Summary
उपजी कोशिकाओं को लगातार मायोकार्डियल क्षति वाले व्यक्तियों के लिए संभावित उपचार के रूप में जांच की जाती है, हालांकि, घायल ऊतकों के भीतर उनकी कम व्यवहार्यता और प्रतिधारण उनकी दीर्घकालिक प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है। इस पांडुलिपि में हम इस्केमिया रिपरफ्यूजन चोट के एक मुरीन मॉडल में स्टेम सेल डिलीवरी के लिए एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
मायोकार्डियल चोटों वाले व्यक्तियों में हृदय समारोह की वसूली के लिए स्टेम सेल (एससी) के उपयोग में महत्वपूर्ण रुचि है। सबसे अधिक, कार्डियक स्टेम सेल थेरेपी का अध्ययन अनुसूचित जाति को मायोकार्डियल चोट के प्रेरण के साथ समवर्ती रूप से वितरित करके किया जाता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण दो महत्वपूर्ण सीमाएं प्रस्तुत करता है: प्रारंभिक शत्रुतापूर्ण समर्थक भड़काऊ इस्कीमिक वातावरण प्रत्यारोपित अनुसूचित जाति के अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है, और यह उप-तकनीकीय इन्फेक्शन परिदृश्य का प्रतिनिधित्व नहीं करता है जहां अनुसूचित जाति का उपयोग किया जाएगा। यहां हम इस्केमिया-रिफ्यूजन इंजरी और मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) की डिलिवरी को शामिल करने के लिए सर्जिकल प्रक्रियाओं की दो-भाग श्रृंखला का वर्णन करते हैं । स्टेम सेल प्रशासन की यह विधि प्रारंभिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दरकिनार करके क्षतिग्रस्त ऊतक के आसपास लंबी व्यवहार्यता और प्रतिधारण के लिए अनुमति दे सकती है। इस्केमिया रिपरफ्यूजन चोट का एक मॉडल चूहों में मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं (3.0 x 105)के वितरण के साथ प्रेरित किया गया था, जो 7 दिन बाद संविलय रूप से व्यक्त सीएमवी प्रमोटर के तहत रिपोर्टर जीन जुगनू लूसिफ़ेरेस को व्यक्त करता था। जानवरों को क्रमशः चोट और कोशिकाओं के इंजेक्शन की पुष्टि के लिए अल्ट्रासाउंड और बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के माध्यम से चित्रित किया गया था। महत्वपूर्ण बात, अनुसूचित जाति के वितरण के लिए इस दो प्रक्रिया दृष्टिकोण प्रदर्शन करते समय कोई जोड़ा जटिलता दर थी । स्टेम सेल प्रशासन की यह विधि, सामूहिक रूप से अत्याधुनिक रिपोर्टर जीन के उपयोग के साथ, प्रारंभिक इस्केमिया की स्थिति में प्रत्यारोपित अनुसूचित जाति की व्यवहार्यता और प्रतिधारण के वीवो अध्ययन में अनुमति दे सकती है, जबकि प्रारंभिक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया को भी दरकिनार कर सकती है। संक्षेप में, हमने मायोकार्डियम में स्टेम कोशिकाओं की देरी से वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया, जिसका उपयोग क्षतिग्रस्त ऊतक के उत्थान को बढ़ावा देने में एक संभावित नए दृष्टिकोण के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
हृदय रोग दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर का सबसे आम कारण बना हुआ है । कार्डियक इस्कीमिक घटनाओं को मायोकार्डियम और आसपास की कोशिकाओं के समग्र कार्य के लिए हानिकारक पाया गया है1. केवल ̴0.45-1.0% कार्डियोमायोसाइट्स हर साल मायोकार्डियल क्षति के बाद पुनर्जीवित होगा2। बढ़ती मांग और उपचार विकसित करने पर अंतर्निहित ध्यान देने के बावजूद, घायल ऊतकों के उत्थान में सहायता करने वाले उपचारों को स्थापित करना मुश्किल हो गया है और अभी भी आगे अनुकूलन3,,4,,5की आवश्यकता है। स्टेम सेल चिकित्सा एक इस्कीमिक घटना के बाद क्षतिग्रस्त ऊतक को फिर से जीवंत करने के लिए एक वैकल्पिक मार्ग के रूप में पेश किया गया है; हालांकि, इन चिकित्सा की उन्नति सीमित अस्तित्व और एक घायल क्षेत्र6.
