Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.
Abstract
Das Protokoll beschreibt, wie ein Flusszytometrie-basierte Phagozytose-Assay von Plasmodium falciparum-infizierte Erythrozyten (IEs) von natürlich erworbenen IgG-Antikörpern speziell für VAR2CSA opsonisiert. VAR2CSA ist das Parasiten-Antigen, das die selektive Sequestrierung von IEs in der Plazenta vermittelt, die bei Schwangeren eine schwere Form von Malaria verursachen kann, die Plazenta-Malaria (PM). Der Schutz vor PM wird durch VAR2CSA-spezifische Antikörper vermittelt, von denen angenommen wird, dass sie funktionieren, indem sie die Plazentasese hemmen und/oder IEs für Phagozytose opsonisieren. Der Test verwendet spätstufensynchronisierte IEs, die in vitro ausgewählt wurden, um VAR2CSA, Plasma-/Serum-Antikörper von Frauen mit natürlich erworbener PM-spezifischer Immunität und die phagozytische Zelllinie THP-1 auszudrücken. Das Protokoll kann jedoch leicht geändert werden, um die Funktionalität von Antikörpern gegen jedes auf der IE-Oberfläche vorhandene Parasiten-Antigen zu überprüfen, unabhängig davon, ob es durch natürliche Exposition oder durch Impfung induziert wird. Der Assay bietet eine einfache und hochdurchsatzige Auswertung eines wichtigen funktionellen Aspekts der antikörpervermittelten Immunität bei Malaria mit guter Reproduzierbarkeit. Es ist daher nützlich bei der Bewertung der klinischen Immunität gegen P. falciparum Malaria, eine DerHauptursache von Morbidität und Mortalität in den Tropen, insbesondere in Afrika südlich der Sahara.
Introduction
Malaria ist eine vektorübertragene Krankheit, die beim Menschen bei einer Infektion mit fünf verschiedenen Arten der Gattung Plasmodiumverursacht wird. Die am weitesten verbreitete Art ist P. falciparum, die auch für die meisten Morbidität und Sterblichkeit verantwortlich ist1. Die klinische Darstellung von Malaria variiert von asymptomatischen oder gutartigen Infektionen bis hin zu komplizierten/schweren Erkrankungen, wobei letztere meist bei Kindern unter fünf Jahren auftritt. Die Exposition gegenüber P. falciparum induziert keine sterile Immunität, aber Personen, die in endemischen Gebieten leben, entwickeln langsam Immunität gegen die klinische Krankheit. Der Schutz ist alters-/expositionsabhängig und die Immunität wird normalerweise während der ersten 5-10 Lebensjahre erworben2. Erwachsene Frauen sind eine wichtige Ausnahme, da schwere Malaria während der Schwangerschaft in einer klinischen Präsentation auftreten kann, die als Plazenta-Malaria (PM) bekannt ist. PM ist eine wichtige Ursache für Abtreibung, Totgeburt, vorzeitige Geburt, niedriges Geburtsgewicht, fetalen Tod und mütterliche Anämie. Widerstand gegen PM entwickelt sich über aufeinander folgende Schwangerschaften3. Der Schutz vor PM ist mit dem Erwerb von Antikörpern gegen DEN VAR2CSA-Typ PfEMP14,5, ein infiziertes Erythrozyten(IE) Oberflächenantigen verbunden, das an Chondroitinsulfat A (CSA) bindet, das die IE-Sequestrierung in der Plazenta ermöglicht. Antikörper vermitteln Schutz durch verschiedene funktionelle Aktivitäten (überprüft in6,7), einschließlich der Opsonisierung von IEs, um Phagozytose zu induzieren. Frühe In-vitro-Studien zeigten, dass Antikörper das Wachstum von P. falciparum in Gegenwart von Monozyten über Phagozytose8,9begrenzen können. Neuere Studien haben gezeigt, dass höhere Konzentrationen von phagozytoseinduzierenden Antikörpern mit besseren Schwangerschaftsergebnissen (im Zusammenhang mit einer HIV-Koinfektion) verbunden sind10,11, was auf die Relevanz dieser Effektorfunktion in der natürlich erworbenen Immunantwort hinweist.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung dieser Funktion von Antikörpern im menschlichen Plasma/Serum vor, wobei in vitro kultivierte IEs VAR2CSA zusammen mit der Monozytenlinie THP-1 exezieren. Der Assay wurde zuvor11,12,13,,14,15,16,17,18 und gilt als ein verbesserter und einfacher Ansatz im Vergleich zu früheren mikroskopischen Protokollen8, da er das Testen einer größeren Anzahl von Antikörperproben in einem einzigen Durchlauf mit kleineren Mengen an Antikörpern ermöglicht und mühsame und voreingenommene Mikroskopiezählung vermeidet. Obwohl der Test von mehreren Laboratorien verwendet wurde und seine Ausführung einfach genug ist, erfordert er eine sorgfältige Planung und Vorbereitung, daher würde ein detailliertes Protokoll seine Anwendung durch Laboratorien und Forscher ohne vorherige Erfahrung ermöglichen. Wir verwenden als Beispiel spätstufensynchronisierte IEs, die VAR2CSA mit Antikörpern ausdrücken, die in Serum enthalten sind und von Frauen mit natürlich erworbener PM-spezifischer Immunität gesammelt wurden. Das Protokoll kann jedoch leicht geändert werden, um die Funktionalität von Antikörpern gegen jedes auf der IE-Oberfläche vorhandene Parasiten-Antigen zu überprüfen, unabhängig davon, ob es durch natürliche Exposition oder durch Impfung induziert wird.
