Summary
우리는 뇌원내에서 신경 전구세포를 배양하고, 대초원의 성인 뇌의 자이루스를 배양하는 조건을 확립하고, 체외 연구의 보완적인 것으로, 사회적 행동과 관련된 기능성 플라스틱 변화의 일부가 될 수 있는 신경성 틈새 시장 간의 성 의존적 차이를 분석하였다.
Abstract
신경구는 신경 줄기 세포와 전구 세포를 포함하는 1 차세포 집계입니다. 이러한 3D 구조는 신경 줄기 세포의 분화 및 확산 잠재력을 결정할 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 분석될 수 있는 세포주를 생성하는 훌륭한 도구입니다. 또한, 신경 구는 틈새 시장을 만들 수 있습니다 (체 외) 동적 변화 환경의 모델링을 허용, 다양 한 성장 인자 등, 호르몬, 신경 전달 물질, 다른 사람의 사이에서. 마이크로투스 오크로가스터(대초원 vole)는 사회 성 행동과 사회적 인식의 신경생물학적 기초를 이해하는 독특한 모델입니다. 그러나 이러한 동작과 관련된 세포 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 신경구를 생성하기 위해 비 준수 조건하에서 배양되는 성인 대초원의 신경 성 틈새에서 신경 전구 세포를 얻는 것을 목표로합니다. 신경구의 크기와 수는 지역 (서브 벤토리 영역 또는 dentate gyrus) 및 대초원 vole의 섹스에 따라 달라집니다. 이 방법은 시험관 내 신경 성 틈새 에서 성에 의존적인 차이와 쌍 결합 및 쌍 부모 치료와 같은 사회적 행동과 관련된 신경 가소성 변화를 연구하는 놀라운 도구입니다. 또한 사회적 상호 작용 (자폐증 스펙트럼 장애 및 정신 분열증)의 적자를 수반하는 인지 상태를 검사 할 수 있었습니다.
Introduction
크리스티대 가족의 일원인 대초원볼(마이크로투스 오크로가스터)은사회적으로 일부일처화하고 사교적인 종으로 생활 전략이 발전하는 작은 포유류입니다. 남성과 여성 모두 결합 후 지속적인 쌍 유대를 설정하거나 둥지를 공유, 자신의 영토를 방어, 자신의 자손에 대한 양부모 치료를 표시 하는특징의긴 기간1,2,3,4. 따라서, 대초원 볼은 사회 인식5에서사회 성 행동 및 손상의 신경 생물학적 기초를 이해하는 귀중한 모델이다.
성인 신경 발생은 행동 변화로 이어지는 신경 가소성의 가장 중요한 과정 중 하나입니다. 예를 들어, 우리의 연구 그룹은 해마의 축산 자이러스 (DG)에서 세포 증식을 증가 결합과 사회적 동거가 남성 voles에서보고, 성인 신경 발생이 대초원 voles에서 짝짓기하여 유도 쌍 결합의 형성에 역할을 할 수 있음을 시사 (출판되지 않은 데이터). 한편, 새로운 뉴런이 생성되고 통합되는 뇌 영역은 잘 알려져 있지만, 이러한 과정에 관여하는 분자 및 세포 메커니즘은 전체 뇌 모델6의기술적 단점으로 인해 결정되지 않은 상태로 남아 있다. 예를 들어, 유전자 발현 및 기타 세포 활동을 제어하는 신호 경로는 비교적 짧은 활성화 기간(인포프로테온의 검출)7을갖는다. 한 가지 대체 모델은 성인 신경 발생에 관여하는 분자 성분을 해명하기 위해 성인 신경 줄기 세포 또는 전구 세포를 분리하고 배양합니다.
성인 포유동물(mouse) 뇌로부터 체외 신경 전구체를 유지하는 첫 번째 접근법은 신경세포를 생성하는 다능성 잠재력을 보존하는 비응성 조건하에서 성장하는 세포 집계인 신경권의 분석과 성상세포8,9,10이었다. 이들의 발달 과정에서, 전구체만이 피피성장인자(EGF) 및 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)와 같은 미토겐에 반응하여 증식하고 신경구를 생성하는 선택 과정이 있다8,9,10.