इस्कीमिक घटना के बाद दिल के माइक्रोएनवायरमेंट को हाइपोक्सिक, प्रो-ऑक्सीडेंट और प्रो-भड़काऊ के रूप में चिह्नित किया जा सकता है, जो चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं के लिए शत्रुतापूर्ण परिस्थितियों को अस्तित्व7,,8के अनुकूल बनाने के लिए पेश करता है। चोट के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू हो जाती है, भोले लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल और मस्तूल कोशिकाएं मरने वाली कोशिकाओं को हटाकर नुकसान की मरम्मत करने का प्रयास करती हैं और ऊतकरीमॉडलिंग 9,10,,11के लिए प्रक्रिया को मॉडुलन करती हैं।, इस्केमिया के बाद के पहले 3 दिनों के भीतर, क्षेत्र10,,12में न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स की उच्च संख्या के साथ समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई के साथ सूजन अपने चरम पर है। 7 दिनों के बाद, बहुत सूजन थम गई है और रिपारेटिव कोशिकाओं में संक्रमण शुरू होता है, जब तक कि रीमॉडलिंग कैस्केड पूरा नहीं हो जाता, चूहों में लगभग14 दिन 13। हमारी शल्य चिकित्सा विधि इस्केमिया प्रतिरफ़ूक चोट के बाद चोटी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाईपास करने के लिए मायोकार्डियम में जीवविज्ञान की शुरूआत के लिए एक संभावित वैकल्पिक दृष्टिकोण है। इसके साथ ही, यह उप-एक्यूट/क्रॉनिक इस्केमिया की स्थिति में किसी भी उपचार के अध्ययन के लिए अनुमति देगा जहां तीव्र मायोकार्डियल इंफेक्शन की तुलना में विचार करने के लिए विभिन्न चर हो सकते हैं ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रयोग महिला C57BL/6 चूहों, आयु 10-12 सप्ताह और 20-25 ग्राम शरीर के वजन पर किया गया । सभी पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में कहा मानकों का पालन (प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान, राष्ट्रीय विज्ञान अकादमी, बेथेस्डा, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका) और मेयो क्लिनिक कॉलेज ऑफ मेडिसिन इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. तैयारी और इंडिब्रेकेशन
- सर्जरी से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें। यदि एक सत्र में कई सर्जरी की जानी है, तो प्रत्येक जानवर के बाद उपकरणों को साफ करें और गर्म मनका स्टरलाइजर का उपयोग करके फिर से स्टरलाइज करें।
- एक इंडक्शन चैंबर में 1 एल/मिन ओ2 पर 3.5-4% आइसोफ्लाणे के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें ।
- प्रशासित Buprenorphine एसआर 1 मिलीग्राम/किलो (एनाल्जेसिक) चमड़े के नीचे, जानवर का वजन, और वेंटिलेटर में वजन इनपुट ।
- छाती के बाईं ओर को उरोस्थि से कंधे के स्तर तक शेव करें और अतिरिक्त फर को हटाने के लिए डिपिलेटरी क्रीम लगाएं।
- इस्केमिया रिपरफ्यूजन प्रक्रिया के लिए 2 सीएमएच2ओ पर वेंटिलेटर पर सकारात्मक अंत-समाप्ति दबाव (PEEP) बनाए रखें। कोशिकाओं की प्रक्रिया के विलंबित इंजेक्शन के लिए फेफड़ों के पतन को रोकने के लिए झलक को 3 सीएमएच2ओ में बदल दें।
- 20 जी एंडोट्रेक्ल ट्यूब का उपयोग करके जानवर को लगाना, 35-37 डिग्री सेल्सियस के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए नियंत्रित हीटिंग पैड पर स्थानांतरित करें।
- माउस को पार्श्व अनुनद में एक वेंटिलेटर पर रखें जिसमें बाईं ओर कपाल अंत और दाईं ओर कौडल छोर हो।
- प्रक्रिया के शेष के लिए 1 एल/मिन ओ 2 पर2-2.5% आइसोफ्लाणे पर संज्ञाहरण बनाए रखें।
- पोविडोन-आयोडीन और अल्कोहल के बीच बारी-बारी से सर्जिकल क्षेत्र को स्क्रब करें और दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
2. इस्केमिया रिफ्यूजन इंजरी
- एक #10 ब्लेड स्केलपेल का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र में सबसे अधिक निप्पल के दाईं ओर एक ऊर्ध्वाधर चीरा 2.5 मिमी बनाते हैं।
- सतही मांसपेशियों की परतों के माध्यम से कैंची का उपयोग करना जब तक इंटरकोस्टल मांसपेशियों और पसलियों दिखाई देते हैं।
