Summary
Wir etablierten die Bedingungen zur Kultur neuronaler Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone und dentate Gyrus des erwachsenen Gehirns von Präriewühlmäusen, als ergänzende In-vitro-Studie, um die geschlechtsabhängigen Unterschiede zwischen neurogenen Nischen zu analysieren, die Teil funktioneller plastischer Veränderungen sein könnten, die mit sozialen Verhaltensweisen verbunden sind.
Abstract
Neurosphären sind primäre Zellaggregate, die neuronale Stammzellen und Vorläuferzellen umfassen. Diese 3D-Strukturen sind ein ausgezeichnetes Werkzeug, um das Differenzierungs- und Proliferationspotenzial neuronaler Stammzellen zu bestimmen und Zelllinien zu erzeugen, die im Laufe der Zeit untersucht werden können. Auch Neurosphären können eine Nische (in vitro) schaffen, die die Modellierung der dynamischen Veränderung sende Umgebung ermöglicht, wie verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Neurotransmitter, unter anderem. Microtus ochrogaster (Präriewühlmaus) ist ein einzigartiges Modell zum Verständnis der neurobiologischen Grundlagen sozio-sexueller Verhaltensweisen und sozialer Kognition. Jedoch, die zellulären Mechanismen in diesen Verhaltensweisen beteiligt sind nicht gut bekannt. Das Protokoll zielt darauf ab, neuronale Vorläuferzellen aus den neurogenen Nischen der erwachsenen Präriewühlmaus zu erhalten, die unter nicht anhaftenden Bedingungen kultiviert werden, um Neurosphären zu erzeugen. Die Größe und Anzahl der Neurosphären hängt von der Region (subventrikuläre Zone oder Dentate Gyrus) und Geschlecht der PrärieWühlmaus ab. Diese Methode ist ein bemerkenswertes Werkzeug, um geschlechtsabhängige Unterschiede in neurogenen Nischen in vitro und die Neuroplastizitätsänderungen im Zusammenhang mit sozialen Verhaltensweisen wie Paarbindung und biparentaler Pflege zu untersuchen. Auch kognitive Bedingungen, die Defizite in sozialen Interaktionen (Autismus-Spektrum-Störungen und Schizophrenie) mit sich bringen, könnten untersucht werden.
Introduction
Die Präriewühlmaus(Microtus ochrogaster), ein Mitglied der Familie der Cricetidae, ist ein kleines Säugetier, dessen Lebensstrategie sich als sozial monogame und hochgesellige Spezies entwickelt. Sowohl Männchen als auch Weibchen stellen eine dauerhafte Paarbindung nach der Paarung oder lange Zeiträume des Zusammenlebens durch die gemeinsame Nutzung des Nestes, Die Verteidigung ihres Territoriums, und die Darstellung biparentalpflegefürsorge für ihre Nachkommen1,2,3,4. Somit ist die Präriewühlmaus ein wertvolles Modell für das Verständnis der neurobiologischen Grundlagen des sozio-sexuellen Verhaltens und der Beeinträchtigungen der sozialen Wahrnehmung5.
Die adulte Neurogenese ist einer der wichtigsten Prozesse der neuronalen Plastizität, die zu Verhaltensänderungen führt. Zum Beispiel berichtete unsere Forschungsgruppe bei männlichen Wühlmäusen, dass das soziale Zusammenleben mit der Paarung die Zellproliferation in der subventrikulären Zone (VZ) und der subgranularen Zone im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus erhöht, was darauf hindeutet, dass die adulte Neurogenese eine Rolle bei der Bildung von Paarbindung spielen kann, die durch Paarung in Präriewühlmäusen induziert wird (unveröffentlichte Daten). Auf der anderen Seite sind zwar die Hirnregionen, in denen neue Neuronen erzeugt und integriert werden, bekannt, aber die molekularen und zellulären Mechanismen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, bleiben aufgrund technischer Nachteile im gesamten Gehirnmodell6unbestimmt. Zum Beispiel haben die Signalwege, die die Genexpression steuern, und andere zelluläre Aktivitäten eine relativ kurze Aktivierungszeit (Nachweis von Phosphoproteome)7. Ein alternatives Modell sind isolierte und kultivierte adulte neuronale Stammzellen oder Vorläuferzellen, um molekulare Komponenten aufzuklären, die an der adulten Neurogenese beteiligt sind.
Der erste Ansatz zur Aufrechterhaltung von in vitro neuronalen Vorläufern aus erwachsenen Säugetieren (Maus) Gehirn war der Assay von Neurosphären, die zelluläre Aggregate sind, die unter nicht-anhaftenden Bedingungen wachsen, die ihr multipotentes Potenzial zur Erzeugung von Neuronen, sowie Astrozyten8,9,10bewahren. Während ihrer Entwicklung gibt es ein Auswahlverfahren, bei dem nur die Vorläufer auf Mitogene wie epidermal growth Factor (EGF) und Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) reagieren, um sich zu vermehren und Neurosphären8,9,10zu erzeugen.
