Summary
הקמנו את התנאים לתאי האבות העצביים של התרבות מהתת-ונטריקולרי ולתהדר את המוח הבוגר של הערבה, כמשלים במחקר מבחנה, כדי לנתח את ההבדלים התלויים במין בין גומחות נוירוגניות שיכולות להיות חלק משינויים פלסטיים פונקציונליים הקשורים להתנהגויות חברתיות.
Abstract
נוירוספירות הן אגרגטים של תאים עיקריים המרכיבים תאי גזע עצביים ותאי ם. מבנים תלת-מית-מיוד אלה הם כלי מצוין כדי לקבוע את פוטנציאל ההבידול וההתפשטות של תאי גזע עצביים, כמו גם ליצור קווי תאים ממה שניתן לומר לאורך זמן. כמו כן, נוירוספירות יכולות ליצור נישה (במבחנה) המאפשרת מידול של הסביבה המשתנה דינמי, כגון גורמי גדילה שונים, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, בין היתר. מיקרוטוס ochrogaster (בערבה vole) הוא מודל ייחודי להבנת הבסיס הנוירוביולוגי של התנהגויות חברתיות-מיניות וקוגניציה חברתית. עם זאת, המנגנונים הסלולריים המעורבים בהתנהגויות אלה אינם ידועים היטב. הפרוטוקול נועד להשיג תאים עצביים האבות מן הנישות הנוירוגניות של vole הערבה למבוגרים, אשר תרבותיים בתנאים שאינם דבקים, כדי ליצור נוירוספירות. הגודל והמספר של נוירוספירות תלויים באזור (אזור תת-זוויתי או גירוס דנת) ומין של vole הערבה. שיטה זו היא כלי יוצא דופן כדי ללמוד הבדלים תלויי מין נישות נוירוגניות במבחנה ואת השינויים neuroplasticity הקשורים התנהגויות חברתיות כגון מליטה זוג וטיפול דו-הורנטלי. כמו כן, ניתן לבחון מצבים קוגניטיביים הכרוכים בגירעונות באינטראקציות חברתיות (הפרעות בספקטרום האוטיסטי וסכיזופרניה).
Introduction
הערבה וול(Microtus ochrogaster),חברה בממשפחה קריסטיידה, היא יונק קטן שאסטרטגיית חייו מתפתחת כזן מונוגמי וחברתי מאוד. גם זכרים וגם נקבות יוצרים קשר זוגי מתמשך לאחר הזדווגות או תקופות ארוכות של חיים משותפים המאופיין בשיתוף הקן, בהגנה על הטריטוריה שלהם, והצגת טיפול דו-רנטליעבור ציניהם 1,2,3,4. לכן, vole הערבה הוא מודל בעל ערך להבנת הבסיס הנוירוביולוגי של התנהגות חברתית-מינית וליקויים בקוגניציהחברתית 5.
נוירוגנזה למבוגרים היא אחד התהליכים החשובים ביותר של פלסטיות עצבית שמובילה לשינויים התנהגותיים. לדוגמה, קבוצת המחקר שלנו דיווחה בגברים כי שיתוף פעולה חברתי עם הזדווגות גדל התפשטות תאים באזור subventricular (VZ) ואת האזור subgranular ב גירוס dentate (DG) של ההיפוקמפוס, מציע כי neurogenesis למבוגרים יכול לשחק תפקיד בהתהוות של מליטה זיווג המושרה על ידי הזדווגות בערבה voles (נתונים שלא פורסם). מצד שני, למרות אזורי המוח שבו נוירונים חדשים נוצרים ומשולבים ידועים היטב, המנגנונים המולקולריים והסלולריים המעורבים בתהליכים אלה נשארים לא נקבעו בשל חסרונות טכניים בכל מודל המוח6. לדוגמה, מסלולי האיתות השולטים בביטוי גנים ובפעילויות תאיות אחרות יש תקופת הפעלה קצרה יחסית (זיהוי של פוספורוטום)7. מודל חלופי אחד הוא מבודד ותרבותי תאי גזע עצביים למבוגרים או תאים רבי דרך כדי להברר רכיבים מולקולריים מעורבים neurogenesis למבוגרים.
הגישה הראשונה לשמור על מבשרים עצביים מבחנה ממוח יונקים בוגרים (עכבר) הייתה ההסתה של נוירוספירות, שהם אגרגטים תאיים הגדלים בתנאים שאינם דבקים אשר משמרים את הפוטנציאל הרב-תכליתי שלהם ליצור נוירונים,כמו גם אסטרוציטים 8,9,10. במהלך הפיתוח שלהם, יש תהליך בחירה שבו רק מבשרים יגיבו מיטוגנים כגון גורם גדילה אפידרמיס (EGF) ופיברובלסט גורם גדילה 2 (FGF2) כדי להתרבות וליצור נוירוספירות8,9,10.