우리의 지식에, 어떤 프로토콜은 대초원 voles에서 성인 신경 선조를 얻기 위해 문학에서보고되지 않습니다. 여기에서, 우리는 신경질 틈새 에서 신경 선조및 신경권 형성 분석을 통해 그들의 체외 유지를 격리하는 배양 조건을 설치했습니다. 따라서, 실험은 신경 줄기 세포 및 선조의 증식, 마이그레이션, 분화 및 생존에 관여하는 분자 및 세포 메커니즘을 식별하도록 설계될 수 있으며, 대초원 vole에서 아직 알려지지 않은 공정. 더욱이, VZ와 DG에서 파생된 세포의 성질에 있는 체외 다름을 해명하는 것은 사회 성적인 행동 및 인지 행동의 변화와 관련되었던 신경 가소성에 있는 신경성 틈새 소각의 역할에 관하여 정보를 제공할 수 있고, 사회적인 상호 작용에 있는 적자 (자폐증 스펙트럼 무질서 및 정신 분열증), 또한 성 의존적일 수 있었습니다.
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Protocol
연구 결과는 Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, 멕시코 및 Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163)의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 동물의 번식, 관리 및 인도적 끝점은 멕시코 보건 사무국의 "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud"(건강 연구를 위한 일반 건강법)를 기반으로 한 공식 멕시코 표준(NOM-062-Z00-1999)에 따라 설립되었습니다.
1. 솔루션 및 주식 준비
- 덜벡코의 수정독수리 중간-F12(DMEM-F12), N2 보충제 5mL(100x), 글루타민 보충제 5mL(100x), 항생제 항마이코틱(100x)의 5mL로 N2 배양 배지를 준비한다.
- 신경물질 배지 480mL, B27 보충제 10mL(50배), 글루타민 보충제 5mL, 항생제 항마이코틱5mL(100x)로 B27 배양 배지를 준비한다.
- 콜라게나아제 분말을 1x PBS(인산염 완충식식염)로 재구성하여 100단위/μL(1000x)의 활성을 가진 알리쿼를 얻고 -20°C에 보관한다. 공지, 콜라게나아제 활동은 회사의 많은 수에 따라 달라집니다.
- 1x PBS(50 mg/mL)에서 디스파스 파우더 5 mg을 용해하여 디스파스 스톡 알리오트(dispase stock aliquots)를 준비하십시오. -20 °C에 보관하십시오.
- DMEM-F12 배지 100mL, 주식 콜라게나아제 50 μL(100단위/μL)으로 효소 용액을 준비하여 최종 농도50 U/mL 및 333 μL의 스톡 디스파스(50 mg/mL)의 최종 농도를 갖도록 0.33 mg/mL의 최종 농도를 갖습니다.
- 세척용액을 1x PBS 1,000mL로 준비하려면 HEPES 0.4766 g(최종 농도 2mM), D-포도당 3.6g(최종 농도 20mM) 및 NaHCO3(최종 농도 25mM)의 2.1g을 추가한다.
- 멸균물을 사용하여 폴리 L-올니틴 스톡 알리쿼트(1 mg/mL)를 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
- 폴리 L-오르니틴의 작업 솔루션을 준비합니다. 20 μg/mL의 최종 농도를 위해 49mL의 멸균 수에 육수 알리쿼트(1mg/mL)를 희석시하십시오.
- 라미닌의 작업 솔루션을 준비합니다. 5 μg/mL의 최종 농도를 위해 멸균 수의 5mL에 라미닌 (1 mg/mL 원래 재고)의 25 μL을 희석하십시오.
참고: 준비 후, 오염을 방지하기 위해 배양 매체, 작업 및 재고 솔루션을 필터링합니다. 주사기 또는 병 상단 진공 필터를 사용합니다 (0.2 μm 모공 크기의 폴레터술폰 멤브레인). 배양 배지 및 작업 용액은 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있으며, 주식은 -20°C에서 최대 4개월 동안 보관할 수 있다.
2. 미세 절을 시작하기 전에 준비
- 자동 사용 또는 뜨거운 유리 비드 드라이 멸균제로 수술 기구를 살균하십시오.