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Protocol
Die menschlichen Serumproben, die für die hier vorgestellten Ergebnisse verwendet wurden, wurden in einer separaten Studie19gesammelt. Die Sammlung wurde vom Institutional Review Board des Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana (Studie 038/10-11) und von den Regionalen Forschungsethikkommissionen, Hauptstadtregion Dänemarks (Protokoll H-4-2013-083), genehmigt.
1. Parasitenkultur
HINWEIS: Befolgen Sie die lokalen Vorschriften für den Umgang mit menschlichen Krankheitserregern.
- Pflegen Sie P. falciparum Parasiten nach dem Standardprotokoll, wie vor20 im Parasitenkulturmedium beschrieben (siehe Tabelle der Materialien).
- Halten Sie die Parasiten eng synchronisiert mit Sorbitol-Behandlung wie zuvor beschrieben21.
- Um die VAR2CSA-Expression auf der Oberfläche des IE zu gewährleisten, führen Sie wiederholte Runden der immunmagnetischen Selektion mit einem Anti-VAR2CSA-Antikörper (z. B. PAM1.4-Antikörper, einem kreuzreaktiven humanen monoklonalen VAR2CSA-spezifischen IgG22) gekoppelt mit Protein G-Magnetperlen23durch.
- Kurz gesagt, inkubieren Spätstadium Trophozoit-IEs mit magnetischen Perlen gekoppelt an einen Anti-VAR2CSA-Antikörper und positiv wählen Mit einem Magneten.
- Erweitern Sie die ausgewählten Parasiten in der Kultur für ein paar Zyklen, bis Parasitenämie mindestens 5% beträgt.
- Alternativ können Sie Parasiten auswählen, die an die kunststoffimmobilisierte CSA (den Rezeptor für VAR2CSA) binden, wie zuvor beschrieben24.
- Um die VAR2CSA-Expression auf die ausgewählten Parasiten zu überprüfen, führen Sie die Durchflusszytometrie wie zuvor beschrieben25durch.
- Kurz gesagt, beschriften Sie die späten Trophozoit-IEs mit dem gleichen Antikörper, der für die magnetische Selektion verwendet wird (Schritt 1.3), gefolgt von einem fluoreszierend markierten Sekundärantikörper.
- Messen Sie die IE-Oberflächenreaktivität durch Durchflusszytometrie. Eine erfolgreiche Antikörperauswahl führt normalerweise zu einer Parasitenpopulation, die VAR2CSA bei den meisten Parasiten ausdrückt (≈80%).
- Für den Phagozytose-Test verwenden Sie gereinigte Trophozoit-IEs im mittleren bis späten Stadium. Durchführen der Reinigung mittels magnetischer Trennung wie zuvor beschrieben26.
HINWEIS: Um das Stadium der Parasiten genau zu bestimmen, führen Sie Giemsa Färbung auf Blutabstriche gefolgt von Lichtmikroskopie Beobachtung. Befolgen Sie die vor27beschriebenen Standardverfahren und morphologischen Richtlinien. Die Spätreinigungsstufe kann auch mit dem Dichtegradientenmedium durchgeführt werden. Die IE-Ausbeute ist unserer Erfahrung nach jedoch geringer und daher ist eine magnetische Reinigung vorzuziehen.- Für die magnetische Trennung, spinnen Sie die Parasitenkultur (5-10% Parasitenämie) bei 500 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 10 ml Parasitenkulturmedium wieder auf.