למיטב ידיעתנו, לא דווח על פרוטוקול בספרות כדי להשיג אנשים עצביים בוגרים מ"ערבה וול". כאן, ביססנו את תנאי התרבות כדי לבודד אבות עצביים מתוך נישות נוירוגניות ותחזוקת המבחנה שלהם באמצעות היווצרות נוירוספרה. לפיכך, ניתן לתווך ניסויים כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים והסלולריים המעורבים בהתפשטות, הגירה, בידול והישרדות של תאי גזע עצביים וקרבות, תהליכים שעדיין אינם ידועים בערבה. יתר על כן, ההברה בהבדלים במבחנה במאפייני התאים הנגזרים VZ ו- DG יכול לספק מידע על התפקיד של נישות נוירוגניות ב פלסטיות עצבית הקשורים לשינויים בהתנהגות חברתית-מינית והתנהגויות קוגניטיביות, וגירעונות באינטראקציות חברתיות (הפרעת הספקטרום האוטיסטי וסכיזופרניה), אשר יכול להיות גם תלוי מין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המחקרית של המשקעים לנוירוביולוגיה, אוניברסיטת נאסיונאל אוטונומה דה מקסיקו, מקסיקו והמשקע הלאומי של פריאנטולוגיה (2018-1-163). הרבייה, הטיפול ונקודות הקצה ההומניות של בעלי החיים הוקמו על פי התקן המקסיקני הרשמי (NOM-062-Z00-1999) המבוסס על "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (חוק הבריאות הכללי לחקר הבריאות) של מזכירות הבריאות המקסיקנית.
1. הכנת פתרונות ומניות
- להכין מדיום תרבות N2 עם 485 מ"ל של הנשר שונה של Dulbecco בינוני-F12 (DMEM-F12), 5 מ"ל של N2 תוספת (100x), 5 מ"ל של תוסף גלוטמין (100x) ו 5 מ"ל של אנטיביוטי אנטימיקוטי (100x).
- להכין B27 תרבות בינונית עם 480 מ"ל של Neurobasal בינוני, 10 מ"ל של תוספת B27 (50x), 5 מ"ל של תוסף גלוטמין, ו 5 מ"ל של אנטיביוטי אנטיביוטי אנטימיקוטי (100x).
- אבקת קולגנאז מחדש ב- 1 pBS (תמיסת מלח עם אגירה פוספט) כדי להשיג aliquots עם פעילות של 100 יחידות / μL (1000x) ולאחסן ב -20 °C. שימו לב, פעילות הקולג'נאז תלויה במספר החברות.
- להכין את ההפחתה של מניות aliquots על ידי המסת 5 מ"ג של אבקת דיספסה ב 1x PBS (50 מ"ג / מ"ל). לאחסן ב -20 °C.
- להכין פתרון אנזימטי עם 100 מ"ל של DMEM-F12 בינוני, 50 μL של collagenase מניות (100 יחידות / μL) יש ריכוז סופי של 50 U /mL ו 333 μL של מניות dispase (50 מ"ג/ מ"ל) יש ריכוז סופי של 0.33 מ"ג / מ"ל.
- כדי להכין פתרון כביסה, ל-1,000 מ"ל של 1x PBS, להוסיף 0.4766 גרם של HEPES (ריכוז סופי 2 מ'), 3.6 גר' של D-גלוקוז (ריכוז סופי 20 מ"ר) ו-2.1 גרם של NaHCO3 (ריכוז סופי 25 מ"ר).
- הכן aliquots מניות פולי-L-ornithine (1 מ"ג / מ"ל) באמצעות מים סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
- הכן פתרון עבודה של פולי-L-ornithine. לדלל aliquot מניות (1 מ"ג / מ"ל) ב 49 מ"ל של מים סטריליים לריכוז סופי של 20 μg / מ"ל.
- הכן פתרון עבודה של למינין. לדלל 25 μL של למינין (1 מ"ג / מ"ל המקורי) ב 5 מ"ל של מים סטריליים עבור ריכוז סופי של 5 μg / מ"ל.
