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Neuroscience

वयस्क प्रेयरी वोल्स में न्यूरोजेनिक निकस से प्राप्त न्यूरोस्फीयर की संस्कृति

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61402
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3, 4, 1
1Departamento de Neurobiología Conductual y Cognitiva, Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Silvio O. Conte Center for Oxytocin and Social Cognition, Center for Translational Social Neuroscience, Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 3Escuela Nacional de Estudios Superiores Juriquilla, Universidad Nacional Autónoma de México, 4Departamento de Fisiología y Desarrollo Celular, Instituto Nacional de Perinatología

Summary

हमने विट्रो अध्ययन में पूरक के रूप में, प्रेयर वोल्स के वयस्क मस्तिष्क के सबवेंट्रिकर जोन और डेंटेट जाइरस से तंत्रिका जनक कोशिकाओं को संस्कृति करने की शर्तों की स्थापना की, जो सामाजिक व्यवहार से जुड़े कार्यात्मक प्लास्टिक परिवर्तनों का हिस्सा हो सकता है।

Abstract

न्यूरोस्फेयर प्राथमिक कोशिका समुच्चय हैं जिनमें तंत्रिका स्टेम सेल और जनक कोशिकाएं शामिल हैं। ये 3 डी संरचनाएं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और प्रसार क्षमता को निर्धारित करने के साथ-साथ समय के साथ परख की तुलना में सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं। इसके अलावा, न्यूरोस्फीयर एक आला (इन विट्रो) बना सकते हैं जो गतिशील बदलते वातावरण के मॉडलिंग की अनुमति देता है, जैसे कि विकास कारक, हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, दूसरों के बीच अलग-अलग। माइक्रोटस ओकारोगस्टर (प्रेयर वोल्) सामाजिक-यौन व्यवहार और सामाजिक अनुभूति के न्यूरोबायोलॉजिकल आधार को समझने के लिए एक अनूठा मॉडल है। हालांकि, इन व्यवहारों में शामिल सेलुलर तंत्र अच्छी तरह से ज्ञात नहीं हैं। प्रोटोकॉल का उद्देश्य वयस्क प्रेयर वोल के न्यूरोजेनिक निकस से तंत्रिका जनक कोशिकाओं को प्राप्त करना है, जो गैर-अनुयायी परिस्थितियों में सुसंस्कृत होते हैं, न्यूरोस्फीयर उत्पन्न करने के लिए। न्यूरोस्फीयर का आकार और संख्या प्रेयर वोल के क्षेत्र (सबवेंट्रिकुलर जोन या डेंटेट जायरस) और सेक्स पर निर्भर करती है। यह विधि विट्रो में न्यूरोजेनिक निकस में सेक्स-निर्भर मतभेदों का अध्ययन करने के लिए एक उल्लेखनीय उपकरण है और पेयर बॉन्डिंग और बाइपेरेंटल केयर जैसे सामाजिक व्यवहारों से जुड़े न्यूरोप्लास्टिसिटी परिवर्तन। इसके अलावा, संज्ञानात्मक स्थितियों है कि सामाजिक बातचीत (आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों और पागलपन) में घाटे आवश्यक जांच की जा सकती है ।

Introduction

प्रेयर वोल(माइक्रोटस ओगरोगेस्टर),क्रिसेटिडी परिवार का एक सदस्य, एक छोटा स्तनपायी है जिसकी जीवन रणनीति सामाजिक रूप से एकयुग्मी और अत्यधिक मिलनसार प्रजातियों के रूप में विकसित होती है। नर और मादा दोनों ही घोंसला साझा करने, अपने क्षेत्र की रक्षा करने औरअपनी संतान1, 2, 3, 4के लिए द्विपरेंटल देखभाल प्रदर्शित करने के लिए सहवास की लंबी अवधि के बाद एक स्थायी जोड़ी बंधनस्थापितकरते हैं। इस प्रकार, प्रेयर वोल् सामाजिक-यौन व्यवहार और सामाजिक अनुभूति में हानि के न्यूरोबायोलॉजिकल आधार को समझने के लिए एक मूल्यवान मॉडल है5.

वयस्क न्यूरोजेनेसिस तंत्रिका प्लास्टिसिटी की सबसे सर्वोपरि प्रक्रियाओं में से एक है जो व्यवहार में परिवर्तन की ओर जाता है। उदाहरण के लिए, हमारे अनुसंधान समूह ने पुरुष वोल्स में बताया कि हिप्पोकैम्पस के डेंटेट जायरस (डीजी) में सबवेंट्रिकुलर जोन (वीजेड) और उपग्रानीय क्षेत्र में संभोग वृद्धि सेल प्रसार के साथ सामाजिक सहवास, सुझाव है कि वयस्क न्यूरोजेनेसिस प्रेयर voles (अप्रकाशित डेटा) में संभोग द्वारा प्रेरित जोड़ी संबंध के गठन में एक भूमिका निभा सकते हैं । दूसरी ओर, यद्यपि मस्तिष्क क्षेत्र जहां नए न्यूरॉन्स उत्पन्न और एकीकृत होते हैं, वे सर्वविदित होते हैं, इन प्रक्रियाओं में शामिल आणविक और सेलुलर तंत्र पूरे मस्तिष्क मॉडल6में तकनीकी कमियों के कारण अनिर्धारित रहते हैं। उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति और अन्य सेलुलर गतिविधियों को नियंत्रित करने वाले सिग्नलिंग पाथवे में अपेक्षाकृत कम सक्रियण अवधि (फॉस्फोप्रोटेम का पतालगाना) 7है। एक वैकल्पिक मॉडल वयस्क न्यूरोजेनेसिस में शामिल आणविक घटकों को स्पष्ट करने के लिए अलग और सुसंस्कृत वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं या जनक कोशिकाओं है।