Nach unserem Wissen wird in der Literatur kein Protokoll berichtet, um erwachsene neuronale Vorfahren aus Präriewühlmäusen zu erhalten. Hier haben wir die Kulturbedingungen geschaffen, um neuronale Vorläufer aus neurogenen Nischen und deren In-vitro-Pflege durch den Neurosphärenbildungstest zu isolieren. So können Experimente entwickelt werden, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu identifizieren, die an der Proliferation, Migration, Differenzierung und überleben der neuronalen Stammzellen und Vorläufer beteiligt sind, Prozesse, die in der Präriewühlmaus noch unbekannt sind. Darüber hinaus könnte die Aufklärung von In-vitro-Unterschieden in den Eigenschaften der Zellen, die von der VZ und der GD abgeleitet wurden, Informationen über die Rolle neurogener Nischen in der neuronalen Plastizität liefern, die mit Veränderungen des sozio-sexuellen Verhaltens und kognitiven Verhaltens verbunden sind, und Defizite in sozialen Interaktionen (Autismus-Spektrum-Störung und Schizophrenie), die auch geschlechtsabhängig sein könnten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Studie wurde von der Forschungsethikkommission des Instituto de Neurobiologa, der Universidad Nacional Auténoma de México, Mexiko und des Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163) genehmigt. Die Fortpflanzung, Pflege und humane Endpunkte der Tiere wurden nach dem offiziellen mexikanischen Standard (NOM-062-Z00-1999) auf der Grundlage der "Ley General de Salud en Materia de Investigacion para la Salud" (Allgemeines Gesundheitsgesetz für Gesundheitsforschung) der mexikanischen Gesundheitsgeheimnisaria festgelegt.
1. Lösungen und Lagervorbereitung
- Bereiten Sie ein N2-Kulturmedium mit 485 ml Dulbeccos Modifiziertem Adler Medium-F12 (DMEM-F12), 5 ml N2-Ergänzung (100x), 5 ml Glutamin-Ergänzung (100x) und 5 ml Antibiotika-Antimykotik (100x) vor.
- Bereiten Sie ein B27-Kulturmedium mit 480 ml neurobasalen Medium, 10 ml B27-Ergänzung (50x), 5 ml Glutamin-Ergänzung und 5 ml Antibiotikum (100x).
- Kollagennasepulver in 1x PBS (Phosphat-gepufferte Salzsäure) rekonstituieren, um Aliquots mit einer Aktivität von 100 Einheiten/L (1000x) zu erhalten und bei -20 °C lagern. Beachten Sie, Kollagenase Aktivität hängt von der Chargennummer der Unternehmen.
- Bereiten Sie Dispase-Aktien-Aliquots vor, indem Sie 5 mg Dispasepulver in 1x PBS (50 mg/ml) auflösen. Bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine enzymatische Lösung mit 100 ml DMEM-F12 medium, 50 l Lagerkollagenase (100 Einheiten/L) vor, um eine Endkonzentration von 50 U/ml und 333 l Stammdispase (50 mg/ml) zu haben, um eine Endkonzentration von 0,33 mg/ml zu haben.
- Zur Herstellung einer Waschlösung, auf 1.000 ml 1x PBS, fügen Sie 0,4766 g HEPES (Endkonzentration 2 mM), 3,6 g D-Glucose (Endkonzentration 20 mM) und 2,1 g NaHCO3 (Endkonzentration 25 mM) hinzu.
- Poly-L-Ornithin-Lager-Aliquots (1 mg/ml) mit sterilem Wasser zubereiten und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Funktionierenslösung aus Poly-L-Ornithin vor. Verdünnen Sie einen Lager-Aliquot (1mg/ml) in 49 ml sterilem Wasser für eine Endkonzentration von 20 g/ml.
- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung aus Laminin vor. Verdünnen Sie 25 l Laminin (1 mg/ml Originalbestand) in 5 ml sterilem Wasser für eine Endkonzentration von 5 g/ml.
HINWEIS: Filtern Sie nach der Vorbereitung die Kulturmedien, Arbeits- und Lagerlösungen, um Verunreinigungen zu vermeiden. Verwenden Sie eine Spritze oder Flaschen-Top-Vakuumfilter (Polyethersulfon-Membran mit einer Porengröße von 0,2 m). Die Kulturmedien und Arbeitslösungen können bis zu 30 Tage bei 4 °C gelagert werden, während die Bestände bis zu vier Monate bei -20 °C gelagert werden können.
