Summary
الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير تعليمات حول كيفية قياس قدرة الأجسام المضادة الموجودة في سيرا أو البلازما للأفراد ، المعرضين بشكل طبيعي لعدوى بالسيباروم البلازمودي ، لopsonize والحث على البلعميات الحمراء المصابة بالطفيليات (IEs).
Abstract
يصف البروتوكول كيفية إعداد وتشغيل مقايسة البلعة المستندة إلى الخلايا المتدفقة من plasmodium falciparum-eded inedethrotes (IEs) التي تم التقاطها من قبل الأجسام المضادة IgG المكتسبة بشكل طبيعي محددة لـ VAR2CSA. VAR2CSA هو مستضد الطفيليات التي تتوسط في عزل انتقائي لل IEs في المشيمة التي يمكن أن تسبب شكلًا حادًا من الملاريا لدى النساء الحوامل ، وتسمى الملاريا المشيمة (PM). يتم توسط الحماية من PM بواسطة الأجسام المضادة VAR2CSA الخاصة التي يعتقد أنها تعمل عن طريق تثبيط عزل المشيمة و / أو عن طريق opsonizing IEs للبالعميات. يستخدم الفحص IEs في مرحلة متأخرة من متزامنة التي تم اختيارها في المختبر للتعبير عن VAR2CSA ، والهيئات المضادة للبيات البلازما / المصل من النساء ذوات مناعة PM محددة بشكل طبيعي ، وخط الخلايا الفاتجية THP-1. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة إلى فحص وظيفة الأجسام المضادة إلى أي مستضد طفيلي موجود على سطح IE، سواء كان ذلك بسبب التعرض الطبيعي أو التطعيم. تقدم هذه المقايسة تقييم بسيط وعالي الإنتاجية، مع قابلية جيدة للتكرار، لجانب وظيفي مهم من مناعة الأجسام المضادة بوساطة في الملاريا. ولذلك، فإنه مفيد عند تقييم المناعة السريرية ضد الملاريا P. فالسيباروم، وهي سبب رئيسي للاعتلال والوفيات في المناطق المدارية، وخاصة في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.
Introduction
الملاريا هي مرض ينتقل بالنواقل يسبب في البشر عند العدوى مع خمسة أنواع مختلفة من جنس بلازموديوم. الأنواع الأكثر انتشارا هي P. falciparum، والتي هي أيضا مسؤولة عن معظم المراضة والوفيات1. يختلف العرض السريري للملاريا من التهابات غير أعراضية أو حميدة إلى مرض معقد/شديد، ويحدث هذا الأخير في الغالب في الأطفال دون سن الخامسة. لا يؤدي التعرض لـ P. falciparum إلى مناعة معقمة ، ولكن الأفراد الذين يعيشون في المناطق المتوطنة يطورون ببطء مناعة ضد المرض السريري. الحماية هي العمر / التعرض التبعية ويتم اكتساب الحصانة عادة خلال أول 5-10 سنوات من الحياة2. تعتبر النساء البالغات استثناءً هاماً، حيث يمكن أن تحدث الملاريا الحادة أثناء الحمل في عرض سريري يعرف باسم الملاريا المشيمة (PM). PM هو سبب مهم للإجهاض، والإملاص، والولادة المبكرة، وانخفاض الوزن عند الولادة، ووفاة الجنين، وفقر الدم الأمومي. مقاومة PM يتطور على الحمل المتعاقب3. وترتبط الحماية من PM مع اكتساب الأجسام المضادة ضد VAR2CSA-نوع PfEMP14,5, مستضد سطح الدم الحمراء المصاب (IE) الذي يربط مع كبريتات شوندروتين A (CSA) تمكين عزل IE في المشيمة. الأجسام المضادة توسط حماية أداء مختلف الأنشطة الوظيفية (استعرض في6،7)بما في ذلك opsonization من الـ IEs للحث على phagocytosis. أظهرت الدراسات في المختبر في وقت مبكر أن الأجسام المضادة يمكن أن تحد من P. فالسيباروم النمو في وجود monocytes عبر البلعميات8,9. وقد أظهرت دراسات أكثر حداثة أن مستويات أعلى من الأجسام المضادة المحفزة للزناغة ترتبط مع أفضل نتائج الحمل (في سياق فيروس نقص المناعة البشرية المشترك العدوى)10,11, مما يدل على أهمية هذه الوظيفة المفعول في الاستجابة المناعية المكتسبة بشكل طبيعي.