הערה: לאחר ההכנה, סנן את אמצעי התקשורת של התרבות, העבודה ופתרונות המלאי כדי למנוע זיהום. השתמשו במסנני ואקום מזרק או בקבוק עליון (קרום פוליאתרסולפון עם גודל נקבוביות של 0.2 μm). ניתן לאחסן את אמצעי התקשורת התרבות ופתרונות העבודה עד 30 יום ב- 4 °C, בעוד שניתן לאחסן את המניות עד ארבעה חודשים ב- -20 °C.
2. הכנה לפני תחילת microdissection
- לחטא כלי ניתוח על ידי autoclaving או עם מחטא חרוז זכוכית חמה יבש.
- נקה את שטח פני השטח של מיקרודיסטיסציה בתנאים קשים של אספטיים ודיספטיים (לדוגמה, עם מים אוזוניים).
הערה: התזמון של microdissection של שני נישות נוירוגניות מכל מוח vole הוא כ 30 דקות. מומלץ לעבוד עם 1-4 בעלי חיים לכל ההליך.
3. חילוץ של המוח כולו
- להרדים את vole למבוגרים (12-16 שבועות) עם מנת יתר של פנטוברביטל (6.3 מ"ג / בעלי חיים) באמצעות הזרקת תוך אפרטונל. ודא את עומק ההרדמה על-ידי היעדר רפלקס פדלים בתגובה לצביטת בהונות מוצקה.
- ברגע שהוול מותם לחלוטין, לגרום המתת חסד על ידי עריפת ראש ולהחלים את הראש.
- לנתח את העור מהגולגולת עם מספריים, מה שהופך חתך סיבתי-rostral (15 מ"מ ארוך) כדי לחשוף את הגולגולת.
- חותכים את העצמות העורפיות והבין-פטריאליות ומאתרים חתך בגולגולת לאורך התפרים הסגית והקודקודית.
- לעשות חור בגולגולת בצומת של עצמות פרונטליות וקודקודיות באמצעות מספריים, להיות זהיר מאוד לא לפגוע ברקמת המוח.
- כדי לחשוף את המוח, הסר את שברי הגולגולת הנותרים שמכסים את שתי ההמיספרות במוח בפינצטה חדה.
- השתמש מרית נירוסטה כדי להרים את כל המוח מבסיס הגולגולת.
- לאסוף את המוח לתוך צינור צנטריפוגה (50 מ"ל) עם 20 מ"ל של פתרון כביסה קרה.
- לשטוף את המוח פעמיים עם תמיסת השטיפה הקרה.
4. מיקרודיסציה של הרקמה העצבית
- מניחים צלחת פטרי על משטח מוקף קרח.
- מפקידים את המוח על הצלחת ומוסיפים 20 מ"ל של תמיסת שטיפה קרה.
- עם אזמל, במטוס הקורונה, לחלק את המוח לשני בלוקים של רקמה (rostral וcaudal). כהתייחסות נוירואנאטומית, לבצע את חיתוך הקורונה ברמת Bregma בציר הקדמי-אחורי11 (איור 1A,קו מוצק).
- מבלוק rostral, לחלץ את רקמת VZ (איור 1B), בעוד מן הבלוק סיבתי להסיר את DG (איור 1C).
- לנתח את VZ תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- עם מפס דומונט, החזק את אחת ההמיספרות; לאחר מכן, הכנס, בשיא החדר, את הקצוות העדינים של מקצות דומונט שני מתחת לרקמות הקווים caudate-putamen(איור 2A).
- פתח את הממחצות לאורך ציר דורסווונטרל כדי להפריד את הרקמה.
- לאסוף את רקמת VZ לכל אדם בצינור צנטריפוגה עם 2 מ"ל של פתרון כביסה קרה. אין לאסוף את הרקמה של יותר משתי חיות.
- חזור על המיקרו-דיסציה בחצי הכדור השני.
- לאחסן את הצינור המכיל את רקמת VZ דו-צדדית על קרח ולהמשיך לנתח את DG.
- לנתח את DG מבלוק סיבתי תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- עם אזמל, לעשות חיתוך קורונלי לתוך הבלוק כדי להשיג שתי פרוסות, שבו היווצרות ההיפוקמפוס נצפתה. כציון דרך, החתך נעשה ב -2 מ"מ Bregma קואורדינטות בציר הקדמי-אחורי על פי אטלסמוח העכבר 11 (איור 1A, קו מנוקד איור 1C).
- עם מקציצות דומונט, החזק את אחת הפרוסות, ועם מקצות דומונט נקודה עדינה לעשות חתך אופקי בין DG ו CA1 ולאחר מכן לבצע חתך אנכי בין DG ו CA3 כדי להפריד את DG (איור 2B).