वयस्क स्तनपायी (माउस) मस्तिष्क से विट्रो तंत्रिका अग्रदूतों को बनाए रखने के लिए पहला दृष्टिकोण न्यूरोस्फीयर की परख थी, जो गैर-अनुयायी परिस्थितियों में बढ़ रही सेलुलर समुच्चय हैं जो न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए अपनी बहुपंतक क्षमता को संरक्षित करते हैं, साथ ही एस्ट्रोसाइट्स8,9,10। उनके विकास के दौरान, एक चयन प्रक्रिया है जहां केवल अग्रदूत ही8,9,10को पैदा करने और न्यूरोस्फेयर उत्पन्न करने के लिए एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ2) जैसे माइटोजेन्स का जवाब देंगे।

हमारी जानकारी के लिए, प्रेयर voles से वयस्क तंत्रिका जनक प्राप्त करने के लिए साहित्य में कोई प्रोटोकॉल की सूचना दी है। यहां, हमने न्यूरोजेनिक निकस और न्यूरोस्फीयर गठन परख के माध्यम से उनके इन विट्रो रखरखाव से न्यूरोनल प्रोजेनिटर को अलग करने के लिए संस्कृति की स्थिति स्थापित की। इस प्रकार, प्रयोगों को आणविक और सेलुलर तंत्र की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है जो तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और जनकों के प्रसार, प्रवासन, भेदभाव और अस्तित्व में शामिल हैं, ऐसी प्रक्रियाएं जो अभी भी प्रेयर वोल में अज्ञात हैं। इसके अलावा, वीजेड और डीजी से प्राप्त कोशिकाओं के गुणों में विट्रो मतभेदों को स्पष्ट करने से सामाजिक-यौन व्यवहार और संज्ञानात्मक व्यवहारों में परिवर्तन से जुड़े तंत्रिका प्लास्टिसिटी में न्यूरोजेनिक निकस की भूमिका के बारे में जानकारी मिल सकती है, और सामाजिक बातचीत (आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और सिजोफ्रेनिया) में घाटा हो सकता है, जो सेक्स-निर्भर भी हो सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन को इंस्टीट्यूटो डी न्यूरोबायोलोजिया, यूनीवर्सिड नैसिनल ऑटोनोमा डी मेक्सिको, मेक्सिको और इंस्टीट्यूटो नैसिनल डी पेरिनाटोलॉजिया (2018-1-163) की रिसर्च एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था। स्वास्थ्य के मैक्सिकन सेक्रेटेरिया के "ले जनरल डी सालुड एन मटेरिया डी इन्वेस्टिगासिओन पैरा ला सालुद" (स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए सामान्य स्वास्थ्य कानून) के आधार पर आधिकारिक मैक्सिकन मानक (एनओएम-062-Z00-1999) के बाद जानवरों के प्रजनन, देखभाल और मानवीय अंत बिंदुओं की स्थापना की गई थी।

1. समाधान और स्टॉक तैयार

  1. दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम-एफ 12 (डीएमईएम-एफ12), एन2 सप्लीमेंट (100x), ग्लूटामाइन सप्लीमेंट (100x) की 5 एमएल और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100x) के 5 एमएल के साथ एक एन2 कल्चर मीडियम तैयार करें ।
  2. न्यूरोबेसल माध्यम के 480 एमएल, बी 27 सप्लीमेंट (50x) के 10 एमएल, ग्लूटामीन सप्लीमेंट के 5 एमएल और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100x) के 5 एमएल के साथ बी27 कल्चर मीडियम तैयार करें।
  3. 100 इकाइयों/μL (1000x) की गतिविधि के साथ aliquots प्राप्त करने के लिए 1x PBS (फॉस्फेट-बफर खारा) में कोलेजनेस पाउडर का पुनर्गठन करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सूचना, कोलेजनेस गतिविधि कंपनियों की बहुत संख्या पर निर्भर करता है।
  4. 1x पीबीएस (50 मिलीग्राम/एमएल) में 5 मिलीग्राम डिस्पास पाउडर को घोलकर डिस्पॉज स्टॉक एलिकोट्स तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. डीएमईएम-एफ12 माध्यम के 100 एमएल के साथ एक एंजाइमेटिक समाधान तैयार करें, 50 माइक्रोनल ऑफ स्टॉक कोलेजनेज (100 यूनिट/माइक्रोन) के लिए 50 यू/एमएल और 333 माइक्रोनल ऑफ स्टॉक डिस्पॉज (50 मिलीग्राम/एमएल) की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.33 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता हो।
  6. एक धोने का समाधान तैयार करने के लिए, 1x पीबीएस के 1,000 मिलियन मिलियन तक, 0.4766 ग्राम HEPES (अंतिम एकाग्रता 2 mM), डी-ग्लूकोज के 3.6 ग्राम (अंतिम एकाग्रता 20 mM) और 2.1 ग्राम NaHCO3 (अंतिम एकाग्रता 25 mM) जोड़ें।
  7. बाँझ पानी का उपयोग करके पॉली-एल-ऑर्निथिन स्टॉक एलिकोट्स (1 मिलीग्राम/एमएल) तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. पॉली-एल-ऑर्निथिन का वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। 20 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ पानी के ४९ एमएल में एक शेयर aliquot (1mg/mL) पतला ।
  9. लेमिनिन का वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। 5 माइक्रोन/एमएल मूल स्टॉक के 5 एमएल में लैमिनिन (1 मिलीग्राम/एमएल ओरिजनल स्टॉक) के 25 माइक्रोन को पतला करें ।
    नोट: तैयारी के बाद, प्रदूषण से बचने के लिए संस्कृति मीडिया, काम करने और स्टॉक समाधानों को फ़िल्टर करें। एक सिरिंज या बोतल-शीर्ष वैक्यूम फिल्टर (0.2 माइक्रोन पोर आकार के साथ पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली) का उपयोग करें। कल्चर मीडिया और वर्क सॉल्यूशंस को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 दिनों तक स्टोर किया जा सकता है, जबकि स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर चार महीने तक स्टोर किया जा सकता है ।