هنا نقدم بروتوكول لقياس هذه الوظيفة من الأجسام المضادة الموجودة في البلازما البشرية / المصل، وذلك باستخدام في المختبر IEs مثقف التعبير عن VAR2CSA مع خط أحادية THP-1. وقد استخدمت سابقا في الفحص11,12,13,14,15,16,17,18 ويعتبر نهجا محسنا وأسهل مقارنة مع البروتوكولات المجهرية في وقت سابق8, لأنه يسمح باختبار عدد أكبر من عينات الأجسام المضادة في تشغيل واحد باستخدام كميات أصغر من الأجسام المضادة وتجنب العد المجهري الممل والمتحيز. على الرغم من أن الفحص قد استخدم من قبل مختبرات متعددة وتنفيذه بسيط بما فيه الكفاية ، فإنه يتطلب تخطيطًا وإعدادًا دقيقين ، لذلك ، فإن بروتوكولًا مفصلًا سيسمح بتطبيقه من قبل المختبرات والباحثين الذين يفتقرون إلى الخبرة السابقة. نحن نستخدم، كمثال، في مرحلة متأخرة من مرحلة المتزامنة IEs التعبير عن VAR2CSA opsonized مع الأجسام المضادة الموجودة في المصل التي تم جمعها من النساء مع مناعة PM المكتسبة بشكل طبيعي محددة. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة إلى فحص وظيفة الأجسام المضادة إلى أي مستضد طفيلي موجود على سطح IE، سواء كان ذلك بسبب التعرض الطبيعي أو التطعيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع عينات مصل الإنسان المستخدمة للنتائج المعروضة هنا في دراسة منفصلة19. وقد وافق على جمعها مجلس المراجعة المؤسسي لمعهد نوغوشي التذكاري للبحوث الطبية، جامعة غانا (دراسة 038/10-11)، ومن قبل اللجان الإقليمية لأخلاقيات البحوث، منطقة العاصمة الدانمركية (البروتوكول H-4-2013-083).
1. ثقافة الطفيليات
ملاحظة: اتبع اللوائح المحلية للتعامل مع مسببات الأمراض البشرية.
- الحفاظ على طفيليات P. falciparum وفقا للبروتوكول القياسي كما هو موضح قبل20 في ثقافة الطفيليات المتوسطة (انظر جدول المواد).
- الحفاظ على الطفيليات متزامنة بإحكام باستخدام علاج السوربيتول كما هو موضح سابقا21.
- لضمان VAR2CSA التعبير على سطح IE، تنفيذ جولات متكررة من اختيار المناعة المغناطيسي باستخدام الأجسام المضادة VAR2CSA (على سبيل المثال، الأجسام المضادة PAM1.4، و VAR2CSA IgG22أحادية النسيلة البشرية عبر التفاعل) IgG 22 محددة ) إلى جانب البروتين G-المغناطيسي الخرز23.
- باختصار، احتضان في مرحلة متأخرة trophozoite-IEs مع الخرز المغناطيسي إلى جانب الأجسام المضادة VAR2CSA واختيار إيجابي باستخدام المغناطيس.
- توسيع الطفيليات المختارة في الثقافة لبضع دورات حتى الطفيليات لا يقل عن 5٪.
- بدلا من ذلك، حدد الطفيليات التي ترتبط CSA بلاستيك شل (مستقبلات VAR2CSA) كما هو موضح سابقا24.
- للتحقق من VAR2CSA التعبير على الطفيليات المحددة تنفيذ تدفق cytometry كما سبق وصفها25.
- باختصار، صمّر الـ trophozoite-IEs في المراحل المتأخرة بنفس الأجسام المضادة المستخدمة في الانتقاء المغناطيسي (الخطوة 1.3) متبوعاً باجسام مضادة ثانوية تحمل اسم الفلورسنت.
- قياس التفاعل السطح IE بواسطة تدفق عملية استئصال الدراجات. يؤدي اختيار الأجسام المضادة الناجحة عادةً إلى وجود مجموعة طفيليات تعبر عن VAR2CSA في معظم الطفيليات (≈80٪).
- لمقايسة البلعمية، واستخدام تنقية منتصف إلى وقت متأخر من المرحلة trophozoite-IEs. إجراء تنقية باستخدام فصل المغناطيسي كما سبق وصفها26.