- Fügen Sie die Parasitensuspension in eine AN einen Magneten gekoppelte CS-Säule (siehe Materialtabelle)ein und lassen Sie sie langsam durch die Spalte passieren. Trophozoit-IEs sind paramagnetisch (aufgrund des Vorhandenseins von Hämozoin) und bleiben im Säulennetz.
- Waschen Sie die Säule mit 50 ml Parasitenkulturmedium und löschen Sie die IEs aus der magnetischen Säule mit 50 ml Parasitenkulturmedium.
- Drehen Sie das Eluat von 1.5.3 bei 500 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand sorgfältig und setzen Sie ihn in 1 ml Parasitenkulturmedium wieder aus.
- Mit Hilfe eines Hämozytometers zählen Sie die Anzahl der IEs (leicht identifiziert durch Lichtmikroskopie als Erythrozyten mit dunklem Hämozoinpigment) und die Gesamtzellzahl, um die endgültige Parasitemie (Prozentsatz der IEs) zu berechnen.
HINWEIS: Verwenden Sie nur Parasiten mit mindestens 80% Reinheit (80% IEs). - Schätzen Sie anhand der Anzahl der für die Tests geplanten Serum-/Antikörperproben die Gesamtmenge der benötigten IEs und skalieren Sie die Parasitenkulturen entsprechend. Ein 75 cm2 Kulturkolben mit 25 ml Kultur bei 5% Hämatokrit und 5-10% Parasitemie sollte genügend IEs ergeben, um eine volle 96-Well-Platte zu betreiben. Für eine Vollplatte (42 Proben plus 6 in doppelter Ausführung) ist eine mindestens 1,5 ml Parasitensuspension bei 3,3 x 107 IEs/ml erforderlich.
2. THP-1-Zellen
HINWEIS: Die THP-1-Zelllinie wird in diesem Test verwendet. Diese Monozyten-Zelllinie wird von einem Patienten mit monozytischer Leukämie28 abgeleitet und kann bei ATCC erworben werden. Verwalten Sie die Zelllinie gemäß den Anweisungen des Anbieters im THP-1-Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien).
- Für eine regelmäßige Wartung beginnen Sie die THP-1-Zellkultur bei 2-4 x 105 Zellen/ml und Subkultur, wenn die Zellkonzentration 8 x 105 Zellen/ml erreicht.
HINWEIS: Lassen Sie die Zellkonzentration nicht 1 x 106 Zellen/ml überschreiten und verfolgen Sie die Durchgangsnummer. Vermeiden Sie die Verwendung von Zellen, die über Durchgang 25 hinausgehen. Die durchschnittliche Verdoppelungszeit der THP-1-Zelllinie variiert zwischen 19-50 h. Bestimmen Sie die Verdoppelungszeit der Zellcharge, bevor Sie mit den Phagozytoseexperimenten beginnen. Dies wird dazu beitragen, die notwendige Kulturmenge, die für eine bestimmte Anzahl von zu testenden Serumproben erforderlich ist, grob abzuschätzen (z. B. für eine volle 96-Wellplatte werden 10 ml Kultur bei 5 x 105 Zellen/ml benötigt). - Überprüfen Sie regelmäßig die THP-1-Zellen auf die Oberflächenexpression der Fc-Rezeptoren I (CD64), II (CD32) und III (CD16) wie zuvorbeschrieben 15.
- Kurz gesagt, färben Sie die THP-1-Zellen (separat) mit Anti-CD64, Anti-CD32 und Anti-CD16 fluoreszierend markierte Antikörper (Tabelle der Materialien) für 30 min bei Raumtemperatur (1:100 Verdünnung in 2% FBS in PBS) hergestellt.
- Waschen Sie dreimal mit 2% FBS in PBS und messen Sie die Oberflächenfärbung durch Durchflusszytometrie.
HINWEIS: Die THP-1-Zellen sind negativ für CD16 und positiv für CD32 und CD64, wie zuvor berichtet29,30 (Abbildung 1).