- חזור על החתך בפרוסה הראשונה של חצי הכדור השני.
- חזור על החתך בשתי ההמיספרות בפרוסה השנייה.
- לאסוף את ארבע חתיכות DG של כל vole בצינור צנטריפוגה. אין לאסוף את רקמת ה-DG של יותר משתי חיות.
הערה: אם יש צורך בניתוח של יותר מלחיות אחד, יש לאחסן את צינורות הצנטריפוגה עם רקמת VZ או DG על קרח תוך המשך ניתוח שאר המוח. הסר את כל כלי הדם שמכסים את רקמת המוח בזמן ה ניתוח. אם כלי הדם לא נזרקים, התרבות יכולה להיות מעורבת עם עודף של אריתרושיטים ולהפריע היווצרות נוירוספרה.
5. בידוד תאים עצביים
- מניחים את צינורות הצנטריפוגה בתוך ארון ההשבחה הביולוגית והמתינו כ-10 דקות עד שרסיסי הרקמה יאיצו מכוח הכבידה.
- הסר את תמיסת השטיפה והוסף 1 מ"ל של הפתרון האנזימטי החם לכל שפופרת.
- דגירה את הצינורות ב 37 ° C במשך 10 דקות.
- לפורר את שברי הרקמה; פיפטה למעלה ולמעלה עם קצה של מ"ל אחד. אין פיפט יותר מ 30x.
- לבצע דגירה שנייה של 10 דקות ב 37 °C.
- בסוף הדגירה השנייה, פיפטה לשבור את הרקמות. אין פיפט יותר מ 30x.
הערה: לאחר pipetting, שברי הרקמה צריך להיות התפורר לחלוטין; אם הם לא התפוררו, דגירה עוד 10 דקות ב 37 °C ו-re-pipette. תקופת העיכול לא צריכה לחרוג מ-30 דקות. - להוסיף 9 מ"ל של N2 בינוני לכל שפופרת כדי לדלל את הטיפול האנזימטי.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 200 x g עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר.
- השליכו את הסופרנטנט ושטפו עם 10 מ"ל של N2 בינוני.
- צנטריפוגה באותם תנאים כמו שלב 5.8.
- הסר את supernatant מכל צינור ולתחות מחדש את כדורי התא של VZ ו DG ב 2 מ"ל ו 1 מ"ל של B27 בינוני, בהתאמה.
- כדי להסיר כל רקמה לא מפורקת, לסנן כל מתלה תאי באמצעות מסננת תא (גודל 40 μm).
6. היווצרות נוירוספירות
- תרבות התאים עברו דרך מסננת לחיבור אולטרה נמוך, צלחת 24 באר. השתמש בשתי בארות עבור VZ ואחד באר עבור DG (1 מ"ל של B27 בינוני / באר).
- להוסיף 20 ng/mL של FGF2 ו 20 ng/mL של EGF לכל באר (ריכוז סופי 1x).
- דגירה ב 37 °C, 5% CO2 ולחות גבוהה (90-95%). נא לא להפריע במשך 48 שעות (יום 1 ויום 2 של תרבות, D1-D2).
- ביום השלישי (D3), להסיר מחצית מדיום התרבות ולהחליף אותו עם טרי B27 בינוני (500 μL לבאר) בתוספת ריכוז כפול (2x) של גורמי גדילה.
- חזור על כל יום שלישי, לשנות את מדיום התרבות (חצי ממנו) ולהחליף אותו עם בינוני B27 טרי בתוספת ריכוז כפול (2x) של גורמי גדילה.
- בימים בהם אין צורך לשנות את מדיום התרבות, להוסיף גורמי גדילה לריכוז הסופי של 1x.
- ודא כי נוירוספירות נוצרים סביב D8-D10.
- ב D10, לשנות את מדיום התרבות המלאה כדי להסיר את כל הפסולת.
- לאסוף את המדיום ונוירוספירות בנפרד של כל באר בצינורות צנטריפוגה.
- דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הליך זה מאפשר נוירוספירות משקעים על ידי כוח המשיכה.
- הסר את supernatant וssuspend ב 1 מ"ל של B27 טרי בינוני בתוספת עם גורמי גדילה.
- הנח את הנוירוספירות בחזרה לאותה צלחת חיבור אולטרה-נמוכה ותדגרה ב-37°C, 5% CO2.
- מ- D10 ל- D15, המשך לשנות מחצית מהמדיום ולהוסיף גורמי גדילה.