ملاحظة: لتحديد مرحلة الطفيليات بدقة، قم بإجراء تلطيخ Giemsa على مسحات الدم متبوعة بملاحظة المجهر الخفيف. اتبع الإجراءات القياسية والمبادئ التوجيهية المورفولوجية كما هو موضح قبل27. ويمكن أيضا أن يتم التنقية في مرحلة متأخرة باستخدام كثافة المتوسطة الانحدار. ومع ذلك، فإن العائد IE، في تجربتنا هو أقل، وبالتالي، تنقية المغناطيسي هو الأفضل.- لفصل المغناطيسي، تدور ثقافة الطفيليات (5-10٪ الطفيليات) في 500 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من ثقافة الطفيلي المتوسطة.
- إضافة تعليق الطفيلي في عمود CS مقرونة إلى المغناطيس (انظر جدول المواد)والسماح لها بالمرور ببطء من خلال العمود. Trophozoite-IEs هي paramagnetic (بسبب وجود الهيموزوين) ، وسوف تبقى في شبكة العمود.
- غسل العمود مع 50 مل من الطفيليات ثقافة المتوسطة وlute IEs من العمود المغناطيسي باستخدام 50 مل من الطفيليات ثقافة المتوسطة.
- تدور في الـ 1.5.3 في 500 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل بعناية افرا و إعادة تعليق في 1 مل من الطفيلي ثقافة المتوسطة.
- باستخدام مقياس الهيموسيت، عد عدد الـ IEs (التي يتم التعرف عليها بسهولة عن طريق المجهر الخفيف على أنها كريات الدم الحمراء مع صبغة الهيموزوين الداكنة) والعدد الإجمالي للخلية لحساب الطفيليات النهائية (النسبة المئوية للوفيات بين الوفيات).
ملاحظة: لا تستخدم سوى الطفيليات التي لا تقل نقاءها عن 80% (80% من الـ IEs). - استناداً إلى عدد عينات المصل/الأجسام المضادة المخطط للاختبار، قم بتقدير الكمية الإجمالية للـ IEs اللازمة و رفع مستوى الثقافات الطفيلية وفقاً لذلك. و 75 سم2 قارورة الثقافة مع 25 مل من الثقافة في 5٪ الهماتوفيت و 5-10٪ الطفيليات ينبغي أن تسفر عن ما يكفي من الكيانات الدولية لتشغيل كامل 96 جيدا لوحة. للحصول على لوحة كاملة (42 عينة بالإضافة إلى 6 عناصر تحكم في التكرار)، هناك حاجة إلى تعليق طفيلي 1.5 مل كحد أدنى عند 3.3 × 107 IEs/mL.
2. THP-1 الخلايا
ملاحظة: يتم استخدام خط الخلية THP-1 في هذا الفحص. هذا الخط الخلوي مشتق من المريض المصاب بسرطان الدم أحادية28 ويمكن شراؤها من ATCC. الحفاظ على خط الخلية وفقا لتعليمات الموفر في THP-1 ثقافة المتوسطة (انظر جدول المواد).
- للصيانة المنتظمة، ابدأ بثقافة الخلايا THP-1 عند 2-4 × 105 خلايا/مل وزراعة فرعية عندما يصل تركيز الخلايا إلى 8 × 105 خلايا/مل.
ملاحظة: لا تسمح تركيز الخلية أن يتجاوز 1 × 106 خلايا/مل و تتبع رقم الممر. تجنب استخدام الخلايا التي تتجاوز مرور 25. ويتراوح متوسط زمن المضاعفة في خط الخلية THP-1 بين 19-50 ساعة. تحديد الوقت مضاعفة من دفعة الخلية قبل البدء في تجارب البلعيم. وهذا سيساعد على تقدير تقريباً الكمية اللازمة من الثقافة اللازمة لعدد محدد من عينات المصل التي سيتم اختبارها (على سبيل المثال، للحصول على 96 بئراً كاملاً، 10 مل من الثقافة في 5 x 105 خلايا/مل مطلوبة). - دوريا التحقق من الخلايا THP-1 للتعبير السطحي من FCγ مستقبلات الأول (CD64)، II (CD32) والثالث (CD16) كما سبق وصفه15.
- باختصار، وصمة عار الخلايا THP-1 (بشكل منفصل) مع المضادة لـ CD64، المضادة لـ CD32 ومضادات CD16 الفلورسنت التسمية الأجسام المضادة(جدول المواد)لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (1:100 تخفيف أعدت في 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني).
- غسل ثلاث مرات مع 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني وقياس تلطيخ السطح عن طريق تدفق cytometry.
ملاحظة: الخلايا THP-1 سالبة لـ CD16 وإيجابية لـ CD32 و CD64 كما ذكر سابقا29,30 ( الشكل1).
- لمقايسة البلعوم، إعداد قارورة ثقافة الخلية THP-1 مع 2.5 × 105 الخلايا/مل في اليوم السابق للتجربة تسفر عن حوالي 5 × 55 الخلايا / مل في يوم الفحص.