2. Vorbereitung vor Beginn der Mikrodissektion
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente durch Autoklavieren oder mit einem heißen Glasperlen-Trockensterilisator.
- Reinigen Sie die Mikrodissektionsoberfläche unter strengen aseptischen und antiseptischen Bedingungen (z. B. mit ozonisiertem Wasser).
HINWEIS: Das Timing der Mikrodissektion beider neurogener Nischen aus jedem Wühlmausgehirn beträgt ca. 30 min. Die Arbeit mit 1-4 Tieren für das gesamte Verfahren wird empfohlen.
3. Extraktion des gesamten Gehirns
- Anästhetisieren Sie die erwachsene Wühlmaus (12-16 Wochen) mit einer Überdosierung von Pentobarbital (6,3 mg/Tier) durch intraperitoneale Injektion. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen von Pedalreflex als Reaktion auf eine feste Zehenklemme.
- Sobald die Wühlmaus vollständig anästhesisiert ist, induzieren Euthanasie durch Enthauptung und erholen den Kopf.
- Sezieren Sie die Haut vom Schädel mit einer Schere, so dass ein kaudal-rostraler Schnitt (15 mm lang) den Schädel freilegen.
- Schneiden Sie die okzipitalen und interparietalen Knochen und verfolgen Sie einen Schnitt in den Schädel entlang der sagittalen und parietalen Nähte.
- Machen Sie ein Loch in den Schädel an der Kreuzung von frontalen und parietalen Knochen mit einer Schere, sehr vorsichtig, um nicht das Gehirngewebe zu beschädigen.
- Um das Gehirn freizulegen, entfernen Sie die verbleibenden Schädelfragmente, die beide Gehirnhälften mit scharfspitzspitzen Pinzette bedecken.
- Verwenden Sie einen Edelstahl-Spachtel, um das gesamte Gehirn von der Schädelbasis zu heben.
- Sammeln Sie das Gehirn in ein Zentrifugenrohr (50 ml) mit 20 ml Kaltwaschlösung.
- Waschen Sie das Gehirn zweimal mit der Kaltwaschlösung.
4. Mikrodissektion des Nervengewebes
- Legen Sie eine Petrischale auf eine Oberfläche, die von Eis umgeben ist.
- Legen Sie das Gehirn auf der Schale und fügen Sie 20 ml kalte Waschlösung.
- Mit einem Skalpell, in der koronalen Ebene, teilen Sie das Gehirn in zwei Blöcke von Gewebe (rostral und kaudal). Führen Sie als neuroanatomische Referenz den koronalen Schnitt auf Bregma-Ebene in der vorderen-hinteren Achse11 (Abbildung 1A, durchgezogene Linie) durch.
- Aus dem rostralen Block, extrahieren Sie das VZ-Gewebe (Abbildung 1B), während aus dem Kaudalblock entfernen Sie die DG (Abbildung 1C).
- Sezieren Sie die VZ unter einem Stereomikroskop.
- Halten Sie mit einer Dumont-Zange eine der Hemisphären; dann, in der Höhe des Ventrikels, die feinen Spitzen eines zweiten Dumont Zange unter dem Gewebe, das die Caudate-Putamen (Abbildung 2A) linien.
- Öffnen Sie die Zange entlang der dorsoventralen Achse, um das Gewebe zu trennen.
- Sammeln Sie das VZ-Gewebe pro Person in einem Zentrifugenrohr mit 2 ml Kaltwaschlösung. Das Gewebe von mehr als zwei Tieren nicht bündeln.
- Wiederholen Sie die Mikrodissektion in der anderen Hemisphäre.
- Bewahren Sie die Röhre mit dem bilateralen VZ-Gewebe auf Eis auf und sezieren Sie die DG weiter.
- Sezieren Sie die DG aus dem Kaudalblock unter einem Stereomikroskop.
- Mit einem Skalpell, machen Sie einen koronalen Schnitt in den Block, um zwei Scheiben zu erhalten, in denen die Hippocampus-Bildung beobachtet wird. Als Landmark wird der Schnitt bei -2 mm Bregma-Koordinaten in der vorderen-hinteren Achse gemäß dem Maushirnatlas11 (Abbildung 1A, gepunktete Linie und Abbildung 1C) gemacht.
- Mit einer Dumont-Zange halten Sie eine der Scheiben, und mit Feinpunkt Dumont Zangen machen einen horizontalen Schnitt zwischen DG und CA1 und führen dann einen vertikalen Schnitt zwischen der GD und CA3, um die GD zu trennen (Abbildung 2B).
- Wiederholen Sie die Sezieren im ersten Abschnitt der anderen Hemisphäre.
- Wiederholen Sie die Sezieren in beiden Hemisphären im zweiten Abschnitt.