- Für den Phagozytose-Test richten Sie am Tag vor dem Experiment einen THP-1-Zellkulturkolben mit 2,5 x 105 Zellen/ml ein, um am Tag des Assays etwa 5 x 105 Zellen/ml zu ergeben.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass am Tag des Assays 4-6 x 105 Zellen/ml vorhanden sind.
3. Phagozytose-Assay (Abbildung S1)
- Vor Beginn des Testes (>1 h) zwei runde 96-Wellplatten (eine für die Opsonisierung und eine weitere für die Phagozytose) mit 150 l pro Bohrung steriler 2% FBS in PBS blockieren.
HINWEIS: Etikettierungsplatte 1 als Opsonisationsplatte und verwenden Sie sie sowohl für Diebesfärbung als auch für die Opsonisierung von Ethidiumbromid (EtBr). Beschriften Sie Platte 2 als Phagozytoseplatte und verwenden Sie sowohl für thP-1 Zellbeschichtung als auch für den Phagozytoseschritt. - Parasitenfärbung und Opsonisierung
- Nehmen Sie die in 1,6 hergestellte IE-Suspension und passen Sie die Zellzahl auf 3,3 x 107 IEs/ml an, indem Sie Parasitenkulturmedium und EtBr hinzufügen, um eine Endkonzentration von 2,5 g/ml (1:40 Verdünnung, aus einem 0,1 mg/ml-Bestand) zu erreichen.
HINWEIS: EtBr färbt die Parasiten-DNA und ermöglicht den Nachweis durch Durchflusszytometrie.
VORSICHT: EtBr ist ein Mutagen und Haut-, Augen- und Atemreiz. Verwenden Sie einen angemessenen Schutz und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften. - Entfernen Sie die Blockierlösung von einer der 96 Brunnenplatten (Opsonisierungsplatte), flicken Sie die Platte und entfernen Sie Flüssigkeitsüberschuss über ein Stück Handtuchpapier.
- Fügen Sie 30 l pro Bohrung der oben vorbereiteten IE-Aufhängung in die obere Hälfte der Platte hinzu. Lassen Sie einen gut leer und fügen Sie 30 l Parasitenkulturmedium hinzu (ohne IEs für die THP-1-Kontrolle). (Abbildung S2A). 10 min bei Raumtemperatur inkubieren und vor Licht schützen.
- Fügen Sie 170 L pro Brunnen des Parasitenkulturmediums hinzu. Drehen Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte über einen geeigneten Abfallbehälter flicken.
- Waschen Sie die EtBr-beschrifteten IEs zwei weitere Male mit 200 l pro Brunnen des Parasitenkulturmediums, das die Platte bei 500 x g für 3 min bei Raumtemperatur spinnt. Der Überstand aus der ersten Wäsche kann durch Flicken der Platte entfernt werden. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig aus der zweiten Wäsche mit einer Mehrkanalpipette, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen des Waschmediums entfernt wird. Stören Sie das Pellet nicht.
- Setzen Sie die EtBr-markierten IEs in 30 l Antikörper-/Plasma-/Serumlösung wieder aus, die in den gewünschten Konzentrationen im Parasitenkulturmedium hergestellt werden.
- Enthalten immer die folgenden Kontrollen(Abbildung S2B):eine Steuerung ohne IEs/THP-1-Zellenkontrolle (Parasitenkulturmedium); eine Kontrolle ohne Antikörper oder Plasma/Serum (unopsonisierte Kontrolle); eine positive Kontrolle mit dem handelsüblichen Kaninchen antihumanen Erythrozyten-Antikörper bei 1:100 Verdünnung (siehe Materialtabelle); zwei negative Plasma-/Serumkontrollen bei 1:5-Verdünnung (ein Malaria-naiver Pool und ein Pool von malariaexponierten Männchen); und eine positive Serumkontrolle bei 1:5 Verdünnung (ein Pool von Malaria-exponierten Frauen, die zuvor schwanger waren (vorzugsweise Multigravida)).
HINWEIS: Eine Verdünnung von 1:100 für die Positivkontrolle scheint konsistent über verschiedene Chargen von gekauften Antikörpern zu wirken (Daten werden nicht angezeigt). Es wird jedoch empfohlen, Abweichungen zwischen chargen auszuschließen, indem jedes Mal, wenn eine neue Charge Antikörper verwendet wird, mehrere Verdünnungen getestet werden. - 45 min im Dunkeln bei 37 °C inkubieren.