ملاحظة: تأكد من وجود 4-6 × 105 خلايا/مل في يوم الفحص.
3. فحص البلعوم (الشكل S1)
- قبل البدء في الفحص ، كتلة (> 1 ح) اثنين من القاع 96 ألواح البئر (واحد لopsonization وآخر للبوليبوس) باستخدام 150 ميكرولتر في بئر من FBS 2 ٪ العقيمة في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: تسمية لوحة 1 كلوحة opsonization واستخدامها على حد سواء لبروميد الإتهيديوم (EtBr) تلطيخ وopsonization. تسمية لوحة 2 كما لوحة البلعمة واستخدام كل من لطلاء الخلايا THP-1 وخطوة البلعميات. - تلطيخ تلطيخ وopsonization
- اتخاذ تعليق IE المعدة في 1.6 وضبط عدد الخلايا إلى 3.3 × 107 IEs /mL عن طريق إضافة الطفيلي ثقافة المتوسطة EtBr لتحقيق تركيز النهائي من 2.5 μg / مل (1:40 تخفيف، من 0.1 ملغ / مل الأسهم).
ملاحظة: تَبَثّت EtBr الحمض النووي الطفيلي، مما يسمح بالكشف عن طريق عملية استئصال الانسداد الخلوي.
تنبيه: EtBr هو مطفرة والجلد والعين ومهيجة التنفس. استخدام الحماية المناسبة والتخلص من النفايات وفقا للوائح المحلية. - إزالة حل حظر من واحدة من لوحات 96 بئر (لوحة opsonization) ، ونفض الغبار لوحة وإزالة فائض السائل على قطعة من الورق منشفة.
- أضف 30 ميكرولتر في بئر من تعليق IE المعد أعلاه في النصف العلوي من اللوحة. اترك واحدة فارغة جيدًا وأضف 30 ميكرولترًا من وسط ثقافة الطفيليات (بدون IEs للتحكم في THP-1 وحده). (الشكل S2A). احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومحمية من الضوء.
- إضافة 170 μL لكل بئر من الطفيليات ثقافة المتوسطة. تدور لوحة في 500 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant عن طريق نفض الغبار لوحة على حاوية النفايات المناسبة.
- غسل الـ EtBr المسمى IEs مرتين 200 ميكرولتر لكل بئر من ثقافة الطفيليات المتوسطة الغزل لوحة في 500 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يمكن إزالة المابير من الغسيل الأول عن طريق نفض الغبار لوحة. قم بإزالة المابير من الغسيل الثاني بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات للتأكد من إزالة كامل حجم الغسيل المتوسط. لا تزعج بيليه.
- إعادة تعليق الـ EtBr المسمى IEs في 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة / البلازما / محلول المصل المعدة في التركيزات المطلوبة في وسط ثقافة الطفيليات.
- وتشمل دائما الضوابط التالية (الشكل S2B): عنصر تحكم بدون التحكم في الخلايا IEs/THP-1 (ثقافة الطفيليات المتوسطة); سيطرة دون أي جسم مضاد أو البلازما / المصل (غير opsonized السيطرة)؛ سيطرة إيجابيّة يستعمل ال يتوفّر تجاريّا أرنبة [أنتيّ-هرثوتي] إنسانيّة في 1:100 تخفيف (رأيت جدول المواد); جهازي تحكم سلبيين في البلازما/المصل عند التخفيف 1:5 (بركة تجمّع للملاريا - ساذجة وبركة من الذكور المعرضين للملاريا)؛ والسيطرة المصل إيجابية في 1:5 تخفيف (بركة من النساء المعرضة للملاريا، الذين كانوا في السابق الحوامل (ويفضل multigravidae)).
ملاحظة: يبدو أن تخفيف 1:100 للتحكم الإيجابي يعمل باستمرار عبر دفعات مختلفة من الأجسام المضادة المشتراة (البيانات غير المعروضة). ومع ذلك، فمن المستحسن استبعاد الاختلافات بين دفعات عن طريق اختبار عدة المخففات في كل مرة يتم فيها استخدام دفعة جديدة من الأجسام المضادة. - احتضان لمدة 45 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية.
- اتخاذ تعليق IE المعدة في 1.6 وضبط عدد الخلايا إلى 3.3 × 107 IEs /mL عن طريق إضافة الطفيلي ثقافة المتوسطة EtBr لتحقيق تركيز النهائي من 2.5 μg / مل (1:40 تخفيف، من 0.1 ملغ / مل الأسهم).