- 엄격한 무균 및 방부제 조건 (예 : 오존화 된 물)에서 미세 절 표면적을 청소하십시오.
참고: 각 볼 뇌에서 신경질 틈새 의 미세 절의 타이밍은 약 30 분입니다. 전체 시술에 대해 1-4 마리의 동물과 함께 일하는 것이 좋습니다.
3. 전체 뇌의 추출
- 성용 볼 (12-16 주)을 관면 주사를 통해 펜토 바르비탈 (6.3 mg / 동물)의 과다 복용으로 마취하십시오. 단단한 발가락 핀치에 대한 응답으로 페달 반사의 부재에 의해 마취의 깊이를 확인합니다.
- 볼이 완전히 마취되면 참수로 안락사를 유도하고 머리를 회복하십시오.
- 두개골에서 가위로 피부를 해부하여 두개골을 드러내기 위해 코살-로스트랄 절개(15mm 길이)를 만듭니다.
- 후두와 간 간 뼈를 자르고 처진 및 정수리 봉합사를 따라 두개골에 절개를 추적합니다.
- 가위를 사용하여 정면과 정수리 뼈의 접합에 두개골에 구멍을 확인, 뇌 조직을 손상시키지 않도록 매우 조심되고.
- 뇌를 드러내려면 날카로운 뾰족한 핀셋으로 두 뇌 반구를 덮는 나머지 두개골 조각을 제거하십시오.
- 스테인레스 스틸 주걱을 사용하여 두개골 기지에서 뇌 전체를 들어 올립니다.
- 20mL의 냉세척 용액을 가진 원심분리기 튜브(50mL)로 뇌를 수집합니다.
- 차가운 세척 용액으로 뇌를 두 번 씻으시면 됩니다.
4. 신경 조직의 미세 절
- 얼음으로 둘러싸인 표면에 페트리 접시를 놓습니다.
- 접시에 뇌를 착유하고 차가운 세척 용액 20mL를 추가합니다.
- 메스와 함께, 관상 평면에서, 조직의 두 블록으로 뇌를 분할 (로스트랄과 코달). 신경 해부학적 참고로서, 전방 후방축(11)에서 브레그마 수준에서 관상 절단을수행한다(도 1A,고선).
- 로스트랄 블록으로부터, VZ조직(도 1B)을추출하고, 소달 블록으로부터 DG(도1C)를제거한다.
- 스테레오 현미경으로 VZ를 해부합니다.
- 두몬트 집게로 반구 중 하나를 잡으십시오. 그런 다음, 심실의 높이에서, 카우다테-푸타멘(그림2A)을일렬로 세워주는 조직 하에서 두 번째 듀몬트 집게의 미세한 팁을 삽입한다.
- 조직을 분리하기 위해 등쪽 축을 따라 집게를 엽니다.
- 콜드 워시 용액 2mL의 원심분리기 튜브에서 개인당 VZ 조직을 수집합니다. 두 개 이상의 동물의 조직을 풀지 마십시오.
- 다른 반구에서 미세 절을 반복합니다.
- 양자 VZ 조직을 포함하는 튜브를 얼음에 저장하고 DG를 해부계속합니다.
- 스테레오 현미경의 밑에 caudal 블록에서 DG를 해부합니다.
- 메스를 사용하면 관상 동맥절단을 블록으로 잘라 두 조각을 얻으며 해마 형성이 관찰됩니다. 랜드마크로서, 컷은 마우스 뇌아틀라스(11)에 따라 전방 후방 축에서 -2mm Bregma 좌표로만들어집니다(그림 1A,점선 및 도 1C).
- Dumont 집게를 사용하면 슬라이스 중 하나를 잡고 미세 한 점 두몬트 집게로 DG와 CA1 사이의 수평 절단을 한 다음 DG와 CA3 사이의 수직 절개를 수행하여 DG(그림 2B)를분리합니다.
- 다른 반구의 첫 번째 조각에서 해부를 반복합니다.
- 두 번째 슬라이스의 두 반구에서 해부를 반복합니다.
