من الإناث والذكور في مرحلة غير متمايزة. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التعبير عن MAP2 وGFAP في المغنطيس العصبي. ممثل، epifluorescence-microscopy صور MAP2 (الخلايا العصبية الناضجة) وGFAP (الخلايا الدبقية) الخلايا الإيجابية المستمدة من VZ من كل من العقول البالغة من الإناث والذكور في مرحلة متباينة. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حجم المغنطيس العصبي (μm) | |||||
| VZ | Dg | ||||
| أيام الثقافة | الجنس | متوسط ± SD | أيام الثقافة | الجنس | متوسط ± SD |
| دال 8 | و | 102.1±18.2 | دال 8 | و | 55-3±8-5 |
| م | 86-5±15-1 | م | 37-6±6-8 | ||
| D11 | و | 217-3±35-7 | D11 | و | 142-1±15-4 |
| م | 158-9±47-2 | م | 71-8±14-4 | ||
| D14 | و | 306-6±44-4 | D14 | و | 243-8±37-4 |
| م | 210-8±42-3 | م | 120-2±19-1 | ||
الجدول 1: القياس الكمي لمتوسط الحجم (القطر) للفرايف العصبية المعزولة عن المنافذ العصبية في الثقافة الأولية. وتظهر الاختلافات الهامة في الشكل 4. تم الحصول على VZ من الذكور والإناث فولز (n = 3، لكل مجموعة). تم تحليل 15 من المغنطيس العصبي من الإناث وعشرة من الذكور. تم الحصول على DG من الذكور والإناث voles (n = 3، لكل مجموعة). وجرى تجهيز ثماني مناطق للأعصاب للإناث وخمسة من القطاعات العصبية للذكور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مرحلة للحصول على ثقافة الخلايا الجذعية العصبية هي فترة الهضم مع محلول انزيمي، والتي يجب ألا تتجاوز أكثر من 30 دقيقة لأنها قد تقلل من صلاحية الخلية. وينبغي أن تظهر في 8-10 أيام من الاستزراع الأولي. إذا لم تظهر في اليوم 12 ، وتجاهل الثقافة وتكرار التجربة ، والحد من فترة الهضم. وثمة مسألة أخرى هي الأوعية الدموية التي تغطي أنسجة الدماغ. وينبغي إزالتها تماما أثناء تشريح لأن فائض كريات الدم الحمراء يمكن أن تتداخل مع تكوين الخلايا العصبية.
يسمح هذا البروتوكول بتوسيع نطاقات الأعصاب العائمة حتى مرور 2 وتغيير الظروف إلى التمسك لتقييم الخلايا المشتقة من الغلاف العصبي. ومع ذلك، لديها قيود مثل انخفاض في إمكانات العصبية، والتي تتحول إلى التمايز الدبقي في الممرات المتعاقبة كاستجابة التكيف للظروف في المختبر12. ولهذا السبب، أوصينا بتوصيف الـ neurospheres في الثقافة الأولية والممر 1، والاستمرار في المقطع التالي فقط إذا كان مطلوبا لتوسيع الخلايا للتجارب التي لا تنطوي على توضيح الاختلافات بسبب الأصل.
ومن المثير للاهتمام، يمكن العثور على اختلافات جوهرية في الثقافة الأولية للغلاف العصبي نتيجة لمصدر علم الأعصاب (VZ أو DG) أو الذي يعتمد على الجنس (الإناث أو الذكور). وهكذا، فإن عدد وقطر القطاعات العصبية المستمدة من كل من المناطق العصبية للإناث هي أعلى بالمقارنة مع الذكور. هذا يمكن أن يكون فرقا وظيفيا في مكانة الدماغ الإناث مقارنة مع ذلك في الذكور، والتي يمكن دراسة الآليات الجزيئية في المختبر مع هذا الفحص.