7. מעבר של הנוירוספירות
- ב D15 של התרבות העיקרית, לאסוף את הנוירוספירות לתוך צינורות צנטריפוגה באמצעות 1 מ"ל פיפטה. חותכים את קצה פיפטה כדי להגדיל את גודל הפתח כדי למנוע נזק לנוירוספירות.
- דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. נוירוספירות מזרזות על ידי כוח המשיכה.
- הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של אמצעי הניתוק התא לכל שפופרת.
- דגירה את הצינורות במשך 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- פיפטה למעלה ולמעלה עם קצה של מ"ל אחד כדי לפרק את הנוירוספירות.
- לדלל את אמצעיניתנית התא עם 3 מ"ל של B27 בינוני לכל שפופרת.
- צנטריפוגה מתלי התא במשך 5 דקות ב 200 x g.
- השליכו את הסופרנטנט והתווסתו מחדש על כל כדור תא עם מדיום B27 טרי בתוספת גורמי גדילה.
- תוסתה מחדש את התאים המופקים מ-VZ ב-4 מ"ל של תאים בינוניים ותאים המופקים מ-DG ב-2 מ"ל של מדיום.
- תרבות התאים (מעבר 1) בצלחת חדשה אולטרה נמוכה מצורף על ידי הכפלת מספר הבארים ששימשו בתרבות העיקרית (4 ו 2 בארות עבור VZ ו DG, בהתאמה).
- לשנות מחצית המדיום כל יום שלישי ולהוסיף גורמי גדילה מדי יום.
- לאחר 10 ימים (D10) במעבר 1, יש לשנות את התנאים הדבקים במעבר הבא.
8. המעבר בתנאים דבקים
- לפני ביצוע המעבר 2, להכין צלחות מצופה עם פולי-L-ornithine ולמינין.
- ב 24-גם צלחות, להוסיף 500 μL של 1 פולי-L-ornithine (20 μg / מ"ל) לכל באר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בלילה.
- הסר את הפולי-L-ornithine ולשטוף 4x עם 1 pBS (500 μL / גם).
- להוסיף 200 μL (נפח מינימלי כדי לכסות את פני השטח של באר אחת) של 1x למינין (5 μg / מ"ל) לכל באר דגירה במשך 2-3 שעות ב 37 ° C לפני טיפוח התאים.
- לאסוף את הנוירוספירות עם פיפטה 1 מ"ל עם טיפים לחתוך לתוך צינור צנטריפוגה.
- דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרז את הנוירוספירות על ידי כוח הכבידה.
- השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את הנוירוספירות במדיום B27 טרי ללא גורמי גדילה.
- לשאוף את ה למינין מהצלחת המצופה ולהפקיד את neurospheres לתוך הבארות באמצעות 1 מ"ל pipettes עם טיפים לחתוך.
הערה: למנוע בארות מצופה מתייבש בין הסרת למינין וציפוי נוירוספירות. - לחלק את התרבות לשני תנאים:
- לשמור על נוירוספירות מובינות במשך 6 ימים (D6). לשנות את המדיום כל יום שלישי ולהוסיף גורמי גדילה מדי יום.
- צפה בהבדיל של התאים הנגזרים נוירוספרה על ידי 12 ימים (D12). לשנות את המדיום כל יום שלישי ללא גורמי גדילה.
הערה: בסוף D6 עבור D12 מוערך או D12 עבור תנאי בידול, התאים יכולים לשמש עבור חיסונים קונבנציונליים, ניתוח מיון תאים, 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) כתם, חילוץ RNA, בין היתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נוירוספירות נוצרו מתאי גזע עצביים מבודדים VZ ו DG של שני זכר ערבה voles. כ 8-10 ימים לאחר תחילת התרבות, תאים היו צריכים להקים את הנוירוספירות. שים לב כי הלוח עשוי להכיל פסולת בתרבות העיקרית(איור 3A). עם זאת, בפסקה 1 התרבות צריכה להיות מורכבת רק נוירוספירות(איור 3B).
מספר גבוה יותר של נוירוספירות הושגו VZ הנשי לעומת VZ זכר DG של נקבות וזכרים(איור 4A). נתונים אלה מצביעים על כך שמספר הנוירוספירות שהושגו תלוי באזור ההתפשטות ומין הוול. ברגע שהנוירוספירות הופיעו (D8-D10), הם נשמרו במשך שבעה ימים נוספים בתרבות, והצמיחה שלהם הייתה במעקב בתקופה זו. קוטר הנוירוספירות נמדד על D8, D11 ו- D14 (טבלה 1 ואיור 4B). גודלה של הנוירוספרה (קוטר) גדל בהדרגה בהתאם לימי התרבות של גברים ונשים בשני האזורים העצביים. נוירוספירות הנגזרות מהמוח הגברי היו קטנות יותר בהשוואה לנוירוספירות הנגזרות מהמוח הנשי בשני האזורים הנוירוגניים(איור 4B).