- 원심분리기 튜브에 각 볼의 4개의 DG 조각을 수집합니다. 두 개 이상의 동물의 DG 조직을 풀지 마십시오.
참고: 두 개 이상의 동물의 해부가 필요한 경우, 뇌의 나머지 부분을 해부하면서 VZ 또는 DG 조직과 원심분리관을 얼음 위에 보관하십시오. 해부하는 동안 뇌 조직을 덮는 모든 혈관을 제거하십시오. 혈관이 버려지지 않으면 배양은 과도한 적혈구와 혼합되어 신경권 형성을 방해할 수 있습니다.
5. 신경 세포의 격리
- 원심분리관을 생물안전 캐비닛 내부에 놓고 조직 파편이 중력에 의해 침전될 때까지 약 10분 정도 기다립니다.
- 세척 용액을 제거하고 각 튜브에 따뜻한 효소 용액 1mL을 추가합니다.
- 튜브를 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 조직 조각을 분해; 1 mL 팁으로 위아래로 파이펫. 30배 이상 파이펫을 사용하지 마십시오.
- 37°C에서 10분의 두 번째 인큐베이션을 수행한다.
- 두 번째 인큐베이션이 끝나면 조직을 분해하는 파이펫이 있습니다. 30배 이상 파이펫을 사용하지 마십시오.
참고: 파이펫팅 후 조직 조각은 완전히 분해되어야 합니다. 붕괴되지 않으면 37°C에서 10분 동안 배양하고 다시 파이펫을 다시 피펫으로 배양합니다. 소화 기간은 30분 이상이어야 합니다. - 효소 처리를 희석하기 위하여 관 당 N2 매체의 9mL를 추가합니다.
- 실온에서 4 분 동안 200 x g의 튜브원심분리기.
- 상체를 버리고 N2 배지 의 10mL로 세척하십시오.
- 5.8 단계와 동일한 조건에서 원심분리기.
- 각 튜브에서 상체를 제거하고 각각 B27 배지의 2mL 및 1 mL에서 VZ 및 DG의 세포 펠릿을 재연한다.
- 비분해 조직을 제거하려면 세포 여조(크기 40 μm)를 사용하여 각 세포 현탁액을 필터링합니다.
6. 신경권 형성
- 세포가 스트레이너를 통과하여 초저 부착, 24웰 플레이트로 배양합니다. VZ에 두 개의 우물과 DG (B27 중간 / 웰의 1 mL)에 대한 하나의 우물을 사용합니다.
- FGF2의 20 ng/mL과 각 웰(최종 농도 1x)에 EGF의 20 ng/mL을 추가합니다.
- 37°C, 5% CO2 및 높은 습도(90-95%)에서 배양합니다. 48h(문화의 1일차 및 2일차, D1-D2)를 방해하지 마십시오.
- 셋째 날(D3)에서는 배양 배지의 절반을 제거하고 성장 인자의 이중 농도(2배)로 보충된 신선한 B27 배지(웰당 500 μL)로 대체한다.
- 매 3 일마다 반복, 배양 배지 (그것의 절반)를 변경 하 고 성장 인자의 이중 농도 (2 x)로 보충 신선한 B27 매체로 대체.
- 배양 배지를 변경할 필요가 없는 날에는 1배의 최종 농도에 성장 인자를 추가합니다.
- 신경구가 D8-D10 주위에 형성되는지 확인하십시오.
- D10에서 전체 배양 매체를 변경하여 모든 이물질을 제거합니다.
- 원심분리기 튜브에서 각 우물의 배지와 신경구를 개별적으로 수집합니다.
- 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 이 절차는 중력에 의해 신경구 강수량을 허용합니다.
- 상체를 제거하고 성장 요인으로 보충 된 신선한 B27 매체의 1 mL에서 재연하십시오.
- 신경구를 동일한 초저 부착 판에 다시 넣고 37 °C, 5 % CO2에서배양합니다.
- D10에서 D15로, 중간의 절반을 계속 변경하고 성장 요인을 추가합니다.