- THP-1 إعداد الخلايا والبلعوم
- بينما يتم opsonized IEs (3.2.8) ، والبدء في إعداد الخلايا THP - 1.
- إزالة الخلايا THP-1 من قارورة الثقافة، تدور عليها (500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة)، decant ة فائقة وإعادة تعليق بيليه في خلية THP-1 المتوسطة.
- تدور مرة أخرى (500 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة)، وdedeant عظمى وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من THP-1 خلية ثقافة المتوسطة.
- تحديد عدد الخلايا في الحل المعد أعلاه وإضافة أكثر المتوسطة للحصول على تركيز النهائي من 5 × 55 الخلايا / مل.
- إزالة حل حجب من لوحة 96 جيدا المتبقية (بلوح البلعوم) عن طريق نفض الغبار لوحة وإزالة فائض السائل على قطعة من الورق منشفة.
- إضافة 100 μL في بئر من THP-1 تعليق الخلية أعدت في 3.3.4 ووضعها مرة أخرى في حاضنة ثقافة الخلية(الشكل S2C).
- مرة واحدة في الوقت الذي انتهت حضانة الجسم المضاد / البلازما / المصل، إضافة 170 ميكرولتر في بئر من الطفيليات ثقافة المتوسطة. تدور لوحة في 500 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant عن طريق نفض الغبار لوحة على حاوية النفايات المناسبة.
- غسل الـ IEs opsonized مرتين 200 ميكرولتر لكل بئر من متوسطة ثقافة الطفيليات، والغزل لوحة في 500 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يمكن إزالة المابير من الغسيل الأول عن طريق نفض الغبار لوحة. قم بإزالة المابير المُتفَاَجرة بعناية من الغسل الثاني، باستخدام ماصة متعددة القنوات للتأكد من إزالة حجم الغسيل بالكامل. لا تزعج بيليه.
- وأخيرا إعادة تعليق IEs opsonized في 100 ميكرولتر من قبل الدافئة THP-1 خلية ثقافة المتوسطة. نقل 50 ميكرولتر من تعليق IE opsonized إلى كل بئر في لوحة البلعمية. منذ هناك ما مجموعه 100 ميكرولتر من الكيانات الدولية، كل الجسم المضاد / الدموم تخفيف يمكن تشغيلها في التكرارات في لوحة البلعمية (الشكل S2D)
ملاحظة: مقدار IEs و THP-1 الخلايا المستخدمة في مقايسة تتوافق مع نسبة 10:1. - احتضان لمدة 40 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: لا تسمح للبلعم أن تستمر لأكثر من 40 دقيقة. - وقف البلعوم بواسطة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية (500 س ز، 5 دقائق) وتجاهل supernatant عن طريق نفض الغبار لوحة. إضافة 150 μL من درجة حرارة الغرفة lysing محلول كلوريد الأمونيوم (جدول المواد) ومزيج عن طريق pipetting، واحتضان لمدة 3 دقائق بالضبط.
ملاحظة: هذه الخطوة سوف lyse كريات الدم الحمراء التي لم يتم برهاب الخلايا THP-1. - وقف تحلل بإضافة 100 ميكرولتر من الجليد الباردة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني. قم ب تدوير اللوحة عند 4 درجات مئوية (500 × ز لمدة 3 دقائق) وأزل المناط عن طريق تحريك اللوحة فوق حاوية نفايات مناسبة.
- غسل ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر في بئر من الجليد الباردة 2٪ FBS في PBS الغزل لوحة في 4 درجة مئوية (500 × ز لمدة 3 دقائق). بعد الغسيل النهائي، إعادة تعليق في 200 ميكرولتر من الجليد البارد 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني وتحليل فورا عن طريق تدفق القياسات.
ملاحظة: استخدمت المنشورات السابقة تثبيت الخلايا في 2٪ شبهformaldehyde قبل تدفقcytometry 31، ولكن تم الحصول على النتائج المقدمة هنا مباشرة بعد الانتهاء من الفحص. لا ينصح بتأجيل تدفق الحصول على البيانات قياس الخلايا عن طريق تخزين لوحة في 4 درجة مئوية، منذ النسبة المئوية من EtBr+ THP-1 الخلايا يتحلل بسرعة (الشكل S3).