לאחר 15 ימים של תרבות ראשונית בתנאים צפים, הנוירוספירות הורחבו במעבר 1 באותם תנאים. בפסקה הבאה 2 גדלו התאים בתרבית הדבקה, אם כי הם הצליחו לדבוק מאז המעבר הראשון. נוירוספירות דבקים התאפיינו ביום השישי (D6) בנוכחות גורמי גדילה (מצב לא מוערך, איור 5A)או במקום זאת עד היום 15 (D15) ללא גורמי גדילה (מצב מובדיל, איור 5B).
ב D6 בתנאים לא מושונים, התאים הנגזרים נוירוספרה הביעו nestin (סמן עבור אבות עצביים) (איור 6). כמו כן, ניתן היה לזהות תאים חיוביים doublecortin (DCX) (תאי הגירה) ואת סמן ההתפשטות Ki67, אשר מצביעים על הנוכחות של מבשרים עצביים או נוירונים לא בוגרים. עם זאת, חוסר colocalization של Ki67 עם DCX מצביע על הנוכחות של נוירובלסטים פוסט מיתיים (איור 7). לבסוף, ב D15 תחת תנאי בדיל, נוירונים בוגרים (תאים MAP2 חיובי) נמצאו, כמו גם תאים עם פנוטיפ גליה (תאים חיוביים GFAP), אשר מדגים פוטנציאל בדיל של התאים המבודדים (איור 8).
איור 1: מבט דורסל על מוח vole למבוגרים ואזורים נוירוגניים שלה. (א)הקו המוצק ברמת Bregma היה התייחסות אנטומית להפריד את המוח לשני בלוקים, rostral וcaudal. הקו המקוקד היה ההפניה לחלק את בלוק סיבתי כדי לקבל שתי פרוסות המכילות את DG. (ב)מבט קורונלי של האזורים העצביים שנחשפו עם החתך הראשון, שבו VZ ממוקם. (ג)מבט קורונאלי על האזורים האנטומיים שנחשפו עם החתך השני, שבו ממוקם DG. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הפניות אנטומיות לניתוק של אזורים נוירוגניים. (א)ערכה ותצלום של קטע הקורונה מבלוק rostral המציג את המיקום VZ (קו מנוקד). (ב)תכנית ותצלום של סעיף הקורונה מבלוק caudal מראה את ניתוח DG. מעבד, קואדטה פוטמן; וי, חדר הלב; VZ, אזור החדר, DG, גיזור דנטה; CA1 ו-CA3, אזורים של ההיפוקמפוס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיקרוגרפים מייצגים של תרבות נוירוספירות הנגזרות ממנושות נוירוגניות של הערבה הבוגרת. (א)תרבות ראשונית של נוירוספירות מבודדות מVZ של voles נקבה ב D10. (ב)מעבר 1 של נוירוספירות נגזר VZ של voles נקבה ב D10. Scale ברים = 200 μm. n = 3 עבור כל אזור נוירוגני ומין של vole. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: המספר והגודל של נוירוספירות היו תלויים הן במין והן במקור נוירוגני. (א)מספר הנוירוספירות בתרבות העיקרית המתקבלת מ-VZ ו-DG הן ב-D10. הנתונים נותחו עם ANOVA חד-כיוון ואחריו בדיקות פוסט הוק של טוקי. נמצאו הבדלים משמעותיים בין VZ הנשי לבין שאר הקבוצות, ***p<0.001. (ב)הקוטר של הנוירוספירות ברחבי D8-D14 בתרבות העיקרית היה תלוי המין vole. הנתונים נותחו עם ANOVA דו-דרך ואחריו בדיקות פוסט הוק של טוקי. השוואות פנים-קבוצתיות (הבדלים בתוך אותה קבוצה) הראו עלייה בגודל הנוירוספרה בין D8 לעומת D11 ו- D14, (*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001); ו- D11 לעומת D14 (+++ p<0.001) ב- VZ ו- DG של נקבות וזכרים. השוואה בין קבוצות (הבדלים בין קבוצות באותו אזור) הראתה כי נוירוספירות VZ ו-DG נשיות גדולות יותר מנוירות עצביות גבריות ב-D11 ו-D14. ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, ת"א 125 VZ הושג מזכרים ונקבה (n = 3, לכל קבוצה). 