- Nehmen Sie die in 1,6 hergestellte IE-Suspension und passen Sie die Zellzahl auf 3,3 x 107 IEs/ml an, indem Sie Parasitenkulturmedium und EtBr hinzufügen, um eine Endkonzentration von 2,5 g/ml (1:40 Verdünnung, aus einem 0,1 mg/ml-Bestand) zu erreichen.
- THP-1-Zellpräparat und Phagozytose
- Während die IEs opsonisiert werden (3.2.8), beginnen Sie mit der Vorbereitung der THP-1-Zellen.
- Entfernen Sie die THP-1-Zellen aus dem Kulturkolben, spinnen Sie sie nach unten (500 x g für 5 min bei Raumtemperatur), dekantieren Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet im THP-1-Zellkulturmedium wieder auf.
- Drehen Sie erneut (500 x g für 5 min bei Raumtemperatur), dekantieren Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in 1 ml THP-1-Zellkulturmedium wieder auf.
- Bestimmen Sie die Zellzahl in der oben vorbereiteten Lösung und fügen Sie mehr Medium hinzu, um eine Endkonzentration von 5 x 105 Zellen/ml zu erhalten.
- Entfernen Sie die Blockierlösung von der restlichen 96-Wellplatte (Phagozytoseplatte), indem Sie die Platte flicken und Flüssigkeitsüberschuss über ein Stück Handtuchpapier entfernen.
- Fügen Sie 100 l pro Bohrung der THP-1-Zellsuspension hinzu, die in 3.3.4 zubereitet wurde, und legen Sie sie wieder in den Zellkultur-Inkubator (Abbildung S2C).
- Sobald die Inkubationszeit von Antikörper/Plasma/Serum abgelaufen ist, fügen Sie 170 L pro Brunnen des Parasitenkulturmediums hinzu. Drehen Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte über einen geeigneten Abfallbehälter flicken.
- Waschen Sie die opsonisierten IEs zwei weitere Male mit 200 l pro Brunnen des Parasitenkulturmediums, drehen Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Der Überstand aus der ersten Wäsche kann durch Flicken der Platte entfernt werden. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus der zweiten Wäsche, mit einer Mehrkanalpipette, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen des Waschmediums entfernt wird. Stören Sie das Pellet nicht.
- Schließlich setzen Sie die opsonisierten IEs in 100 L des vorgewärmten THP-1-Zellkulturmediums wieder aus. Übertragen Sie 50 l opsonisierte IE Suspension auf jeden Brunnen in der Phagozytoseplatte. Da es insgesamt 100 L IEs gibt, kann jede Antikörper-/Serumverdünnung in Duplikaten in der Phagozytoseplatte ausgeführt werden (Abbildung S2D)
HINWEIS: Die Menge der im Test verwendeten IEs- und THP-1-Zellen entspricht einem Verhältnis von 10:1. - 40 min im Dunkeln bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
HINWEIS: Lassen Sie die Phagozytose nicht mehr als 40 min. - Stoppen Sie die Phagozytose durch Zentrifugation bei 4 °C (500 x g, 5 min) und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte streichen. Fügen Sie 150 l Raumtemperatur-Ammoniumchlorid-Lysing-Lösung (Tabelle der Materialien) und mischen durch Pipettieren, inkubieren für genau 3 min.
HINWEIS: Dieser Schritt wird die Erythrozyten lysieren, die nicht von den THP-1-Zellen phagozytosisiert wurden. - Stoppen Sie die Lyse, indem Sie 100 l eiskalte 2% FBS in PBS hinzufügen. Drehen Sie die Platte bei 4 °C (500 x g für 3 min) und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte über einen geeigneten Abfallbehälter schieben.
- Waschen Sie dreimal mit 200 l pro Brunnen eiskalt 2% FBS in PBS Drehen der Platte bei 4°C (500 x g für 3 min). Nach der Endwäsche in 200 l eiskaltem 2% FBS in PBS erneut suspendieren und sofort durch Durchflusszytometrie analysieren.
HINWEIS: Frühere Veröffentlichungen haben die Zellfixierung in 2% Paraformaldehyd vor der Durchflusszytometrie31verwendet, aber die hier vorgestellten Ergebnisse wurden unmittelbar nach Abschluss des Assays erfasst. Eine Verschiebung der Durchflusszytometrie-Datenerfassung durch Lagerung der Platte bei 4°C wird nicht empfohlen, da der Prozentsatz der EtBr+ THP-1-Zellen schnell zerfällt (Abbildung S3).
- Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie
HINWEIS: Es kann jedes Durchflusszytometer verwendet werden, das das 96-Well-Plattenformat unterstützt und über die entsprechenden Laser/Filter zur Messung der EtBr-Fluoreszenz verfügen.- Für die Erfassung wurden keine IEs hinzugefügt (Abbildung 2A) und 10.000 Ereignisse auf diesem Gate erwerben.
- Messen Sie die Fluoreszenzintensität für EtBr (FL3-Log) am THP-1-Tor mithilfe eines Histogrammdiagramms.
- Für Gating, erstes Tor auf THP-1-Zellen in einem FSC vs. SSC Dichte Plot, mit den Brunnen wurden keine IEs hinzugefügt (Abbildung 2A). Richten Sie dann ein positives Tor in einem FL3 (EtBr) Histogramm ein, indem Sie die THP-1-Zellen (keine IEs hinzugefügt) und die nicht-opsonisierte Steuerung verwenden (Abbildung 2B).
- Kopieren Sie diese Tore in alle anderen Proben, die in derselben Platte getestet wurden, und bestimmen Sie den Prozentsatz der EtBr-positiven THP-1-Zellen (THP-1-Zellen, die mindestens einen IE phagozytisiert haben). Für jede der getesteten Proben kann die Phagozytose als absolute Werte (Prozentsatz der EtBr+ THP-1-Zellen) oder als relative Phagozytose als Prozentsatz berechnet werden, wobei die Positivkontrolle als Maximum verwendet wird.
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Representative Results
Hier stellen wir im Detail ein Protokoll vor, das zuvor31 beschrieben wurde und11,12,13,14,15,16,17,18 verwendet hat, um die Kapazität von Antikörpern zu messen, die auf die Oberfläche von P. falciparum IEs abzielen, um Opsonisierung und Phagozytose durch THP-1-Zellen zu induzieren.
Der Assay misst speziell die antikörpervermittelte Phagozytose und daher ist eine Wechselwirkung mit den entsprechenden Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche der THP-1-Zellen erforderlich. Aus diesem Grund und wie im Protokoll erwähnt, empfehlen wir, die Expression von Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche der THP-1-Zellen regelmäßig durch Durchflusszytometrie zu überprüfen. Die Zellen sollten negativ für CD16 (Abbildung 1A) und positiv für CD32 und CD64 (Abbildung 1B,C) sein.
Für den Test wurden gereinigte IEs im späten Stadium mit EtBr gekennzeichnet und dann mit Antikörpern im Plasma/Serum von Malaria-naiven oder Malaria-exponierten Individuen opsonisiert. Die Phagozytose wurde durch Durchflusszytometrie gemessen, wodurch der Prozentsatz der EtBr+ THP-1-Zellen nach 40 min Co-Inkubation mit EtBr-markierten und antikörper-opsonisierten IEs quantifiziert wurde. Ursprünglich wurden THP-1-Zellen mit einem FSC-vs. SSC-Dichtediagramm abgegrenzt (Abbildung 2A). Anschließend wurde ein EtBr+-Marker mit einem FL3-Histogramm auf den THP-1-Zellen und nicht-opsonisierten IEs erstellt (Abbildung 2B). Diese Tore wurden dann verwendet, um alle anderen Kontrollen und Testproben zu analysieren.