7. 신경구의 통과
- 1차 배양의 D15에서, 1mL 파이펫을 사용하여 원심분리기 튜브로 신경구를 수집한다. 피펫 팁을 잘라 서 개구의 크기를 증가 하 여 신경 구체에 손상을 방지 합니다.
- 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 신경구는 중력에 의해 침전됩니다.
- 배지를 제거하고 튜브 당 세포 분리 매체의 1 mL을 추가합니다.
- 37°C에서 튜브를 7분 동안 배양합니다.
- 피펫은 신경구를 해체하기 위해 1mL 팁으로 위아래로 합니다.
- 튜브 당 B27 배지의 3 mL로 세포 분리 매체를 희석.
- 200 x g에서5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
- 상체를 버리고 성장 요인으로 보충된 신선한 B27 배지로 각 세포 펠릿을 재연하십시오.
- VZ 유래 세포를 배지의 4mL 및 DG 유래 세포에서 2mL의 배지에서 재중단한다.
- 1차 배양(VZ 및 DG의 경우 각각 4및 2웰)에서 사용된 우물의 수를 두 배로 늘려 새로운 초저 부착 판에서 세포(passage 1)를 배양한다.
- 3일마다 중간 크기의 절반을 변경하고 매일 성장 요인을 추가합니다.
- 1번 통로에서 10일(D10) 후에다음 구절에서 신봉조건으로 변경한다.
8. 준수 조건의 통로
- 2번 통로를 수행하기 전에 폴리 L-오르니틴과 라미닌으로 코팅된 플레이트를 준비합니다.
- 24웰 플레이트에 1x 폴리 L-오르니틴(20 μg/mL)의 500 μL을 잘 넣습니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
- 폴리 L-올니틴을 제거하고 1x PBS(500 μL/웰)로 4배 세척합니다.
- 우물당 200 μL(최소 부피)을 1x 라미닌(5 μg/mL)의 1x 라미닌(5 μg/mL)을 넣고 세포를 재배하기 전에 37°C에서 2-3h의 배양한다.
- 원심분리기 튜브에 컷 팁이 있는 1mL 파이펫으로 신경구를 수집합니다.
- 중력에 의해 신경구를 침전하기 위해 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 상체를 버리고 성장 인자없이 신선한 B27 배지에서 신경구를 다시 중단하십시오.
- 코팅 된 접시에서 라미닌을 흡인하고 절단 팁1 mL 파이펫을 사용하여 우물에 신경 구체를 입금합니다.
참고: 코팅된 우물이 라미닌 제거와 도금 신경구 사이에 건조되는 것을 방지합니다. - 문화를 다음 두 가지 조건으로 나눈다.
- 6 일 동안 분화 된 신경 구체를 유지 (D6). 매 3일마다 배지를 변경하고 매일 성장 요인을 추가합니다.
- 신경권 유래 세포의 분화를 12일(D12)까지 관찰한다. 성장 요인없이 3 일마다 매체를 변경합니다.
참고: 분화 조건에 대한 D6의 끝에서, 세포는 종래의 면역히스토케, 세포 선별 분석, 5-에티닐-2'-deoxyuridine (EdU) 염색, RNA 추출 등에 사용될 수 있다.
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Representative Results
신경구는 VZ와 여성 및 남성 성인 대초원 voles의 DG에서 분리된 신경 줄기 세포에서 형성되었다. 배양을 시작한 지 약 8-10일 후에 세포가 신경구를 형성했어야 합니다. 플레이트는 1차 배양(도3A)에이물질을 포함할 수 있다. 그러나, 1항에서 배양은 신경구(도3B)로만이루어져야 한다.
여성과 남성의 남성 VZ 및 DG와 비교하여 여성 VZ로부터 더 많은 수의 신경구를얻었다(도 4A). 이 데이터는 얻어진 신경구의 수가 증식 영역 및 vole 성별에 달려 있다는 것을 건의합니다. 일단 신경구가 나타나면 (D8-D10), 그들은 문화에서 또 다른 7 일 동안 유지되었고, 그들의 성장은이 기간 동안 모니터링되었다. 신경구의 직경은 D8, D11 및 D14(표1 및 도 4B)에서측정하였다. 신경구의 크기 (직경) 두 신경 영역에서 남성과 여성 voles에 대 한 문화의 일에 따라 점진적으로 증가. 남성 뇌에서 유래된 신경구는 신경발생 영역 모두에서 여성 뇌에서 유래된 신경구(도4B)에비해 작아졌다.