15 נשים ו-10 נוירוספירות גבריות נותחו. DG הושג מזכרים ונקבה (n = 3, לכל קבוצה). 8 נוירוספירות נשיות ו-5 נוירוספירות גבריות עובדו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תמונות מייצגות של נוירוספירות הנגזרות מה-VZ הנשית, התורבה בתנאי הדבקה במעבר 2. (א)נוירוספירות דבקו במעבר 2 עם גורמי גדילה ב D2. (ב)תאים נגזרים נוירוספרה דבק במעבר 2 ללא גורמי גדילה ב D10. סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: ביטוי של קינין בנוירוספירות. מייצג, epifluorescence-מיקרוסקופיה תמונות של תאים nestin חיובי נגזר VZ של המוח הבוגר הן נקבה וזכר בשלב לא מוערך. קנה מידה של פסים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: ביטוי של DCX ו- Ki67 בנוירוספירות. תמונות מייצגות של אפיפלואורסצנטיות-מיקרוסקופיות של תאים די.סי.אקס, Ki67-חיוביים ומיזוג הנגזר מ-VZ של מוחות נשיים בוגרים וזכרים בשלב לא מובחנים. קנה מידה ברים = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8: ביטוי של MAP2 ו- GFAP בנוירוספירות. נציג, epifluorescence-מיקרוסקופיה תמונות של MAP2 (נוירונים בוגרים) ו GFAP (תאי גליה) תאים חיוביים נגזר VZ של המוח הנשי והזכר הבוגרים בשלב ההבדיל. קנה מידה של פסים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
| גודל נוירוספירות (μm) | |||||
| וי.וי.ז' | Dg | ||||
| ימי תרבות | סקס | SD ± מתכוון | ימי תרבות | סקס | SD ± מתכוון |
| D8 (100) | פ | 102.1±18.2 | D8 (100) | פ | 23:00:00 ±0:00 |
| מ | 23:00:00 - ± | מ | 37.6±6.8 | ||
| ד11 (11) | פ | 22:00:00 ±35.7 | ד11 (11) | פ | 23:00:00 ±15:49 |
| מ | 158.9±47.2 | מ | 71.8±14.4 | ||
| ד14 (D14) | פ | 306.6±44.4 | ד14 (D14) | פ | 243.8±37.4 |
| מ | 210.8±42.3 | מ | 120.2±19.1 | ||
טבלה 1: כימות הגודל הממוצע (קוטר) של נוירוספירות מבודדות מנישות נוירוגניות בתרבות העיקרית. הבדלים משמעותיים מוצגים באות 4. VZ הושג מזכרים ונקבה (n = 3, לכל קבוצה). 15 נוירוספירות מנקבות ועשרה מזכרים נותחו. DG הושג מזכרים ונקבה (n = 3, לכל קבוצה). שמונה נוירוספירות נשיות וחמש נוירוספירות גבריות עובדו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלב כדי להשיג תרבות תאי גזע עצביים היא תקופת העיכול עם הפתרון אנזימטי, אשר לא צריך לחרוג יותר מ 30 דקות כי זה עלול להקטין את הכדאיות של התא. נוירוספירות צריך להופיע ב 8-10 ימים לאחר התרבות הראשונית; אם הם לא יופיעו ביום ה-12, בטלו את התרבות וחזרו על הניסוי, תוך צמצום תקופת העיכול. בעיה נוספת היא כלי הדם שמכסים את רקמת המוח. הם צריכים להיות מוסרים לחלוטין במהלך הפעולה כי עודף של אריתרושיטים יכול להפריע היווצרות נוירוספירות.
פרוטוקול זה מאפשר להרחיב את הנוירוספירות הצפות עד מעבר 2 ומעבר לתנאים דבקים כדי להעריך את התאים הנגזרים נוירוספרה. עם זאת, יש לו מגבלות כגון ירידה בפוטנציאל הנוירוגני, אשר עובר הבידול גליוגניים במעברים רצופים כתגובה הסתגלות בתנאי המבחנה12. מסיבה זו, המלצנו לאפיין את הנוירוספירות בתרבות הראשית ומעבר 1, ולהמשיך עם המעבר הבא רק אם הוא נדרש להרחיב את התאים לניסויים שלא כרוכים בהברת הבדלים בשל המקור.