2. माइक्रोडिसेक्शन शुरू करने से पहले तैयारी

  1. ऑटोक्लेविंग द्वारा या गर्म ग्लास मनका ड्राई स्टरलाइजर के साथ सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज करें।
  2. सख्त आसन और एंटीसेप्टिक स्थितियों के तहत माइक्रोडिसेक्शन सतह क्षेत्र को साफ करें (उदाहरण के लिए, ओजोनीकृत पानी के साथ)।
    नोट: प्रत्येक वोल मस्तिष्क से दोनों न्यूरोजेनिक निकस के माइक्रोडिसेक्शन का समय लगभग 30 मिनट है। पूरी प्रक्रिया के लिए 1-4 जानवरों के साथ काम करने की सिफारिश की जाती है।

3. पूरे मस्तिष्क की निकासी

  1. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से पेंटोबार्बिटल (6.3 मिलीग्राम/पशु) की अधिक मात्रा के साथ वयस्क वोल (12-16 सप्ताह) को एनेस्थेटाइज करें। एक फर्म पैर की अंगुली चुटकी के जवाब में पेडल पलटा की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की गहराई सत्यापित करें।
  2. एक बार वोल पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है, तो इच्छामृत्यु को डेपुटेशन से प्रेरित करें और सिर को ठीक करें।
  3. खोपड़ी से त्वचा को कैंची से विच्छेदन करें, जिससे खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए एक कौडल-रोस्ट्रल चीरा (15 मिमी लंबा) हो।
  4. ऑक्सीपिटल और इंटरपरीटल हड्डियों को काटें और सगिटल और पार्श्व टांके के साथ खोपड़ी में एक चीरा का पता लगाएं।
  5. कैंची का उपयोग कर ललाट और पार्श्व हड्डियों के जंक्शन पर खोपड़ी में एक छेद बनाओ, बहुत सावधान किया जा रहा है मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान नहीं है ।
  6. मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए, शेष कपाल के टुकड़ों को हटा दें जो दोनों मस्तिष्क गोलार्द्धों को तेज-नुकीले चिमटी से कवर करते हैं।
  7. कपाल के आधार से पूरे मस्तिष्क को उठाने के लिए स्टेनलेस स्टील स्पैटुला का उपयोग करें।
  8. ब्रेन को कोल्ड वॉश सॉल्यूशन के 20 एमएल के साथ सेंट्रलाइज ट्यूब (50 एमएल) में ले लीजिए।
  9. ब्रेन को दो बार कोल्ड वॉश सॉल्यूशन से धोएं।

4. तंत्रिका ऊतक का माइक्रोडिसेक्शन

  1. बर्फ से घिरी सतह पर पेट्री डिश रखें।
  2. डिश पर दिमाग जमा करें और कोल्ड वॉश सॉल्यूशन का 20 एमएल डालें।
  3. एक स्केलपेल के साथ, कोरोनल विमान में, मस्तिष्क को ऊतक (रोस्ट्रल और कौडल) के दो ब्लॉकों में विभाजित करें। एक न्यूरोएनाटॉमिकल संदर्भ के रूप में, पूर्व-पीछे की धुरी11 (चित्रा 1A,ठोस रेखा) में ब्रेग्मा स्तर पर कोरोनल कट करें।
  4. रोस्ट्रल ब्लॉक से, वीजेड टिश्यू(चित्रा 1B)निकालें, जबकि कौडल ब्लॉक से डीजी(चित्रा 1C)को हटा दें।
  5. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे वीजेड विच्छेदन करें।
    1. डुमोंट संदंश के साथ, गोलार्द्धों में से एक को पकड़ें; फिर, वेंट्रिकल की ऊंचाई पर डालें, ऊतक के नीचे एक दूसरे ड्यूमोंट संदंश के ठीक सुझाव जो कॉडेट-पुटमेन(चित्रा 2A) को लाइन करते हैं।
    2. ऊतक को अलग करने के लिए डोरसोवेंट्रल अक्ष के साथ संदंश खोलें।
    3. कोल्ड वॉश सॉल्यूशन के 2 मिलील के साथ एक सेंट्रलाइज ट्यूब में प्रति व्यक्ति वीजेड टिश्यू लीजिए। दो से अधिक जानवरों के ऊतकों को पूल न करें।
    4. दूसरे गोलार्द्ध में माइक्रोडिसेक्शन दोहराएं।
    5. बर्फ पर द्विपक्षीय वीजेड ऊतक युक्त ट्यूब को स्टोर करें और डीजी को विच्छेदन जारी रखें।
  6. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत कौडल ब्लॉक से डीजी विच्छेदन।
    1. एक स्केलपेल के साथ, दो स्लाइस प्राप्त करने के लिए ब्लॉक में एक कोरोनल कट बनाएं, जिसमें हिप्पोकैम्पल गठन मनाया जाता है। एक मील का पत्थर के रूप में, कटौती माउस मस्तिष्क एटलस 11(चित्रा 1A,बिंदीदार रेखा और चित्रा 1C) के अनुसार पूर्वकाल-पीछे धुरी में-2 मिमी ब्रेग्मा निर्देशांक पर किया जाता है।
    2. ड्यूमोंट संदंश के साथ, स्लाइस में से एक को पकड़ें, और ठीक-ठाक ड्यूमोंट फोर्स्प डीजी और सीए1 के बीच एक क्षैतिज कटौती करते हैं और फिर डीजी(चित्रा 2B)को अलग करने के लिए डीजी और सीए 3 के बीच एक ऊर्ध्वाधर चीरा करते हैं।
    3. दूसरे गोलार्द्ध के पहले टुकड़े में विच्छेदन दोहराएं।
    4. दूसरे स्लाइस में दोनों गोलार्द्धों में विच्छेदन दोहराएं।
    5. एक सेंट्रलाइज ट्यूब में प्रत्येक वोल के चार डीजी टुकड़े ले लीजिए। दो से अधिक जानवरों के डीजी टिश्यू पूल न करें।
      नोट: यदि एक से अधिक जानवरों के विच्छेदन की आवश्यकता है, तो बाकी दिमाग को विच्छेदन जारी रखते हुए बर्फ पर वीजेड या डीजी ऊतक के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों को स्टोर करें। विच्छेदन करते समय मस्तिष्क के ऊतकों को कवर करने वाली सभी रक्त वाहिकाओं को हटा दें। यदि जहाजों को छोड़ नहीं दिया जाता है, तो संस्कृति को एरिथ्रोसाइट्स की अधिकता के साथ मिलाया जा सकता है और न्यूरोस्फीयर गठन को परेशान कर सकता है।