- تدفق عملية اكتساب وتحليل قياس التحلل
ملاحظة: يمكن استخدام أي مقياس تدفق للتدفق يدعم تنسيق 96 لوحة البئر، ويمكن استخدام الليزر/الفلاتر المناسبة لقياس الفلورس EtBr.- للحصول على, البوابة على THP-1 الخلايا باستخدام الخطية إلى الأمام مبعثر (FSC) مقابل الخطية الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة باستخدام الآبار لم يتم إضافة IEs(الشكل 2A)والحصول على 10,000 الأحداث على هذه البوابة.
- قياس كثافة الفلورنس لEtBr (FL3-Log) على بوابة THP-1 باستخدام مخطط مدرج بياني.
- بالنسبة للبوابات، البوابة الأولى على خلايا THP-1 في مؤامرة كثافة FSC مقابل SSC، باستخدام الآبار لم يتم إضافة IEs (الشكل 2A). ثم اقامة بوابة إيجابية في الرسم البياني FL3 (EtBr) ، وذلك باستخدام الخلايا THP - 1 (لا IEs المضافة) والسيطرة غير opsonized (الشكل 2B).
- نسخ هذه البوابات في جميع العينات الأخرى التي تم اختبارها في نفس اللوحة وتحديد النسبة المئوية للخلايا THP-1 إيجابية ETBr (THP-1 الخلايا التي تم بزميمها على الأقل IE واحد). لكل عينة من العينات التي تم اختبارها، يمكن الإبلاغ عن البلعوم على أنه القيم المطلقة (النسبة المئوية للخلايا EtBr+ THP-1) أو كبلع دمع نسبي محسوب كنسبة مئوية باستخدام التحكم الإيجابي كحد أقصى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا نقدم بالتفصيل بروتوكول سبق أن وصفت31 واستخدمت11،12،13،14،15،16،17،18 لقياس قدرة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح P. falciparum IEs للحث على أوسونية والبلعمة من قبل الخلايا THP - 1.
يقيس الفحص على وجه التحديد البلعمة التي تتوسطها الأجسام المضادة ، وبالتالي ، مطلوب التفاعل مع مستقبلات Fc المناسبة على سطح خلايا THP-1. لهذا السبب، وكما ذكر في البروتوكول، نوصي دوريا التحقق من التعبير Fcγ مستقبلات على سطح الخلايا THP-1 عن طريق تدفق cytometry. يجب أن تكون الخلايا سالبة لـ CD16(الشكل 1A)وإيجابية لـ CD32 و CD64(الشكل 1B, C).
بالنسبة للمقايسة ، تم تصنيف الـ IEs في المراحل المتأخرة المنقية مع EtBr ثم تم وضعها مع الأجسام المضادة الموجودة في البلازما / المصل للأفراد المُسمَّين بالملاريا الساذج أو المعرضين للملاريا. تم قياس البلعوم بواسطة قياس التدفق، وتحديد النسبة المئوية للخلايا EtBr+ THP-1 بعد 40 دقيقة حضانة المشاركة مع EtBr المسمى ومضادات الأجسام opsonized IEs. في البداية، تم بوابات الخلايا THP-1 باستخدام FSC مقابل مؤامرة كثافة SSC (الشكل 2A). ثم، تم إنشاء علامةEtBr + ، وذلك باستخدام الرسم البياني FL3 على الخلايا THP -1 و IEs غير opsonized (الشكل 2B). ثم استخدمت هذه البوابات لتحليل جميع عناصر التحكم الأخرى وعينات الاختبار.