Die negativen Kontrollen (einschließlich der THP-1-Zellen allein, der nicht-opsonisierten IE-Kontrolle und der Kontrollen mit Malaria-naiven und Malaria-exponierten Männchen) sollten alle einen einzigen negativen Peak im FL3-Kanal erzeugen (Abbildung 3A) mit nur wenigen Ereignissen im EtBr+-Marker. Dementsprechend sollten die mittleren Phagozytosewerte sowohl als absolute EtBr+ THP-1-Zellen als auch als relative Phagozytose-Prozentsätze sehr niedrig sein(Abbildung 3B,C, normalerweise weniger als 2% für alle Fälle). Im Gegensatz dazu sollten die positiven Kontrollen (einschließlich des kaninchenantihumanen Erythrozyten-Antikörpers und des Malaria-exponierten weiblichen Pools) Spuren mit zwei Spitzen erzeugen(Abbildung 3A):eine negative (weitgehend überlappend mit der von allen Negativenkontrollen erzeugten) und eine deutlich positive und gut getrennte, die sich innerhalb des EtBr+-Markers befindet. Eine positive Stichprobe, wie das vorgestellte Beispiel (Probe einer Malaria-exponierten multigraviierten Frau/NF20) sollte ein ähnliches Profil wie die positiven Kontrollen erzeugen. Die mittleren Phagozytosewerte, gemessen als absolute EtBr+ THP-1-Zellen und als relative Phagozytose, waren normalerweise am höchsten für die positive Kontrolle (58%/100%), gefolgt vom Malaria-exponierten Frauenpool (29%/53%) und dann der einzigen Malaria-exponierten Frau (23%/40%). Wie in Abbildung 3B,C, in der drei unabhängige Experimente vorgestellt werden, festgestellt wurde, gab es eine erhebliche Variabilität zwischen den Experimenten, und wir empfehlen daher, Proben zu führen, die für den Vergleich im selben Experiment bestimmt sind. In unseren Händen können mindestens vier volle 96 Brunnenplatten von einem einzigen erfahrenen Forscher behandelt werden. Die Variabilität zwischen den Assays wurde auch deutlich beobachtet, als zwei identische Experimente, die mehrere Serumproben von Malaria-exponierten Frauen testeten, gleichzeitig durchgeführt wurden. Die gleiche Parasitenpräparation (nach magnetischer Reinigung von Späten-Stadium-IEs) und Serumverdünnungen wurden verwendet. THP-1-Zellen wurden in zwei separaten Kolben aufbewahrt, aber aus demselben Anfangskolben gesät und die Experimente wurden von zwei verschiedenen Forschern durchgeführt. Auch wenn der Test bei getrennter Durchführung konsistente Ergebnisse zu erzeugen scheint, mit engen linearen Korrelationen (r>0.9 für absolute und relative Phagozytosewerte) zwischen den in den beiden Experimenten gemessenen Phagozytosewerten, weicht der Neigungskoeffizient der eingestellten Linien von einem ab, was darauf hinweist, dass die in verschiedenen Experimenten generierten Werte nicht identisch waren. Diese Abweichung war für die absoluten Werte (Slope-Koeffizient-Konfidenzintervall 0,55-0,72) im Vergleich zu den relativen Werten (Neigungskoeffizient Konfidenzintervall 0,68-1) deutlicher (Abbildung 4). Wir empfehlen daher die Verwendung relativer Werte, insbesondere wenn es aus irgendeinem Grund (z. B. nicht genügend gereinigte IEs, mehr als 4 vollbeinigen Platten usw.) nicht möglich ist, alle Proben in einem einzigen Experiment auszuführen. Wir empfehlen auch, Experimente für die vergleichende Analyse innerhalb kürzester Zeit durchzuführen, um zusätzliche Variationen aufgrund von Driften in der PfEMP1-Expression (sowie anderen Antigenen) und aufgrund subtiler Unterschiede an den THP-1-Zellen bei längerer Kulturzeit zu vermeiden.
Abbildung 1: Fc-Rezeptoren, die auf der THP-1-Zelloberfläche ausgedrückt werden.
(A) Fc-Rezeptor III/CD16 (rot). (B) Fc-Rezeptor II/CD32 (grün). C. Fc-Rezeptor I/CD64 (orange). Nicht beschriftete Zellen werden blau dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Flusszytometrie-Gating-Strategie.
(A) THP-1-Zellen, die auf FSC/SSC abgeziert sind. (B) Ethidiumbromid-positiv (EtBr+) THP-1-Zellen in einem FL3-Histogramm. Gezeigt werden THP-1-Zellen allein/keine EEs (blau), THP-1-Zellen, die mit nicht-opsonisierten IEs (grün) inkubiert werden, und THP-1-Zellen, die mit IEs bezichtigen werden, die mit einer positiven Kontrolle (rot) opsonisiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Phagozytose von IT4VAR04-IEs durch THP-1-Zellen.
(A) Repräsentative Durchflusszytometrie-Histogramme einer der in B vorgestellten Experimente (identifiziert durch größere Symbole). (B) Prozentsatz der EtBr+ THP-1-Zellen (Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten). (C) Gleiche Daten wie in B, nach Normalisierung gegen die entsprechende Positivkontrolle. Die Farbcodierung ist in allen Panels gleich: THP-alone (schwarz), un-opsonized/no antikörper control (blue), malaria-naive control (cyan), malaria-exposed male pool (green), malaria-exposed female pool (orange), a malaria-exposed female donor (pink) and positive control/rabbit anti-human erythrocyten (red). Mittelwert- und Standardabweichungen werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Phagozytose von IT4VAR04 IEs durch THP-1-Zellen nach Opsonisierung mit Serum von 10 Malaria-exponierten Frauen.