- Sammeln Sie die vier DG-Stücke jeder Wühlmaus in einem Zentrifugenrohr. Poolen Sie das DG-Gewebe von mehr als zwei Tieren nicht.
HINWEIS: Wenn eine Zerlegung von mehr als einem Tier erforderlich ist, lagern Sie die Zentrifugenröhren mit dem VZ- oder DG-Gewebe auf Eis, während Sie weiterhin den Rest des Gehirns sezieren. Entfernen Sie alle Blutgefäße, die das Gehirngewebe während der Sezieren bedecken. Wenn die Gefäße nicht verworfen werden, könnte die Kultur mit einem Überschuss an Erythrozyten vermischt werden und die Neurosphärenbildung stören.
5. Isolierung von Nervenzellen
- Legen Sie die Zentrifugenrohre in den Biosicherheitsschrank und warten Sie etwa 10 min, bis die Gewebefragmente durch die Schwerkraft ausfallen.
- Entfernen Sie die Waschlösung und fügen Sie 1 ml der warmen enzymatischen Lösung zu jedem Rohr hinzu.
- Inkubieren Sie die Rohre bei 37 °C für 10 min.
- Zerlegen Sie die Gewebefragmente; Pipette nach oben und unten mit einer 1 ml Spitze. Pipette nicht mehr als 30x.
- Führen Sie eine zweite Inkubation von 10 min bei 37 °C durch.
- Am Ende der zweiten Inkubation, Pipette, um das Gewebe aufzubrechen. Pipette nicht mehr als 30x.
HINWEIS: Nach dem Pipetieren sollten die Gewebefragmente vollständig aufgelöst werden; wenn sie nicht zerfallen sind, für weitere 10 min bei 37 °C und Re-Pipette inkubieren. Die Verdauungszeit sollte 30 min nicht überschreiten. - Fügen Sie 9 ml N2 Medium pro Tube hinzu, um die enzymatische Behandlung zu verdünnen.
- Zentrifugieren Sie die Rohre bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur.
- Den Überstand entsorgen und mit 10 ml N2-Medium waschen.
- Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen wie Schritt 5.8.
- Entfernen Sie den Überstand aus jedem Rohr und setzen Sie die Zellpellets der VZ und DG in 2 ml bzw. 1 ml des B27-Mediums wieder auf.
- Um nicht aufgelöstes Gewebe zu entfernen, filtern Sie jede zelluläre Suspension mit einem Zellsieb (Größe 40 m).
6. Bildung von Neurosphären
- Kultur die Zellen durch das Sieb in eine ultra-niedrige Befestigung, 24-Well-Platte. Verwenden Sie zwei Brunnen für die VZ und einen Brunnen für die DG (1 ml B27 mittel/gut).
- Fügen Sie 20 ng/ml FGF2 und 20 ng/ml EGF zu jedem Brunnen hinzu (Endkonzentration 1x).
- Inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 und hoher Luftfeuchtigkeit (90-95%). Nicht stören für 48 h (Tag 1 und Tag 2 der Kultur, D1-D2).
- Am dritten Tag (D3) die Hälfte des Kulturmediums entfernen und durch frisches B27-Medium (500 l pro Brunnen) ersetzen, das durch eine doppelte Konzentration (2x) der Wachstumsfaktoren ergänzt wird.
- Wiederholen Sie jeden dritten Tag, ändern Sie das Kulturmedium (die Hälfte davon) und ersetzen Sie es durch ein frisches B27-Medium, das durch eine doppelte Konzentration (2x) von Wachstumsfaktoren ergänzt wird.
- An Tagen, an denen es nicht notwendig ist, das Kulturmedium zu ändern, fügen Sie Wachstumsfaktoren zu einer endgültigen Konzentration von 1x hinzu.
- Stellen Sie sicher, dass die Neurosphären um D8-D10 gebildet werden.
- Ändern Sie bei der D10 das gesamte Kulturmedium, um alle Trümmer zu entfernen.
- Sammeln Sie das Medium und die Neurosphären einzeln von jedem Brunnen in Zentrifugenröhren.
- 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Dieses Verfahren ermöglicht Neurosphären Niederschlag durch Schwerkraft.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 1 ml frisches B27 Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt.
- Legen Sie die Neurosphären wieder in die gleiche ultra-niedrige Befestigungsplatte und brüten bei 37 °C, 5%CO2.
- Von D10 auf D15, die Hälfte des Mediums weiter zu verändern und Wachstumsfaktoren hinzuzufügen.
7. Passage der Neurosphären
- Bei D15 der Primärkultur, sammeln Sie die Neurosphären in Zentrifugenröhren mit 1 ml Pipette. Schneiden Sie die Pipettenspitze, um die Größe der Öffnung zu erhöhen, um Schäden an den Neurosphären zu vermeiden.