부동 조건에 15 일 의 1 차적인 문화 후에, 신경구는 같은 조건의 밑에 통로 1에서 확장되었습니다. 후속 통과 2의 경우, 세포는 1항 이후 부착할 수 있었지만 접착제 배양에서 성장했다. 부착된 신경구는 성장인자(미분화 상태, 도 5A)또는 대신 15일째(D15)까지 성장인자(분화 상태, 도 5B)가있는 6일째(D6)를 특징으로 하였다.
D6에서 비차분화 조건하에서, 신경권 유래 세포는 네신(신경 전조자마커)을 발현(도6). 또한, 이중코르틴(DCX) 양성 세포(migration cells) 및 증식 마커 Ki67을 식별할 수 있었는데, 이는 뉴런 전구체 또는 미성숙 뉴런중 하나의 존재를 나타낸다. 그러나, DCX와 Ki67의 colocalization의 부족은 사후 신경 폭발의 존재를 시사(그림 7). 마지막으로, 분화 조건 하에서 D15에서, 성숙한 뉴런(MAP2 양성 세포)은 고립된 세포의 분화 잠재력을 보여주는 신경교 표현형(GFAP 양성 세포)을 가진 세포뿐만 아니라,발견되었다(도 8).
그림 1: 성인 볼 뇌와 신경 발생 영역의 등산 보기. (A)브레그마 레벨의 고선은 뇌를 두 블록, 장막 및 코달로 분리하는 해부학적 참조였다. 점선은 DG를 포함하는 두 개의 조각을 얻기 위해 소달 블록을 분할하는 참조였다. (B)VZ가 위치한 첫 번째 절개로 노출된 신경 영역의 관상 전도. (C)DG가 위치한 제2 절개와 함께 노출된 해부학 적 영역의 관상 적 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 신경 발생 영역의 해부에 대 한 해부학 참조. (A)VZ 위치(점선)를 보여주는 로스트랄 블록으로부터 관상 부단의 구성 및 사진. (B)DG 해부를 보여주는 코살 블록으로부터 코로나 섹션의 구성 및 사진. CPu, 카우다테 푸타멘; V, 심실; VZ, 심실 영역, DG, 덴테이트 자이러스; CA1 및 CA3, 해마의 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성인 대초원의 신경질적인 틈새에서 파생된 신경구 배양의 대표적인 현미경 사진. (A)D10에서 여성 voles의 VZ로부터 분리된 신경권의 1차 배양. (B)D10에서 암컷 볼의 VZ로부터 유래된 신경구의 통과 1. 스케일 바 = 각 신경 발생 영역 및 볼의 성별에 대해 200 μm. n= 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 신경구의 수와 크기는 성및 신경유발 성 근원 모두에 달려 있습니다. (A)D10에서 여성과 남성 voles 모두에서 VZ및 DG로부터 얻은 1차 배양에서 신경구의 수가 증가하였다. 데이터는 일방적인 ANOVA로 분석되었고 투키의 포스트 호크 테스트가 뒤따랐습니다. 여성 VZ와 나머지 그룹 사이에 는 상당한 차이가 발견되었습니다. (B)1차 배양에서 D8-D14 전체의 신경구의 직경은 볼섹스에 의존하였다. 데이터는 양방향 ANOVA로 분석되었고 Tukey의 포스트 호크 테스트가 뒤따랐습니다. 그룹 내 비교(동일한 그룹 내차이)는 D8 대 D11 및 D14 사이의 신경권 크기가 증가한 것으로 나타났습니다(*p&0.05, ***p&0.001, ****p&0.0001); 및 D11 대 D14 (+ p&0.001) VZ 및 여성 및 남성 voles의 DG. 그룹 간 비교 (같은 지역에 있는 단 사이 다름) 여성 VZ와 DG 신경구는 D11과 D14에 남성 신경구 보다는 더 큰 것으로 나타났습니다. ###p&0.0001. VZ는 남성과 여성 voles (n=3, 그룹당)로부터 얻어졌다. 15명의 암컷과 10명의 남성 신경구가 분석되었다. DG는 남성과 여성 voles (n=3, 그룹당)로부터 얻어졌다. 8 명의 여성 신경구와 5 개의 남성 신경구가 처리되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 2항의 접착 조건에서 배양된 여성 VZ로부터 유래된 신경구의 대표적인 이미지. (A)신경구는 D2에서 성장 인자를 가진 2통로에 부착하였다. (B)D10에서 성장 인자 없이 2항에 부착된 신경권 유래 세포. 