Die Plots stellen eine lineare Regressionsanalyse für zwei identische Experimente dar, die am selben Tag durchgeführt wurden, jedoch von verschiedenen Forschern. (A) Daten, die als absolute Werte und als (B) relative Phagozytosewerte dargestellt werden. Analyse mit statistischer Analysesoftware durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung S1: Phagozytose-Assay-Flussdiagramm. Flussdiagramm, das die hauptschritte des Assays darstellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Abbildung S2: 96 Well Platten-Experiment-Layout. (A) Layout für IEs EtBr-Beschriftung. (B) Layout für die Opsonisierung; 6 Brunnen sind immer für Kontrollen reserviert. (C) Layout für THP-Zellen-Beschichtung. (D) Layout für Phagozytose. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Abbildung S3: Farbcodierung wie in Abbildung 3. (A) Flow-Zytometrie-Histogramm-Overlay eines Experiments, das sofort und (B) nach Lagerung bei 4 °C für 12 h erworben wurde (C) Prozentsatz der vor und nach der Lagerung gemessenen EtBr+ THP-1-Zellen. Die NF stellt verschiedene Malaria-exponierte Spenderinnen dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll wurde zuvor beschrieben und12,15,17,31 verwendet, um die Kapazität von Antikörpern zu messen, die auf die Oberfläche von P. falciparum IEs abzielen, um Opsonisierung und Phagozytose durch THP-1-Zellen zu induzieren. Die hier vorgestellten Ergebnisse konzentrieren sich auf natürlich erworbene VAR2CSA-spezifische Antikörper im Plasma/Serum von Frauen, die in einer endemischen Region P. falciparum leben. VAR2CSA ist eine Art von PfEMP1, das an der Plazentasequestrierung von IEs beteiligt ist, und ein wichtiger Determinant in der Pathogenese von PM.
Der Test kann für Antikörper verwendet werden, die durch Immunisierung und/oder andere PfEMP1-Varianten oder andere auf der IE-Oberfläche vorhandene Parasitenantigen induziert werden, sofern der getestete Antikörper mit den menschlichen Fc-Rezeptoren interagiert, die durch die THP-1-Zellen (CD32 und CD64) exprimiert werden. Der Assay ist einfach, mit hohem Durchsatz (ermöglicht die Analyse großer Probensätze) und kann an einem Tag durchgeführt werden. Die Phagozytose wird durch Durchflusszytometrie gemessen, die den Prozentsatz der EtBr+ THP-1-Zellen nach 40 min Co-Inkubation mit EtBr-markierten und antikörper-opsonisierten IEs quantifiziert.
Obwohl der Test konsistente Ergebnisse gegenüber experimentellen Replikationen liefert, gibt es eine Variabilität zwischen den gemessenen absoluten Werten, und daher empfehlen wir, relative Werte mit einer positivgesteuerten Steuerung zu berechnen, die immer einbezogen werden muss. Wir empfehlen auch, alle Proben auszuführen, die in einem einzigen Experiment getestet werden sollen, um Inter-Assay-Variationen wie oben beschrieben zu vermeiden. Bei der Prüfung von Serumproben, die von Personen entnommen wurden, die einer P. falciparum-Infektion ausgesetzt waren, empfehlen wir immer, eine Reihe von Proben von naiven Personen als Kontrollgruppe zu verwenden. Diese Kontrollgruppe kann verwendet werden, um einen Schwellenwert einzurichten, um zu bestimmen, welche Ihrer Testproben als positiv zu betrachten sind.
Wir haben diesen Ansatz zuvor verwendet, um die Phagozytose-induzierende Kapazität von Seren zu vergleichen, die von Kindern mit verschiedenen klinischen Malaria-Präsentationen (schwer vs. mild) gesammelt wurden17.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Maiken Visti wird für die hervorragende technische Unterstützung gedankt. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium (MAVARECA II; 17-02-KU) des dänischen Außenministeriums finanziert und vom Danida Fellowship Centre verwaltet. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
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