- 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Neurosphären stürzen durch die Schwerkraft.
- Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie 1 ml des Zellablösungsmediums pro Rohr hinzu.
- Inkubieren Sie die Rohre für 7 min bei 37 °C.
- Pipette rauf und runter mit einer 1 ml Spitze, um die Neurosphären zu demontieren.
- Verdünnen Sie das Zellablösungsmedium mit 3 ml B27 Medium pro Röhre.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 200 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie jedes Zellpellet mit einem frischen B27-Medium, das durch Wachstumsfaktoren ergänzt wird.
- Setzen Sie die VZ-abgeleiteten Zellen in 4 ml Medium und die DG-abgeleiteten Zellen in 2 ml Medium wieder aus.
- Kultur die Zellen (Passage 1) in einer neuen ultra-niedrigen Befestigungsplatte durch Verdoppelung der Anzahl der Brunnen, die in der Primärkultur verwendet wurden (4 bzw. 2 Brunnen für VZ bzw. DG).
- Ändern Sie jeden dritten Tag die Hälfte des Mediums und fügen Sie täglich Wachstumsfaktoren hinzu.
- Nach 10 Tagen (D10) in Durchgang 1 in der nächsten Passage zu den bedingungen wechseln.
8. Die Passage unter anhaftenden Bedingungen
- Vor der Durchführung des Durchgangs 2, bereiten beschichtete Platten mit Poly-L-Ornithin und Laminin.
- In 24-Well-Platten 500 l 1x Poly-L-Ornithin (20 g/ml) pro Bohrgut hinzufügen. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Entfernen Sie das Poly-L-Ornithin und waschen Sie 4x mit 1x PBS (500 l/well).
- Fügen Sie 200 l (Mindestvolumen, um die Oberfläche eines einzelnen Brunnens zu bedecken) von 1x Laminin (5 g/ml) pro Bohrkörper und inkubieren Sie für 2-3 h bei 37 °C, bevor Sie die Zellen kultivieren.
- Sammeln Sie die Neurosphären mit 1 ml Pipette mit geschnittenen Spitzen in ein Zentrifugenrohr.
- 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Neurosphären durch Schwerkraft zu fällen.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Neurosphären in frischem B27-Medium ohne Wachstumsfaktoren wieder aus.
- Das Laminin von der beschichteten Platte absaugen und die Neurosphären mit 1 ml Pipetten mit Geschnittenspitzen in die Brunnen ablagern.
HINWEIS: Verhindern Sie, dass beschichtete Brunnen zwischen Lamininentfernung und Beschichtung neurosphären austrocknen. - Teilen Sie die Kultur in zwei Bedingungen auf:
- Halten Sie differenzierte Neurosphären für 6 Tage (D6). Ändern Sie das Medium jeden dritten Tag und fügen Sie täglich Wachstumsfaktoren hinzu.
- Beobachten Sie die Differenzierung der neurosphärenabgeleiteten Zellen um 12 Tage (D12). Ändern Sie das Medium jeden dritten Tag ohne Wachstumsfaktoren.
HINWEIS: Am Ende von D6 für undifferenzierte oder D12 für Differenzierungsbedingungen können die Zellen unter anderem für die konventionelle Immunhistochemie, Zellsortieranalyse, 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU) Färbung, RNA-Extraktion, verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurosphären wurden aus neuronalen Stammzellen gebildet, die aus der VZ und DG sowohl weiblicher als auch männlicher erwachsener Präriewühlmäuse isoliert wurden. Etwa 8-10 Tage nach Beginn der Kultur sollten Zellen die Neurosphären gebildet haben. Beachten Sie, dass die Platte Schmutz in der Primärkultur enthalten kann (Abbildung 3A). In Durchgang 1 sollte die Kultur jedoch nur aus Neurosphären bestehen (Abbildung 3B).
Eine höhere Anzahl von Neurosphären wurde aus dem weiblichen VZ im Vergleich zu den männlichen VZ und DG von Frauen und Männern gewonnen (Abbildung 4A). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Anzahl der erhaltenen Neurosphären von der proliferativen Zone und dem Wühlmaus-Sex abhängt. Sobald die Neurosphären erschienen (D8-D10), wurden sie für weitere sieben Tage in der Kultur gepflegt, und ihr Wachstum wurde während dieser Zeit überwacht. Der Durchmesser der Neurosphären wurde auf D8, D11 und D14 gemessen (Tabelle 1 und Abbildung 4B). Die Größe (Durchmesser) der Neurosphäre nahm nach den Tagen der Kultur für männliche und weibliche Wühlmäuse in beiden neuronalen Regionen schrittweise zu. Neurosphären, die aus den männlichen Gehirnen abgeleitet wurden, waren im Vergleich zu den Neurosphären, die aus dem weiblichen Gehirn abgeleitet wurden, in beiden neurogenen Bereichen kleiner(Abbildung 4B).