מעניין, הבדלים פנימיים ניתן למצוא בתרבות העיקרית של נוירוספירות כתוצאה נוירואנטומי (VZ או DG) או מין תלוי (נקבות או זכרים) מקור. לכן, המספר והקטר של נוירוספירות נגזר משני האזורים הנוירוגניים של הנקבות גבוהים יותר בהשוואה לגברים. זה יכול להיות הבדל פונקציונלי בנישה המוח הנשי לעומת זה אצל זכרים, אשר מנגנונים מולקולריים ניתן ללמוד במבחנה עם כך.
תרבות התא של נוירוספירות נגזר vole המוח הבוגר הוא כלי רב ערך שיכול לעזור לפתור פערים בין מחקרים vivo. לדוגמה, פאולר עמיתים לעבודה דיווחו כי בידוד חברתי במשך 48 שעות גורם לעלייה בתאים 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-חיוביים בVZ, מבלי להשפיע על DG6. לעומת זאת, ליברווירט ואח'; הפגין ירידה בהתפשטות תאים ב DG13. יתר על כן, בתרבות המבחנה יכול להיות מודל להערכת המנגנונים המולקולריים באזורים נוירוגניים שיכולים להיות קשורים לשינויים התנהגותיים במודל חברתי כגון vole הערבה. לדוגמה, הוצע כי חשיפה לילודים גורם, הן לא הורית והן בהורות, עלייה של תאים חיוביים BrdU ב DG14. הממצאים של מחקר זה ניתן לאשר באמצעות פרוטוקול תרבות התא שלנו עם תיוג BrdU. עם זאת, למרות שרוב המחקרים על voles ויונקים אחרים להשתמש תיוג BrdU כדי לזהות תאים חדשים, חיסרון הוא כי labbeling עשוי להשתנות בהתאם במינוניםמוזרקים 15. EdU, אנלוגי תימין אחר, היא חלופה אידיאלית לזהות תאים תחת שלב מחזור התא בתרביות המבחנה. באותו ניסוי, ניתן לערוך מספר תקופות להתאגדות של EdU, ובניגוד ל-BrdU, denaturation DNA או דגירה עם נוגדנים אין צורך בגילויו. כמו כן, תאים חיוביים EdU ניתן להעריך עבור התאמה מקומית שיתופית עם סמנים כדי לזהות את מחזור חלוקת תאים (Ki67) ולקבוע את הפנוטיפ שלהם באמצעות סמנים של תאי גזע עצביים או אבותים (Nestin, Sox2 ו Pax6).
תרבות הנוירוספירות יכולה להתבסס כמודל כדי ללמוד את ההשפעה של הורמונים, מולקולות קטנות או תרופות בשיעור ההתפשטות, neurogenesis ושינויים אפיגנטיים בתאי גזע עצביים וקרבות של ערבה voles. לדוגמה, מחקרים קודמים הציעו את התפקיד של הורמוני הלחץ (כמו קורטיקוסטרון) ואסטרוגנים ברגולציה של נוירוגנזה למבוגרים בערבה voles, אבל המנגנונים הרגולטוריים הבסיסיים אינםידועים 6.
לבסוף, הפרעות ספקטרום האוטיזם (ASD) וסכיזופרניה (SZ) קשורים לליקוייםבקוגניציה חברתית 16,17. מעניין, אוקסיטוצין וארגינין-vasopressin יש תפקיד בסיסי בהתנהגות חברתית ורגשית, וריאציות ביטוי גנים קולטנים שלהם (OXTR ו vasopressin 1a (V1AR), בהתאמה) קשורים הן ASD ו SZ18,19,20,21. יתר על כן, שינוי neurogenesis והגירה עצבית במהלך פיתוח עצבי מעורבים בפיזיופתולוגיה של הפרעות התנהגותיותאלה 22,23,24. לכן, אנו מציעים לנתח את המנגנונים המולקולריים בתיווך הורמונים אלה על neurogenesis, הגירה עצבית ואירועים תאיים אחרים אשר השינויים קשורים להפרעות נוירולוגיות באמצעות תרבות תא וול בערבה במודל מבחנה בשל קולטני OXTR ו V1AR נמצאים בהיפוקמפוס voleבערבה 25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים CONACYT 252756 ו 253631; אונום-דגפה-פאפיט ב-202818 וב-203518; INPER 2018-1-163, ו- NIH P51OD11132. אנו מודים דיסי גסקה, קרלוס Lozano, מרטין García, אלחנדרה קסטיליה, נדיה הרננדז, ג'סיקה נוריס וסוזן קסטרו על הסיוע הטכני המצוין שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