스케일 바 = 200 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 6: 신경권에 있는 둥지의 표현. 미분화 단계에서 여성과 남성 성인 뇌의 VZ에서 파생된 네신 양성 세포의 대표적인, 피형성-현미경 이미지. 스케일 바 = 50 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 7: 신경권에서 DCX 및 Ki67의 발현. DCX-Ki67 양성 세포의 대표적인 epifluorescence-현미경 및 미분화 단계에서 성인 여성과 남성 뇌의 VZ에서 파생된 병합. 스케일 바 = 25 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 8: 신경구에서 MAP2 및 GFAP의 발현. 대표적인, 상피형-현미경 이미지의 MAP2 (성숙한 뉴런) 및 GFAP (글리아 세포) 양성 세포는 분화 단계에서 성인 여성과 남성 뇌의 VZ에서 파생된 양성 세포. 스케일 바 = 50 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
| 신경구의 크기 (μm) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| 문화의 날 | 섹스 | 평균 ± SD | 문화의 날 | 섹스 | 평균 ± SD |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55.3±8.5 |
| M | 86.5±15.1 | M | 37.6±6.8 | ||
| D11 | F | 217.3±35.7 | D11 | F | 142.1±15.4 |
| M | 158.9±47.2 | M | 71.8±14.4 | ||
| D14 | F | 306.6±44.4 | D14 | F | 243.8±37.4 |
| M | 210.8±42.3 | M | 120.2±19.1 | ||
표 1: 1차 배양에서 신경질성 틈새에서 분리된 신경권의 평균 크기(직경)의 정량화. 그림 4에상당한 차이가 표시됩니다. VZ는 남성과 여성 voles (n=3, 그룹당)로부터 얻어졌다. 여성15명과 남성 10마리가 분석되었다. DG는 남성과 여성 voles (n=3, 그룹당)로부터 얻어졌다. 8개의 여성 신경구와 5개의 남성 신경구가 처리되었습니다.
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Discussion
신경 줄기 세포 배양을 얻는 단계는 효소 용액을 가진 소화 기간이며, 이는 세포 생존가능성을 감소시킬 수 있기 때문에 30분 이상을 초과해서는 안 된다. 신경구는 초기 문화 후에 8-10 일에 나타나야 합니다; 12일째에 나타나지 않으면 문화를 버리고 실험을 반복하여 소화 기간을 줄입니다. 또 다른 문제는 뇌 조직을 커버 하는 혈관. 적혈구의 과잉신경구 형성을 방해할 수 있기 때문에 해부 도중 완전히 제거되어야 합니다.
이 프로토콜은 통과 2까지 부동 신경구를 확장하고 신경권 유래 세포를 평가하기 위해 부착 된 조건으로 변경할 수 있습니다. 그러나, 신경유발전의 감소와 같은 한계가 있는데, 이는 체외 조건에 대한 적응 반응으로서 연속적인 구절에서 교생분분화로전환한다(12). 이러한 이유로, 우리는 1 차 적인 배양 및 통로 1에서 신경 구체를 특성화하는 것이 좋습니다, 그리고 기원때문에 해명된 차이를 관련시키지 않는 실험을 위한 세포를 확장하는 것이 필요한 경우에만 다음 구절을 계속합니다.