Nach 15 Tagen Primärkultur unter schwebenden Bedingungen wurden die Neurosphären in Durchgang 1 unter den gleichen Bedingungen erweitert. Für den anschließenden Durchgang 2 wuchsen die Zellen in der Klebekultur, obwohl sie seit Durchgang 1 haften konnten. Anhaftende Neurosphären wurden am sechsten Tag (D6) in Gegenwart von Wachstumsfaktoren (undifferenzierter Zustand, Abbildung 5A)oder stattdessen bis zum 15. Tag (D15) ohne Wachstumsfaktoren (differenzierter Zustand, Abbildung 5B)charakterisiert.
Bei D6 unter undifferenzierungsbedingten Bedingungen exprimierten die neurosphärenabgeleiteten Zellen Nestin (ein Marker für neuronale Vorläufer) (Abbildung 6). Außerdem war es möglich, Doublecortin (DCX) positive Zellen (Migrationszellen) und den Proliferationsmarker Ki67 zu identifizieren, die auf das Vorhandensein von neuronalen Vorläufern oder unreifen Neuronen hinweisen. Der Mangel an Kolokalisierung von Ki67 mit DCX deutet jedoch auf das Vorhandensein postmitatischer Neuroblasten hin (Abbildung 7). Schließlich wurden bei D15 unter Differenzierungsbedingungen reife Neuronen (MAP2-positive Zellen) sowie Zellen mit dem gliaalen Phänotyp (GFAP-positive Zellen) gefunden, die das Differenzierungspotenzial der isolierten Zellen demonstrieren (Abbildung 8).
Abbildung 1: Dorsale Ansicht eines erwachsenen Wühlmausgehirns und seiner neurogenen Regionen. (A) Die durchgezogene Linie auf Bregma-Ebene war der anatomische Verweis, um das Gehirn in zwei Blöcke zu trennen, rostral und kaudal. Die gepunktete Linie war der Hinweis, um den Kaudalblock zu teilen, um zwei Scheiben zu erhalten, die die GD enthalten. (B) Koronale Ansicht der neuronalen Regionen, die mit dem ersten Schnitt exponiert sind, wo sich die VZ befindet. (C) Koronale Ansicht der anatomischen Regionen, die mit dem zweiten Schnitt exponiert sind, wo sich die GD befindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Anatomische Referenzen für die Zerlegung neurogener Regionen. (A) Schema und Foto des koronalen Abschnitts aus dem Rostralblock, der die VZ-Position (gepunktete Linie) zeigt. (B) Schema und Foto des koronalen Abschnitts aus dem Kaudalblock, der die GD-Sektion zeigt. CPu, caudate putamen; V, Ventrikel; VZ, ventrikuläre Zone, DG, Dentate Gyrus; CA1 und CA3, Regionen des Hippocampus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Mikrographik der Neurosphärenkultur, die aus neurogenen Nischen der erwachsenen Präriewühlmaus abgeleitet ist. (A) Primärkultur von Neurosphären, die von der VZ weiblicher Wühlmäuse bei D10 isoliert wurden. (B) Passage 1 der Neurosphären, die von der VZ weiblicher Wühlmäuse bei D10 abgeleitet sind. Skalenstäbe = 200 n= 3 für jede neurogene Region und das Geschlecht der Wühlmaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Anzahl und Größe der Neurosphären hing sowohl von Geschlecht als auch von neurogener Quelle ab. (A) Die Anzahl der Neurosphären in der Primärkultur, die von VZ und DG bei weiblichen und männlichen Wühlmäusen bei D10 gewonnen werden. Die Daten wurden mit einer einseitigen ANOVA analysiert, gefolgt von den Post-hoc-Tests eines Tukey. Es wurden signifikante Unterschiede zwischen der weiblichen VZ und den übrigen Gruppen ,**p<0.001 gefunden. (B) Der Durchmesser der Neurosphären in D8-D14 in der Primärkultur hing vom Wühlmaus-Geschlecht ab. Die Daten wurden mit einer zweiseitigen ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Tests. Gruppeninterne Vergleiche (Unterschiede innerhalb derselben Gruppe) zeigten einen Anstieg der Neurosphärengröße zwischen D8 vs. D11 und D14 (*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001); und D11 vs. D14 (+++ p<0.001) in der VZ und DG der weiblichen und männlichen Wühlmäuse. Der gruppenübergreifende Vergleich (Unterschiede zwischen Denkgruppen in derselben Region) zeigte, dass weibliche VZ- und DG-Neurosphären bei D11 und D14 größer sind als männliche Neurosphären. P<0,0001. VZ wurde von Männchen und weiblichen Wühlmäusen (n=3, pro Gruppe) gewonnen. 