الضوابط السلبية (بما في ذلك الخلايا THP-1 وحدها، والسيطرة على IE un-opsonized، والضوابط مع الذكور الملاريا السذاجة والملاريا المعرضة) ينبغي أن تولد كل ذروة سلبية واحدة في قناة FL3(الشكل 3A)مع أحداث قليلة فقط في EtBr+ علامة. وفقا لذلك، وينبغي أن تكون القيم البلعوية المتوسطة على حد سواء كما ETBrالمطلقة + خلايا THP-1 والنسب المئوية النسبية البلعميات منخفضة جدا(الشكل 3B, C,عادة أقل من 2% لجميع الحالات). وعلى النقيض من ذلك، فإن الضوابط الإيجابية (بما في ذلك الأجسام المضادة للكروية المضادة للإنسان والأرنب المضادة للكرانس البشري وبركة الإناث المعرضة للملاريا) ينبغي أن تولد آثاراً ذات ذرتين(الشكل 3A):سلبية واحدة (تتداخل إلى حد كبير مع تلك التي تولدها جميع الضوابط السلبية) وواحدة إيجابية ومفصلة بشكل جيد بوضوح تقع داخل علامة EtBr+ . وينبغي أن تُولِّد العينة الإيجابية، كما هو الحال في المثال المعروض (عينة من امرأة متعددة الأعراق معرضة للملاريا/NF20) صورة مشابهة للضوابط الإيجابية. وكانت قيم البلعوم المتوسط، مقيسة كخلايا مطلقة من EtBr+ THP-1 وكبلعة نسبية، هي الأعلى عادة في المكافحة الإيجابية (58٪/100٪)، تليها بركة الإناث المعرضة للملاريا (29٪/53٪)، ثم المرأة الوحيدة المعرضة للملاريا (23٪/40٪). كما لوحظ في الشكل 3B, C, حيث يتم عرض ثلاث تجارب مستقلة, كان هناك تباين كبير بين التجارب، ولذلك، نوصي بتشغيل عينات مخصصة للمقارنة في نفس التجربة. في أيدينا، يمكن التعامل مع ما لا يقل عن أربعة لوحات 96 بئر كاملة من قبل باحث واحد من ذوي الخبرة. كما لوحظت التقلبات بين عمليات الفحص بوضوح عندما أجريت تجربتان متطابقتان لاختبار عدة عينات من المصل من النساء المعرضات للملاريا في وقت واحد. واستُخدم نفس إعداد الطفيليات (بعد التنقية المغناطيسية للـ IEs المتأخرة) وتم تخفيف الأمصال. تم الاحتفاظ بخلايا THP-1 في قاررتين منفصلتين ولكن تم زرعها من نفس القارورة الأولية وتم إجراء التجارب من قبل باحثين مختلفين. على الرغم من أن المقايسة يبدو أن تولد نتائج متسقة عند تنفيذها بشكل منفصل، مع ارتباط خطي ضيق (r> 0.9 لكل من القيم البلعمية المطلقة والنسبية) بين قيم البلعمة التي تم قياسها في تجربتين، فإن معامل انحدار الخطوط المعدلة ينحرف عن واحدة، مما يشير إلى أن القيم المتولدة في تجارب مختلفة لم تكن متطابقة. وكان هذا الانحراف أكثر وضوحاً للقيم المطلقة (فاصل ثقة معامل الميل 0.55-0.72) مقارنة بالقيم النسبية (فاصل الثقة بمعامل الميل 0.68-1) (الشكل 4). ولذلك، نوصي باستخدام القيم النسبية، خاصة إذا كان لسبب ما (على سبيل المثال، عدم وجود عدد كاف من الكيانات المتكاملة النقية، وأكثر من 4 ألواح كاملة، وما إلى ذلك) لا يمكن تشغيل جميع العينات في تجربة واحدة. نوصي أيضا تشغيل التجارب المعدة للتحليل المقارن في غضون أقصر فترة من الزمن، لتجنب إدخال اختلافات إضافية بسبب الانجراف في التعبير PfEMP1 (فضلا عن مستضدات أخرى) وبسبب الاختلافات الدقيقة على الخلايا THP-1 على تمديد الوقت في الثقافة.
الشكل 1: مستقبلات Fc التي تم التعبير عنها على سطح الخلية THP-1.
(A) Fcγ مستقبلات III/CD16 (أحمر). (ب) Fcγ-مستقبلات II/CD32 (الأخضر). ج. Fcγ مستقبلات I/CD64 (برتقالي). تظهر الخلايا غير المسماة باللون الأزرق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية جسور الغسور في عملية تدفق الانبعاثات.
(أ) THP-1 الخلايا بوابات على FSC / SSC. (ب) Ethidium بروميد إيجابية (EtBr+) THP -1 الخلايا في الرسم البياني FL3. الخلايا THP-1 وحدها / لا IEs وأضاف (الأزرق) ، THP - 1 الخلايا المحتضنة مع IEs غير opsonized (الأخضر) ، والخلايا THP - 1 المحتضنة مع IEs opsoned مع التحكم الإيجابي (الأحمر) تظهر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التهاب البلعوم من IT4VAR04-IEs بواسطة خلايا THP-1.
(أ)تمثيل تدفق الرسم البياني لقطرات القياس من إحدى التجارب المقدمة في B (التي تم تحديدها بواسطة رموز أكبر). (ب) النسبة المئوية لخلايا EtBr+ THP-1 (وسائل الانحرافات المعيارية لثلاث تجارب مستقلة). (C) نفس البيانات كما هو الحال في B، بعد التطبيع ضد التحكم الإيجابي المقابل. ترميز الألوان هو نفسه في جميع اللوحات: THP وحدها (أسود)، غير opsonized / لا السيطرة على الأجسام المضادة (الأزرق)، الملاريا السذاجة السيطرة (سماوي)، تجمع الذكور المعرضة للملاريا (الأخضر)، تجمع الإناث المعرضة للملاريا (البرتقالي)، متبرعة تتعرض للملاريا الإناث (الوردي)، ومكافحة إيجابية / الأرانب الكريات الحمراء المضادة للإنسان (أحمر). يتم عرض الانحرافات المعيارية والوسم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التهاب البلعوم من IT4VAR04 IEs بواسطة خلايا THP-1 عند الوسونية مع المصل من 10 نساء يتعرضن للملاريا.