ثقافة الخلايا من الخلايا العصبية المستمدة من فول الدماغ الكبار هو أداة قيمة يمكن أن تساعد في حل التناقضات بين الدراسات في الجسم الحي. على سبيل المثال، أفاد فاولر وزملاء العمل أن العزلة الاجتماعية ل 48 ح يدفع زيادة في 5-برومو-2'deoxyuridine (BrdU)-الخلايا الإيجابية في منطقة راز، دون التأثير على DG6. وعلى النقيض من ذلك، فإن ليبيرويرث وآخرين؛ أظهرت انخفاضا في انتشار الخلايا في DG13. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون الثقافة في المختبر نموذجا لتقييم الآليات الجزيئية في المناطق العصبية التي يمكن أن ترتبط مع التغيرات السلوكية في نموذج اجتماعي مثل فول المرج. على سبيل المثال، فقد اقترح أن التعرض لحديثي الولادة يدفع، في كل من فول الوالدين وغير الأبوية، زيادة في الخلايا الإيجابية BrdU- في DG14. يمكن تأكيد نتائج هذه الدراسة باستخدام بروتوكول ثقافة الخلية لدينا مع وضع العلامات BrdU. ومع ذلك، على الرغم من أن معظم الدراسات على voles والثدييات الأخرى استخدام BrdU وضع العلامات لتحديد الخلايا الجديدة، عيب هو أن labbeling قد تتغير اعتمادا على جرعات حقن15. EdU، آخر التناظرية thymidine، هو بديل مثالي لتحديد الخلايا في إطار مرحلة دورة الخلية في الثقافات المختبرية. في نفس التجربة ، من الممكن أن يكون هناك عدة فترات لدمج EdU ، وعلى عكس BrdU ، فإن denaturation الحمض النووي أو الحضانة مع الأجسام المضادة ليس من الضروري للكشف عنها. كما يمكن تقييم الخلايا الإيجابية EdU للتوطين المشترك مع علامات لتحديد دورة تقسيم الخلايا (Ki67) وتحديد نمطها الظاهري باستخدام علامات الخلايا الجذعية العصبية أو النسل (نستين، سوكس 2 وباكس6).
يمكن تأسيس ثقافة الخلايا العصبية كنموذج لدراسة تأثير الهرمونات أو الجزيئات الصغيرة أو الأدوية في معدل الانتشار والنشوء العصبي والتعديلات اللاجينية في الخلايا الجذعية العصبية وذرية البراري. على سبيل المثال، وقد اقترحت الدراسات السابقة دور هرمونات الإجهاد (مثل الكورتيكوستيرون) والاستروجين في تنظيم تولد الخلايا العصبية الكبار في voles، ولكن الآليات التنظيمية الأساسية غير معروفة6.
وأخيراً، ترتبط اضطرابات طيف التوحد (ASD) والفصام (SZ) بالعاهات في الإدراك الاجتماعي16،17. ومن المثير للاهتمام، والأوكسيتوسين والأرجينين-فاسوبريسين لها دور أساسي في السلوك الاجتماعي والعاطفي، والاختلافات التعبير الجيني في مستقبلاتها (OXTR و vasopressin 1a (V1AR)، على التوالي) ترتبط مع كل من ASD و SZ18،19،20،21. وعلاوة على ذلك، فإن التغيير في النشوء العصبي والهجرة العصبية أثناء النمو العصبي متورطة في علم وظائف الأعضاء في هذه الاضطرابات السلوكية22،23،24. وهكذا، نقترح لتحليل الآليات الجزيئية التي تتوسطها هذه الهرمونات على تولد الأعصاب والهجرة العصبية وغيرها من الأحداث الخلوية التي ترتبط التعديلات إلى الاضطرابات العصبية باستخدام ثقافة الخلية vole المرج في نموذج المختبر بسبب OXTR وV1AR تم العثور على مستقبلات في المرج vole الحصين25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا البحث من المنح الوطنية الوطنية 252756 و253631؛ UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 و IN203518; INPER 2018-1-163، وNIH P51OD11132. ونشكر ديسي غاسكا، وكارلوس لوزانو، ومارتين غارسيا، وألياندرا كاستيا، ونيديا هرنانديز، وجيسيكا نوريس، وسوزانا كاسترو على مساعدتهم التقنية الممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