5. तंत्रिका कोशिकाओं का अलगाव

  1. जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें और ऊतक के टुकड़ों के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा उपजी के बारे में 10 मिनट इंतजार करें ।
  2. वॉश सॉल्यूशन निकालें और प्रत्येक ट्यूब में गर्म एंजाइमेटिक समाधान का 1 एमएल जोड़ें।
  3. ट्यूबों को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. ऊतक के टुकड़ों को विघटित करें; 1 एमएल टिप के साथ ऊपर और नीचे पिपेट करें। 30x से अधिक पिपेट न करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की दूसरी इनक्यूबेशन को पूरा करें।
  6. दूसरी इनक्यूबेशन के अंत में, ऊतकों को तोड़ने के लिए पिपेट। 30x से अधिक पिपेट न करें।
    नोट: पिपटिंग के बाद, ऊतक के टुकड़ों को पूरी तरह से विघटित किया जाना चाहिए; यदि वे विघटित नहीं हैं, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर से पिपेट करें। पाचन अवधि 30 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  7. एंजाइमेटिक उपचार को पतला करने के लिए प्रति ट्यूब N2 माध्यम के 9 एमएल जोड़ें।
  8. कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  9. सुपरनेट को त्यागें और N2 माध्यम के 10 एमएल से धो लें।
  10. स्टेप 5.8 के रूप में एक ही शर्तों के तहत सेंट्रलाइज।
  11. प्रत्येक ट्यूब से सुपरनेट निकालें और क्रमशः 2 एमएल और बी27 माध्यम के 1 एमएल में वीजेड और डीजी के सेल छर्रों को फिर से रीसस्ट करें।
  12. किसी भी गैर-विघटित ऊतक को हटाने के लिए, सेल छन्नी (आकार 40 माइक्रोन) का उपयोग करके प्रत्येक सेलुलर निलंबन को फ़िल्टर करें।

6. न्यूरोस्फीयर गठन

  1. संस्कृति कोशिकाओं एक अल्ट्रा कम लगाव, 24 अच्छी तरह से थाली में छलनी के माध्यम से पारित कर दिया । वीजेड के लिए दो कुओं का उपयोग करें और डीजी के लिए एक कुएं (B27 मध्यम/वेल का 1 एमएल) ।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से (अंतिम एकाग्रता 1x) में एफजीएफ 2 के 20 एनजी/एमएल और ईजीएफ के 20 एनजी/एमएल जोड़ें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और उच्च आर्द्रता (90-95%) पर इनक्यूबेट। 48 घंटे (संस्कृति के दिन 1 और दिन 2, D1-D2) के लिए परेशान न करें।
  4. तीसरे दिन (D3) पर, संस्कृति माध्यम के आधे को हटा दें और इसे ताजा B27 माध्यम (500 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह) के साथ बदलें, जो विकास कारकों की दोहरी एकाग्रता (2x) के साथ पूरक है।
  5. हर तीसरे दिन दोहराएं, संस्कृति माध्यम (इसका आधा) बदलें और इसे विकास कारकों की दोहरी एकाग्रता (2x) के साथ पूरक एक ताजा B27 माध्यम के साथ बदलें।
  6. उन दिनों जब संस्कृति माध्यम को बदलना आवश्यक नहीं है, तो विकास कारकों को 1x की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
  7. सुनिश्चित करें कि न्यूरोस्फीयर डी 8-डी 10 के आसपास बनते हैं।
  8. D10 में, सभी मलबे को हटाने के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम बदलें।
    1. मध्यम और न्यूरोसर्जरी को प्रत्येक कुएं के व्यक्तिगत रूप से अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एकत्र करें।
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। यह प्रक्रिया गुरुत्वाकर्षण द्वारा न्यूरोस्फीयर वर्षा की अनुमति देती है।
    3. विकास कारकों के साथ पूरक ताजा B27 मध्यम के 1 मिलील में सुपरनैंट और रिसिपेंड निकालें।
    4. न्यूरोस्फीयर को उसी अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में वापस रखें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
  9. D10 से D15 तक, मध्यम के आधे को बदलना जारी रखें और विकास कारकों को जोड़ें।