15 weibliche und 10 männliche Neurosphären wurden analysiert. DG wurde von Männlichen und weiblichen Wühlmäusen (n=3, pro Gruppe) gewonnen. 8 weibliche Neurosphären und 5 männliche Neurosphären wurden verarbeitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Bilder von Neurosphären, die von der weiblichen VZ abgeleitet sind, die in Durchgang 2 in Haftbedingungen kultiviert wird. (A) Neurosphären hielten sich in Durchgang 2 mit Wachstumsfaktoren bei D2. (B) Neurosphären-abgeleitete Zellen haften in Durchgang 2 ohne Wachstumsfaktoren bei D10. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Expression von Nestin in Neurosphären. Repräsentative Epifluoreszenz-Mikroskopie-Bilder von Nestin-positiven Zellen, die aus der VZ sowohl weiblicher als auch männlicher erwachsener Gehirne im undifferenzierten Stadium abgeleitet wurden. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Expression von DCX und Ki67 in Neurosphären. Repräsentative Epifluoreszenz-Mikroskopie-Bilder von DCX-, Ki67-positiven Zellen und Merge abgeleitet aus der VZ von erwachsenen weiblichen und männlichen Gehirnen im undifferenzierten Stadium. Skalenbalken = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Expression von MAP2 und GFAP in Neurosphären. Repräsentative Epifluoreszenz-Mikroskopie-Bilder von MAP2 (reife Neuronen) und GFAP (Gliazellen) positive Zellen aus der VZ von erwachsenen weiblichen und männlichen Gehirnen im differenzierten Stadium abgeleitet. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Größe der Neurosphären (m) | |||||
| Vz | Gd | ||||
| Tage der Kultur | Sex | Mittlere ± SD | Tage der Kultur | Sex | Mittlere ± SD |
| D8 | F | 102,1±18,2 | D8 | F | 55,3±8,5 |
| M | 86,5±15,1 | M | 37,6±6,8 | ||
| D11 | F | 217,3±35,7 | D11 | F | 142,1±15,4 |
| M | 158,9±47,2 | M | 71,8±14,4 | ||
| D14 | F | 306,6±44,4 | D14 | F | 243,8±37,4 |
| M | 210,8±42,3 | M | 120,2±19,1 | ||
Tabelle 1: Quantifizierung der durchschnittlichen Größe (Durchmesser) von Neurosphären, die aus neurogenen Nischen in der Primärkultur isoliert sind. Signifikante Unterschiede sind in Abbildung 4dargestellt. VZ wurde von Männchen und weiblichen Wühlmäusen (n=3, pro Gruppe) gewonnen. 15 Neurosphären von Weibchen und zehn von Männchen wurden analysiert. DG wurde von Männlichen und weiblichen Wühlmäusen (n=3, pro Gruppe) gewonnen. Acht weibliche Neurosphären und fünf männliche Neurosphären wurden verarbeitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ein Stadium, um eine neuronale Stammzellkultur zu erhalten, ist die Verdauungsphase mit der enzymatischen Lösung, die nicht mehr als 30 min überschreiten sollte, da sie die Zelllebensfähigkeit verringern könnte. Die Neurosphären sollten 8-10 Tage nach der Ursprünglichen Kultur entstehen; wenn sie nicht am 12. Tag auftauchen, entsorgen Sie die Kultur und wiederholen Sie das Experiment, wodurch die Verdauungszeit verkürzt wird. Ein weiteres Problem sind die Blutgefäße, die das Gehirngewebe bedecken. Sie sollten während der Zerlegung vollständig entfernt werden, da der Überschuss an Erythrozyten die Bildung der Neurosphären stören kann.
Dieses Protokoll ermöglicht die Erweiterung der schwimmenden Neurosphären bis Durchgang 2 und die Änderung an haftenden Bedingungen, um die neurosphärenabgeleiteten Zellen zu bewerten. Es hat jedoch Einschränkungen wie eine Abnahme des neurogenen Potentials, das auf gliogene Differenzierung an aufeinanderfolgenden Passagen als Anpassungsreaktion auf In-vitro-Bedingungen umschaltet12. Aus diesem Grund empfahlen wir, die Neurosphären in der Primärkultur und Ingang 1 zu charakterisieren und mit der nächsten Passage nur dann fortzufahren, wenn es erforderlich ist, die Zellen für Experimente zu erweitern, die keine Aufklärervon unterschiede aufgrund des Ursprungs beinhalten.