تقدم المؤامرات تحليل الانحدار الخطي لاثنين من التجارب متطابقة التي أجريت في نفس اليوم، ولكن من قبل باحثين مختلفين. (أ)البيانات المقدمة كقيم مطلقة وكما (B) القيم البلمائي النسبي. تحليل تم إجراؤه باستخدام برامج التحليل الإحصائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل S1: مخطط فحص البلعوم. مخطط تدفقي يصور الخطوات الرئيسية للمقايسة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل S2: 96 جيدا لوحة تخطيط التجربة. (A) تخطيط للعلامة EtBr إي إي. (ب) تخطيط لـ opsonization؛ يتم حجز 6 آبار دائمًا لعناصر التحكم. (C) تخطيط ل THP خلايا الطلاء. (D) تخطيط للبلع. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل S3: ترميز الألوان كما هو الحال في الشكل 3. (أ)تدفق تراكب الرسم البياني للخلايا من تجربة واحدة المكتسبة على الفور و (B)بعد التخزين في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة(ج) النسبة المئوية لـ EtBr+ THP-1 الخلايا التي تقاس قبل وبعد التخزين. تمثل NF## مختلف المتبرعات المعرضات للملاريا. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول المقدم هنا قد سبق وصفه واستخدامه12،15،17،31 لقياس قدرة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح P. falciparum IEs للحث على opsonization والبلعوم من قبل الخلايا THP - 1. وتركز النتائج المقدمة هنا على الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها بشكل طبيعي VAR2CSA في البلازما / المصل للنساء اللواتي يعشن في منطقة متوطنة P. falciparum. VAR2CSA هو نوع من PfEMP1 المشاركة في عزل المشيمة من الكيانات الدولية، ومحدد رئيسي في التسبب في PM.
ويمكن استخدام المقايسة للأجسام المضادة الناجمة عن التحصين و/أو استهداف المتغيرات الأخرى PfEMP1 أو أي مستضد طفيلي آخر موجود على سطح IE، شريطة أن يتفاعل الجسم المضاد المختبر مع مستقبلات Fc-γ البشرية التي تعبر عنها خلايا THP-1 (CD32 و CD64). المقايسة بسيطة، عالية الإنتاجية (مما يسمح بتحليل مجموعات عينة كبيرة) ويمكن تنفيذها في يوم واحد. يتم قياس البلعوم بواسطة قياس الخلايا المتدفقة، وتحديد النسبة المئوية للخلايا EtBr+ THP-1 بعد 40 دقيقة الحضانة المشتركة مع EtBr المسمى ومضادات الأجسام opsonized IEs.
على الرغم من أن المقايسة تعطي نتائج متسقة على النسخ المتماثل التجريبية، هناك تباين بين القيم المطلقة التي تم قياسها، وبالتالي، نوصي بحساب القيم النسبية باستخدام عنصر تحكم موجب يجب تضمينه دائمًا. نوصي أيضا بتشغيل جميع العينات ليتم اختبارها في تجربة واحدة، لتجنب الاختلاف بين التحاليل كما نوقش أعلاه. عند اختبار عينات المصل التي تم جمعها من الأفراد المعرضين لعدوى P. falciparum ، نوصي دائمًا بإدراج مجموعة من العينات من الأفراد الساذج لاستخدامها كمجموعة تحكم. يمكن استخدام مجموعة التحكم هذه لإعداد عتبة لتحديد أي من عينات الاختبار الخاصة بك تعتبر موجبة.
وقد سبق أن استخدمنا هذا النهج لمقارنة قدرة تحفيز البلعميات من اليرا التي جمعت من الأطفال الذين يعانون من مختلف العروض السريرية الملاريا (شديدة مقابل خفيفة)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
مايكن فيستي هو الشكر للمساعدة التقنية الممتازة. وقد تم تمويل هذا العمل جزئياً من منحة (MAVARECA II؛ 17-02-KU) من وزارة الخارجية في الدانمرك، ويديرها مركز زمالة دانيدا. ولم يكن للممول أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعدادها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