흥미롭게도, 내재된 차이는 신경 해부학 (VZ 또는 DG) 또는 성 의존 (여성 또는 남성) 소스의 결과로 신경 구의 주요 문화에서 찾을 수 있습니다. 따라서, 여성의 신경 발생 영역 모두에서 유래된 신경구의 수와 직경은 남성과 비교하여 더 높다. 이것은 남성에 비해 여성 뇌 틈새 시장틈새에 있는 기능적인 다름일 수 있었습니다, 분자 기계장치는 이 분석으로 시험관에서 공부될 수 있습니다.
성인 뇌 볼에서 파생 된 신경 구체의 세포 배양은 생체 내 연구 사이의 불일치를 해결하는 데 도움이 될 수있는 귀중한 도구입니다. 예를 들어, 파울러와 동료들은 48h에 대한 사회적 고립이 DG6에영향을 미치지 않으면서 VZ에서 5-Bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)-양성 세포의 증가를 유도한다고 보고했다. 대조적으로, 리버워스 외; DG(13)에서세포 증식의 감소를 입증했다. 더욱이, 체외 배양은 대초원 볼과 같은 사회적 모델의 행동 변화와 연관될 수 있는 신경발생적인 지구에 있는 분자 기계장치를 평가하기 위한 모형일 수 있다. 예를 들어, 신생아에 대한 노출이 비부모 및 부모 voles 모두에서 DG14에서BrdU-양성 세포의 증가를 유도한다는 것이 제안되었습니다. 이 연구 결과의 사실 인정은 BrdU 레이블링을 가진 우리의 세포 배양 프로토콜을 사용하여 확인할 수 있습니다. 그러나, 볼과 다른 포유동물에 대한 대부분의 연구는 새로운 세포를 식별하기 위해 BrdU 라벨링을 사용하지만, 단점은 주입 된 복용량에 따라 실험실이 변경 될 수 있다는 것입니다15. EdU, 또 다른 티미딘 아날로그, 체외 배양에서 세포 주기 단계 에서 세포를 식별 하는 이상적인 대안. 동일한 실험에서, EdU의 통합을 위해 여러 기간을 가질 수 있으며, BrdU와 달리, 항체와 DNA 성모 또는 배양은 그 검출을 위해 필요하지 않다. 또한, EdU 양성 세포는 세포 분열 주기(Ki67)를 식별하고 신경 줄기 세포 또는 선조자(네신, Sox2 및 Pax6)의 마커를 사용하여 표현형을 결정하기 위해 마커와 공동 국소화를 평가할 수 있다.
신경구 배양은 증식율, 신경 발생 및 대초원의 선조에 있는 후성 유전학 수정에 있는 호르몬, 작은 분자 또는 약의 효력을 연구하는 모형으로 설치될 수 있습니다. 예를 들어, 이전 연구는 스트레스 호르몬의 역할을 제안 (코르티코스테론 등) 및 대초원 voles에서 성인 신경 발생의 조절에 에스트로겐, 하지만 기본 규제 메커니즘은 알 수 없는6.
마지막으로, 자폐 스펙트럼 장애(ASD) 및 정신분열증(SZ)은 사회적 인식16,17의장애와관련이 있다. 흥미롭게도, 옥시토신과 아르기닌-바소프레신은 사회적, 정서적 행동에 근본적인 역할을 하며, 각각 수용체(OXTR 및 바소프레신 1a(V1AR)의 유전자 발현 변이는 ASD 및 SZ18,19,20,21과연관된다. 더욱이, 신경발달 중 신경발생및 신경이동의 변화는 이러한행동장애(22,23,24)의생리병리학에 연루된다. 따라서, 우리는 신경 발생에 이러한 호르몬에 의해 매개 분자 메커니즘을 분석 제안, 신경 이주 및 그 변화는 OXTR 및 V1AR 수용체로 인해 체외 모델에서 대초원 볼 세포 배양을 사용하여 신경 질환과 관련된 다른 세포 이벤트(25,26)대초원 볼해마에서 발견된다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 CONACYT 252756 및 253631을 보조금에 의해 지원되었다; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 및 IN203518; INPER 2018-1-163, and NIH P51OD11132. 우리는 Deisy Gasca, 카를로스 로자노, 마르틴 가르시아, 알레한드라 카스티야, 니디아 에르난데스, 제시카 노리스, 수사나 카스트로의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