7. न्यूरोस्फीयर का मार्ग

  1. प्राथमिक संस्कृति के D15 में, 1 मिलीएल पिपेट का उपयोग करके न्यूरोसर्जन ट्यूबों को अपकेंद्रित्र ट्यूबों में इकट्ठा करें। न्यूरोस्फीयर को नुकसान से बचने के लिए खोलने के आकार को बढ़ाने के लिए पिपेट टिप काटें।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। न्यूरोस्फीयर गुरुत्वाकर्षण से उपजी होती है।
  3. मीडियम निकालें और प्रति ट्यूब सेल टुकड़ी मीडियम का 1 एमएल डालें।
  4. ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. न्यूरोस्फीयर को खत्म करने के लिए 1 एमएल टिप के साथ पिपेट ऊपर और नीचे।
  6. प्रति ट्यूब बी 27 माध्यम के 3 एमएल के साथ सेल टुकड़ी माध्यम को पतला करें।
  7. 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।
  8. सुपरनैंट को त्यागें और प्रत्येक सेल पेलेट को विकास कारकों के साथ पूरक एक ताजा B27 मध्यम के साथ फिर से खर्च करें।
    1. मीडियम की 4 एमएल में वीजेड-व्युत्पन्न कोशिकाओं को और 2 मिलील में डीजी-व्युत्पन्न कोशिकाओं को फिर से रीसुड करें।
  9. संस्कृति कोशिकाओं (मार्ग 1) प्राथमिक संस्कृति में इस्तेमाल किया गया है कि कुओं की संख्या दोगुनी करके एक नई अल्ट्रा कम लगाव प्लेट में (क्रमशः वीजेड और डीजी के लिए 4 और 2 कुओं) ।
  10. हर तीसरे दिन आधा माध्यम बदलें और विकास कारकों को दैनिक जोड़ें।
  11. 10 दिनों के बाद (D10) पारित होने में 1, अगले मार्ग में अनुयायी शर्तों को बदलें।

8. अनुयायी परिस्थितियों में पारित

  1. मार्ग 2 को अंजाम देने से पहले पॉली-एल-ऑर्निथिन और लेमिनिन के साथ कोटेड प्लेट्स तैयार करें ।
    1. 24-अच्छी प्लेटों में, प्रति अच्छी तरह से 1x पॉली-एल-ऑर्निथिन (20 μg/l) के 500 माइक्रोल जोड़ें। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    2. पॉली-एल-ऑर्निथिन निकालें और 1x पीबीएस (५०० μL/well) के साथ 4x धोएं ।
    3. कोशिकाओं की खेती करने से पहले 1x लेमिनिन (5 μg/mL) प्रति अच्छी तरह से 2-3 घंटे के लिए 200 μL (एक अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से कवर करने के लिए न्यूनतम मात्रा) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. एक सेंट्रलाइज ट्यूब में कट टिप्स के साथ 1 एमएल पिपेट के साथ न्यूरोस्फीयर ले लीजिए।
  3. गुरुत्वाकर्षण द्वारा न्यूरोस्फीयर को तेज करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. सुपरनैंट को त्यागें और विकास कारकों के बिना ताजा बी 27 माध्यम में न्यूरोस्फीयर को फिर से खर्च करें।
  5. लेपित प्लेट से लेमिनिन को एस्पिरेट करें और कट टिप्स के साथ 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके न्यूरोस्फीयर को कुओं में जमा करें।
    नोट: लेमिनिन हटाने और चढ़ाना न्यूरोस्फीयर के बीच बाहर सुखाने से लेपित कुओं को रोकने के लिए ।
  6. संस्कृति को दो स्थितियों में विभाजित करें:
    1. 6 दिनों (D6) के लिए विभेदित न्यूरोस्फीयर बनाए रखें। हर तीसरे दिन माध्यम बदलें और विकास कारकों को दैनिक जोड़ें।
    2. 12 दिनों (D12) द्वारा न्यूरोस्फीयर-व्युत्पन्न कोशिकाओं के भेदभाव का निरीक्षण करें। विकास कारकों के बिना हर तीसरे दिन माध्यम बदलें।
      नोट: भेदभाव की स्थिति के लिए अलग या D12 के लिए D6 के अंत में, कोशिकाओं का उपयोग पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, सेल छंटाई विश्लेषण, 5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीयूरिडीन (EdU) धुंधला, आरएनए निष्कर्षण, दूसरों के बीच के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

न्यूरोस्फीयर का गठन महिला और पुरुष प्रेयर voles दोनों के वीजेड और डीजी से अलग तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से किया गया था। संस्कृति शुरू करने के लगभग 8-10 दिनों के बाद, कोशिकाओं को न्यूरोस्फीयर का गठन करना चाहिए था। ध्यान दें कि प्लेट में प्राथमिक संस्कृति(चित्रा 3 ए)में मलबा हो सकता है। हालांकि, मार्ग 1 में संस्कृति में केवल न्यूरोस्फीयर(चित्रा 3B)शामिल होना चाहिए।

महिला वीजेड और दोनों महिलाओं और पुरुषों(चित्रा 4A)के डीजी की तुलना में महिला वीजेड से अधिक संख्या में न्यूरोस्फीयर प्राप्त किए गए थे। इन आंकड़ों से पता चलता है कि प्राप्त न्यूरोस्फीयर की संख्या प्रसार क्षेत्र और वोल सेक्स पर निर्भर करती है। एक बार जब न्यूरोस्फीयर दिखाई दिया (D8-D10), वे संस्कृति में एक और सात दिनों के लिए बनाए रखा गया था, और उनके विकास इस अवधि के दौरान निगरानी की थी । न्यूरोस्फीयर का व्यास डी 8, डी 11 और डी 14(टेबल 1 और चित्रा 4B)पर मापा गया था। न्यूरोस्फीयर का आकार (व्यास) दोनों न्यूरोनल क्षेत्रों में पुरुष और महिला voles के लिए संस्कृति के दिनों के अनुसार उत्तरोत्तर वृद्धि हुई। पुरुष दिमाग से प्राप्त न्यूरोस्फीयर दोनों न्यूरोजेनिक क्षेत्रों(चित्रा 4B)में महिला मस्तिष्क से प्राप्त न्यूरोस्फीयर की तुलना में छोटे थे।

फ्लोटिंग स्थितियों पर प्राथमिक संस्कृति के 15 दिनों के बाद, न्यूरोस्फीयर को उन्हीं परिस्थितियों में 1 मार्ग में विस्तारित किया गया था। बाद के मार्ग 2 के लिए, कोशिकाओं चिपकने वाली संस्कृति में वृद्धि हुई, हालांकि वे 1 पारित होने के बाद से पालन करने में सक्षम थे। पालन किए गए न्यूरोस्फीयर को विकास कारकों (अविभेदित स्थिति, चित्रा 5A)की उपस्थिति में छह दिन (डी 6) में या इसके बजाय विकास कारकों (विभेदित स्थिति, चित्रा 5B)के बिना 15 दिन (D15) तक विशेषता थी।