Interessanterweise können intrinsische Unterschiede in der Primärkultur der Neurosphären als Folge der neuroanatomischen (VZ oder DG) oder geschlechtsabhängigen (frauen- oder männlichen) Quelle gefunden werden. So sind Anzahl und Durchmesser der Neurosphären, die aus beiden neurogenen Regionen von Frauen abgeleitet werden, höher als bei Männern. Dies könnte ein funktioneller Unterschied in der weiblichen Gehirnnische im Vergleich zu denen bei Männern sein, die molekulare Mechanismen können in vitro mit diesem Test untersucht werden.
Die Zellkultur von Neurosphären, die aus der erwachsenen Gehirnwühlmaus abgeleitet sind, ist ein wertvolles Werkzeug, das dazu beitragen könnte, Diskrepanzen zwischen Studien in vivo zu lösen. Zum Beispiel berichteten Fowler und Kollegen, dass die soziale Isolation für 48 h eine Zunahme der 5-Bromo-2'-deoxyuridin (BrdU)-positiven Zellen in der VZ induziert, ohne die DG6zu beeinträchtigen. Lieberwirth et al.; eine Abnahme der Zellproliferation in der GD13. Darüber hinaus kann In-vitro-Kultur ein Modell für die Bewertung der molekularen Mechanismen in neurogenen Regionen sein, die mit Verhaltensänderungen in einem Sozialmodell wie der Präriewühlmaus in Verbindung gebracht werden könnten. So wurde beispielsweise vorgeschlagen, daß die Exposition gegenüber Neugeborenen sowohl bei nichtelternden als auch bei elterlichen Wühlmäusen zu einer Zunahme von BrdU-positiven Zellen in der GD14führt. Die Ergebnisse dieser Studie können mit unserem Zellkulturprotokoll mit BrdU-Kennzeichnung bestätigt werden. Obwohl die meisten Studien an Wühlmäusen und anderen Säugetieren BrdU-Kennzeichnung verwenden, um neue Zellen zu identifizieren, ist ein Nachteil, dass sich die Labbeling in Abhängigkeit von den injizierten Dosen ändern könnte15. EdU, ein weiteres Thymidin-Analog, ist eine ideale Alternative, um Zellen unter der Zellzyklusphase in vitro-Kulturen zu identifizieren. Im selben Experiment ist es möglich, mehrere Perioden für die Aufnahme von EdU zu haben, und im Gegensatz zu BrdU, DNA-Denaturierung oder Inkubation mit Antikörpern ist es für seinen Nachweis nicht notwendig. Außerdem können EdU-positive Zellen auf Ko-Lokalisierung mit Markern untersucht werden, um den Zellteilungszyklus (Ki67) zu identifizieren und ihren Phänotyp mithilfe von Markern von neuronalen Stammzellen oder Vorläufern (Nestin, Sox2 und Pax6) zu bestimmen.
Die Neurosphärenkultur kann als Modell etabliert werden, um die Wirkung von Hormonen, kleinen Molekülen oder Medikamenten in der Proliferationsrate, Neurogenese und epigenetischen Modifikationen in den neuronalen Stammzellen und Vorläufern von Präriewühlmäusen zu untersuchen. Zum Beispiel, frühere Studien haben die Rolle der Stresshormone (wie Corticosteron) und Östrogene bei der Regulierung der erwachsenen Neurogenese in Prärie Wühlmäuse vorgeschlagen, aber die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen sind unbekannt6.
Schließlich sind Autismus-Spektrum-Störungen (ASD) und Schizophrenie (SZ) mit Beeinträchtigungen der sozialen Wahrnehmung16,17zusammen. Interessanterweise spielen Oxytocin und Arginin-Vasopressin eine grundlegende Rolle im sozialen und emotionalen Verhalten, und Genexpressionsvariationen in ihren Rezeptoren (OXTR und Vasopressin 1a (V1AR) sind sowohl mit ASD als auch mit SZ18,19,20,21assoziiert. Darüber hinaus sind Veränderungen in der Neurogenese und neuronalen Migration während der Neuroentwicklung in die Physiopathologie dieser Verhaltensstörungen22,23,24verwickelt. Daher schlagen wir vor, die molekularen Mechanismen zu analysieren, die durch diese Hormone auf Neurogenese, neuronale Migration und andere zelluläre Ereignisse vermittelt werden, deren Veränderungen mit neurologischen Störungen zusammenstehen, indem sie Prärie-Wühlmaus-Zell-Kultur-In-vitro-Modell verwenden, da OXTR- und V1AR-Rezeptoren im Präriewühl-Hippocampus gefunden werden25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch die Stipendien CONACYT 252756 und 253631 unterstützt; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 und IN203518; INPER 2018-1-163 und NIH P51OD11132. Wir danken Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martin Garcia, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris und Susana Castro für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