अपविभेदन स्थितियों के तहत D6 में, न्यूरोस्फीयर-व्युत्पन्न कोशिकाओं ने नेस्टिन (तंत्रिका जनकों के लिए एक मार्कर)(चित्र 6)व्यक्त किया। इसके अलावा, डबलकॉर्टिन (डीसीएक्स) सकारात्मक कोशिकाओं (माइग्रेशन कोशिकाओं) और प्रसार मार्कर Ki67 की पहचान करना संभव था, जो या तो न्यूरोनल अग्रदूत या अपरिपक्व न्यूरॉन्स की उपस्थिति का संकेत देता है। हालांकि, डीसीएक्स के साथ Ki67 के कोलोकैलाइजेशन की कमी पोस्टमिटोटिक न्यूरोब्लास्ट(चित्रा 7)की उपस्थिति का सुझाव देती है। अंत में, विभेदन स्थितियों के तहत D15 में, परिपक्व न्यूरॉन्स (MAP2-सकारात्मक कोशिकाएं) पाए गए, साथ ही साथ ग्लियल फेनोटाइप (GFAP-सकारात्मक कोशिकाओं) के साथ कोशिकाएं, जो अलग कोशिकाओं(चित्रा 8)की भेदभाव क्षमता को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक वयस्क वोल मस्तिष्क और उसके न्यूरोजेनिक क्षेत्रों का पृष्ठीय दृश्य। (क)ब्रेग्मा स्तर पर ठोस रेखा मस्तिष्क को दो ब्लॉकों, रोस्ट्रल और कौडल में अलग करने का शारीरिक संदर्भ था । बिंदीदार रेखा डीजी युक्त दो स्लाइस प्राप्त करने के लिए कौडल ब्लॉक को विभाजित करने का संदर्भ था । (ख)न्यूरोनल क्षेत्रों का कोरोनल दृश्य जो पहले चीरा के साथ उजागर होता है, जहां वीजेड स्थित होता है । (ग)दूसरे चीरा के साथ उजागर शारीरिक क्षेत्रों के कोरोनल दृश्य, जहां महानिदेशक स्थित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: न्यूरोजेनिक क्षेत्रों के विच्छेदन के लिए शारीरिक संदर्भ। (A)रोस्ट्रल ब्लॉक से कोरोनल सेक्शन की स्कीम और फोटोग्राफ जिसमें वीजेड लोकेशन (बिंदीदार रेखा) दर्शाई गई है । }कौडलब्लॉक से कोरोनल सेक्शन की योजना और फोटो डीजी विच्छेदन दिखाते हुए। सीपीयू, कॉडेट पुटमेन; वी, वेंट्रिकल; वीजेड, वेंट्रिकुलर जोन, डीजी, डेंटेट जाइरस; CA1 और CA3, हिप्पोकैम्पस के क्षेत्रों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: वयस्क प्रेयर वोल के न्यूरोजेनिक निकस से प्राप्त न्यूरोस्फीयर संस्कृति के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। (A)डी10 में महिला वोलों के वीजेड से अलग न्यूरोस्फीयर की प्राथमिक संस्कृति। (ख)डी10 में महिला वॉल्व्स के वीजेड से प्राप्त न्यूरोस्फीयर का पैसेज 1। स्केल बार = प्रत्येक न्यूरोजेनिक क्षेत्र और वोल के लिंग के लिए 200 माइक्रोन एन = 3। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: न्यूरोस्फीयर की संख्या और आकार सेक्स और न्यूरोजेनिक स्रोत दोनों पर निर्भर करता था। (क)डी10 में महिला और पुरुष दोनों तरह के वोल्स में वीजेड और डीजी से प्राप्त प्राथमिक संस्कृति में न्यूरोस्फीयर की संख्या । डेटा एक तरह से ANOVA के साथ विश्लेषण किया गया एक Tukey पोस्ट हॉक परीक्षणों के बाद । महिला वीजेड और बाकी समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर पाए गए, ***पी एंड एलटी;0.001। (ख)प्राथमिक संस्कृति में डी8-डी14 भर में न्यूरोस्फीयर का व्यास वोल सेक्स पर निर्भर करता था। डेटा एक दो तरह से ANOVA के साथ विश्लेषण किया गया है Tukey पोस्ट हॉक परीक्षणों के बाद । अंतर-समूह तुलना (एक ही समूह के भीतर अंतर) ने D8 बनाम D11 और D14 के बीच न्यूरोस्फीयर आकार में वृद्धि दिखाई, (*p<0.05, *p<0.001, **lt;0.0001); और VZ और महिला और पुरुष voles के डीजी में D11 बनाम D14 (+ पी एंड लेफ्टिनेंट;0.001) । अंतर-समूह तुलना (एक ही क्षेत्र में समूहों के बीच मतभेद) से पता चला है कि महिला वीजेड और डीजी न्यूरोसर्जरी D11 और D14 में पुरुष न्यूरोस्फीयर की तुलना में बड़े हैं। ### पीएंड एलटी;0.0001। वीजेड पुरुषों और महिला voles (एन = 3, प्रति समूह) से प्राप्त किया गया था। 15 महिला और 10 पुरुष न्यूरोसर्जरी का विश्लेषण किया गया। डीजी पुरुषों और महिला voles (n = 3, प्रति समूह) से प्राप्त किया गया था । 8 महिला न्यूरोस्फीयर और 5 पुरुष न्यूरोस्फीयर पर कार्रवाई की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मार्ग 2 में आसंजन स्थितियों में सुसंस्कृत महिला वीजेड से प्राप्त न्यूरोस्फीयर की प्रतिनिधि छवियां। (क)न्यूरोस्फीयर ने डी 2 में विकास कारकों के साथ मार्ग 2 में पालन किया । (ख)न्यूरोस्फीयर-व्युत्पन्न कोशिकाओं ने D10 में विकास कारकों के बिना 2 पारित होने में पालन किया । स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: न्यूरोस्फीयर में नेस्टिन की अभिव्यक्ति। प्रतिनिधि, एपिफ्लोरेसेंस-नकारात्मक-सकारात्मक कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी छवियां अविभेदित चरण में महिला और पुरुष वयस्क दिमाग दोनों के वीजेड से प्राप्त होती हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: न्यूरोस्फीयर में डीसीएक्स और Ki67 की अभिव्यक्ति। डीसीएक्स-, Ki67-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिनिधि एपिफ्लोरेसेंस-माइक्रोस्कोपी छवियां और अविभेदित चरण में वयस्क महिला और पुरुष दिमाग दोनों के वीजेड से प्राप्त मर्ज। स्केल बार = 25 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: न्यूरोस्फीयर में MAP2 और GFAP की अभिव्यक्ति। प्रतिनिधि, EPIfluorescence-MAP2 (परिपक्व न्यूरॉन्स) और GFAP (ग्लियल कोशिकाओं) सकारात्मक कोशिकाओं के चित्र दोनों वयस्क महिला और पुरुष दिमाग के वीजेड से विभेदित चरण में प्राप्त की । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

न्यूरोस्फीयर का आकार (माइक्रोन)
वीजेड महानिदेशक
संस्कृति के दिन लिंग मतलब ± एसडी संस्कृति के दिन लिंग मतलब ± एसडी
डी8 स्‍त्री-विषयक 102.1±18.2 डी8 स्‍त्री-विषयक 55.3±8.5
लाख 86.5±15.1 लाख 37.6±6.8
D11 स्‍त्री-विषयक 217.3±35.7 D11 स्‍त्री-विषयक 142.1±15.4
लाख 158.9±47.2 लाख 71.8±14.4
D14 स्‍त्री-विषयक 306.6±44.4 D14 स्‍त्री-विषयक 243.8±37.4
लाख 210.8±42.3 लाख 120.2±19.1

तालिका 1: प्राथमिक संस्कृति में न्यूरोजेनिक निकस से अलग न्यूरोस्फीयर के औसत आकार (व्यास) का मात्राकरण। चित्र 4में महत्वपूर्ण अंतर दिखाए गए हैं । वीजेड पुरुषों और महिला voles (एन = 3, प्रति समूह) से प्राप्त किया गया था। महिलाओं से पंद्रह और पुरुषों से दस न्यूरोस्फीयर का विश्लेषण किया गया । डीजी पुरुषों और महिला voles (n = 3, प्रति समूह) से प्राप्त किया गया था । आठ महिला न्यूरोसर्जरी और पांच पुरुष न्यूरोस्फीयर पर कार्रवाई की गई ।

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Discussion

तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति प्राप्त करने के लिए एक चरण एंजाइमेटिक समाधान के साथ पाचन अवधि है, जो 30 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता को कम कर सकता है। प्रारंभिक संस्कृति के बाद 8-10 दिनों में न्यूरोसर्जरी उभरने चाहिए; यदि वे 12 दिन तक नहीं उभरते हैं, तो संस्कृति को त्याग दें और प्रयोग को दोहराएं, पाचन अवधि को कम करें। एक और मुद्दा रक्त वाहिकाओं है कि मस्तिष्क के ऊतकों को कवर है । विच्छेदन के दौरान उन्हें पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि एरिथ्रोसाइट्स की अधिकता न्यूरोस्फीयर गठन में हस्तक्षेप कर सकती है।

यह प्रोटोकॉल 2 मार्ग तक फ्लोटिंग न्यूरोस्फीयर का विस्तार करने और न्यूरोस्फीयर-व्युत्पन्न कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए अनुयायी स्थितियों में बदलने की अनुमति देता है। हालांकि, इसकी सीमाएं हैं जैसे कि न्यूरोजेनिक क्षमता में कमी, जो इन विट्रो स्थितियों12के अनुकूलन प्रतिक्रिया के रूप में लगातार मार्ग पर ग्लियोजेनिक भेदभाव पर स्विच करती है। इस कारण से, हमने प्राथमिक संस्कृति और मार्ग 1 में न्यूरोस्फीयर की विशेषता की सिफारिश की, और अगले मार्ग को केवल तभी जारी रखें जब उन प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का विस्तार करने की आवश्यकता हो जिसमें उत्पत्ति के कारण मतभेदों को स्पष्ट करना शामिल न हो।

दिलचस्प बात यह है कि न्यूरोएनाटॉमिकल (वीजेड या डीजी) या सेक्स-निर्भर (महिला या पुरुष) स्रोत के परिणामस्वरूप न्यूरोस्फीयर की प्राथमिक संस्कृति में आंतरिक अंतर पाया जा सकता है। इस प्रकार, महिलाओं के दोनों न्यूरोजेनिक क्षेत्रों से प्राप्त न्यूरोस्फीयर की संख्या और व्यास पुरुषों की तुलना में अधिक हैं। यह पुरुषों की तुलना में महिला मस्तिष्क आला में एक कार्यात्मक अंतर हो सकता है, जिसे इस परख के साथ विट्रो में आणविक तंत्र का अध्ययन किया जा सकता है।

वयस्क मस्तिष्क वोल से प्राप्त न्यूरोस्फीयर की सेल संस्कृति एक मूल्यवान उपकरण है जो वीवो में अध्ययनों के बीच विसंगतियों को हल करने में मदद कर सकता है। उदाहरण के लिए, फाउंडर और सहकर्मियों ने बताया कि 48 घंटे के लिए सामाजिक अलगाव डीजी6को प्रभावित किए बिना वीजेड में 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (BrdU) )) पॉजिटिव कोशिकाओं में वृद्धि लाती है। इसके विपरीत, Lieberwirth एट अल.; डीजी13में सेल प्रसार में कमी का प्रदर्शन किया . इसके अलावा, इन विट्रो संस्कृति न्यूरोजेनिक क्षेत्रों में आणविक तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल हो सकती है जो प्रेयर वोल जैसे सामाजिक मॉडल में व्यवहार परिवर्तनों से जुड़ी हो सकती है। उदाहरण के लिए, यह सुझाव दिया गया है कि नवजात शिशुओं के संपर्क में आने से गैर-माता-पिता और पैतृक दोनों तरह के वोल्स में डीजी14में बीआरडीयू पॉजिटिव कोशिकाओं में वृद्धि होती है । इस अध्ययन के निष्कर्षों BrdU लेबलिंग के साथ हमारे सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है । हालांकि, हालांकि voles और अन्य स्तनधारियों पर अधिकांश अध्ययन नई कोशिकाओं की पहचान करने के लिए BrdU लेबलिंग का उपयोग करते हैं, एक नुकसान यह है कि इंजेक्शन खुराक15के आधार पर लैबबेलिंग बदल सकता है। एडू, एक और थायरिडीन एनालॉग, विट्रो संस्कृतियों में कोशिका चक्र चरण के तहत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक आदर्श विकल्प है। एक ही प्रयोग में, एडू के समावेश के लिए कई अवधियों का होना संभव है, और BrdU के विपरीत, डीएनए डेनैचुरेशन या एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन यह इसका पता लगाने के लिए आवश्यक नहीं है। इसके अलावा, EdU-सकारात्मक कोशिकाओं को कोशिका-विभाजन चक्र (Ki67) की पहचान करने और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं या जनक (नेस्टिन, Sox2 और Pax6) के मार्कर का उपयोग करके उनके फेनोटाइप का निर्धारण करने के लिए मार्कर के साथ सह-स्थानीयकरण के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है।

न्यूरोस्फीयर संस्कृति को प्रसार दर में हार्मोन, छोटे अणुओं या दवाओं के प्रभाव, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और प्रेयर वोल्स के जनकों में न्यूरोजेनेसिस और एपिजेनेटिक संशोधनों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में स्थापित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों ने प्रेयर वोल्स में वयस्क न्यूरोजेनेसिस के नियमन में तनाव हार्मोन (कोर्टिकोस्टेरोन की तरह) और एस्ट्रोजेन की भूमिका का सुझाव दिया है, लेकिन अंतर्निहित नियामक तंत्र अज्ञात6हैं।

अंत में, ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार (एएसडी) और सिजोफ्रेनिया (एसजेड) सामाजिक अनुभूति16, 17में हानि से संबंधित हैं। दिलचस्प बात यह है कि ऑक्सीटोसिन और आर्जिनिन-वासोप्रेसिन की सामाजिक और भावनात्मक व्यवहार में मौलिक भूमिका है, और उनके रिसेप्टर्स (ऑक्सटीआर और वासोप्रेसिन 1ए (वी1एआर) में जीन अभिव्यक्ति क्रमशः एएसडी और एसजेड18, 19,20, 21दोनों से जुड़ेहुएहैं। इसके अलावा , न्यूरोडेनेसिस में परिवर्तन और तंत्रिका प्रवास न्यूरोडेवलपमेंट के दौरान इन व्यवहार विकारों के फिजियोपैथोलॉजी में फंसाया जाता है22,23,24. इस प्रकार, हम न्यूरोजेनेसिस, तंत्रिका प्रवास और अन्य सेलुलर घटनाओं पर इन हार्मोनों द्वारा मध्यस्थता किए गए आणविक तंत्र का विश्लेषण करने का प्रस्ताव करते हैं जिनके परिवर्तन प्रेयर वोल सेल संस्कृति का उपयोग करके न्यूरोलॉजिकल विकारों से संबंधित हैं, क्योंकि ऑक्सटीआर और वी 1आर रिसेप्टर्स प्रेयर वोले हिप्पोकैम्पस25,26में पाए जाते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को अनुदान CONACYT 252756 और 253631 द्वारा समर्थित किया गया था; यूएनएम-डीजीपा-पपिट IN202818 और IN203518; INPER 2018-1-163, और NIH P51OD11132। हम डेसी गैस्का, कार्लोस लोजानो, मार्टिन गार्सिया, एलेजैंड्रा कैस्टिला, निडिया हर्नांडेज, जेसिका नॉरिस और सुजाना कास्त्रो को उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies Antibody ID
Anti-Nestin GeneTex GTX30671 RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin MERCK AB2253 RRID:AB_1586992
Anti-Ki67 Abcam ab66155 RRID:AB_1140752
Anti-MAP2 GeneTex GTX50810 RRID:AB_11170769
Anti-GFAP SIGMA G3893 RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11073 RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17504044 50X
Collagenase, Type IV Thermo Fisher Scientific/Gibco 17104019 Powder
Dispase Thermo Fisher Scientific/Gibco 17105041 Powder
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific/Gibco 11330032
Glucose any brand Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific/Gibco 35050061 100X
HEPES any brand Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin Corning 354232 1 mg/mL
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17502048 100X
NAHCO3 any brand Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal Thermo Fisher Scientific/Gibco 21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P3655 Powder
Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic Peprotech AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific/Gibco A1110501 100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning/Costar 3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
40 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352340 Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore Corning 431118 PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore Merk Millipore SLGPR33RB Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula

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References

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Ávila-González, D., Young, L. J., Camacho, F., Paredes, R. G., Díaz, N. F., Portillo, W. Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles. J. Vis. Exp. (160), e61402, doi:10.3791/61402 (2020).

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