- पसलियों और आसपास के ऊतकों को उठाते समय, 4 और 5 पसलियों के बीच इंटरकोस्टल स्पेस के माध्यम से काटें, फिर पलक रिट्रैक्टर को खुली जगह में डालें।
- घुमावदार संदंश का उपयोग करके पेरिकार्डियम को वापस लें, फेफड़ों को ऊपर की ओर ले जाएं और देखने से बाहर रहें।
- बालक धमनी की कल्पना करें और, 9-0 नायलॉन सीवन का उपयोग करके, धमनी 2.5 मिमी डिस्टल के नीचे मायोकार्डियम से बाएं ऑरिकल तक गुजरें और एक ढीले वर्ग गाँठ को बांधें।
- 1 सेमी पॉलीथीन ट्यूबिंग काटें और इसे ढीली गाँठ के भीतर रखें।
- टयूबिंग के चारों ओर सीवन को सुरक्षित करें, इस्केमिया की पुष्टि करें, फिर 35 मिनट के बाद रिलीज करें।
नोट: पल्लर और वेंट्रिकुलर अतालता द्वारा इस्केमिया की पुष्टि करें। - लिगेशन जारी करने और ट्यूबिंग को हटाने के बाद, मायोकार्डियम के रिफ्यूजन की पुष्टि करने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- खोलने के अधिकार के लिए वक्ष गुहा एक इंटरकोस्टल अंतरिक्ष में एक 24 जी I.V. कैथेटर ट्यूब रखें ।
- एक साधारण बाधित पैटर्न में 6-0 अवशोषित सीवन के साथ इंटरकोस्टल चीरा बंद करें।
- एक सतत सीवन पैटर्न में एक 6-0 अवशोषित सीवन के साथ मांसपेशियों की परत बंद करो।
- सतही मांसपेशी परत को बंद करने के बाद, 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करके छाती की गुहा से हवा को वापस लेते समय छाती की नली को हटा दें।
- एक सतत क्षैतिज गद्दे पैटर्न में एक 6-0 अवशोषित सीवन के साथ त्वचा चीरा बंद
नोट: नायलॉन टांके और एक असतत सीवन पैटर्न भी त्वचा परत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । - गर्म खारा के 1.5 एमएल को कम से कम प्रशासित करें और संक्रमण को रोकने के लिए चीरा साइट पर ट्रिपल-एंटीबायोटिक मरहम लागू करें।
- आइसोफ्लुनाणे बंद करें और जानवर को 100% O2 पर वेंटिलेटर के माध्यम से सांस लेने की अनुमति दें जब तक कि यह सहायता के बिना लगातार सांस ले सके।
- माउस को बिस्तर मुक्त पिंजरे में स्थानांतरित करें या पूरी तरह से बरामद होने तक 35-37 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक गर्म पैड पर कवर बिस्तर (पेपर तौलिया या कपड़ा) के साथ एक पिंजरे को स्थानांतरित करें।
3. माउस मेसेंचिमल स्टेम सेल डिलीवरी
नोट: प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल चूहों के तनाव एक inbred लाइन है और आनुवंशिक रूप से समान समझा रहे हैं । मेसेंचिमल स्टेम सेल एक ही तनाव के जानवरों से प्राप्त किए गए थे और प्रोटोकॉल डिजाइन द्वारा, इम्यूनोसप्रेसेशन को प्रेरित नहीं किया गया था1।
- पहली प्रक्रिया के लिए पहले किए गए तैयारी और इंडबेशन चरणों को पूरा करें।
- कैंची और संदंश का उपयोग कर त्वचा की परत से सीवन निकालें।
- एक #10 स्केलपेल के साथ, पिछली सर्जरी के समान स्थान पर एक चीरा लगाएं।
- जब तक मांसपेशियों की परत सीवन दिखाई न दे तब तक निशान ऊतक के माध्यम से कटौती करने के लिए स्केलपेल का उपयोग जारी रखें
- कैंची और संदंश का उपयोग कर सीवन को हटा दें और मांसपेशियों की परत को खुला काट लें।
- कल्पना करें और पसलियों को एक साथ रखने वाले टांके को हटा दें और पिछले चीरा से इंटरकोस्टल मांसपेशी के माध्यम से काटना जारी रखें।
नोट: फेफड़ों छाती की दीवार का पालन किया हो सकता है, अगर ऐसा होता है, कुंद या घुमावदार संदंश का उपयोग करने के लिए ध्यान से अलग है और उंहें जारी । - पलक रिट्रैक्टर को इंटरकोस्टल स्पेस में रखें और पिछले लिगेशन के क्षेत्र का पता लगाएं।
- मेसेंचिमल स्टेम सेल (3.0 x 105),20 माइक्रोन पीबीएस में निलंबित, 30 जी इंसुलिन सिरिंज में लोड करें, सुई को इंजेक्शन लगाने के लिए उचित कोण के लिए आवश्यकता के अनुसार थोड़ा मोड़ें।
नोट: Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) 4-6 सप्ताह पुराने C56BL/6 चूहों के adipose ऊतक से अलग थे । प्रारंभिक मार्ग कोशिकाओं (पी 3) को सीएमवी प्रमोटर के तहत जुगनू लूसिफ़ेरेस जीन को व्यक्त करने वाले वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया गया था ताकि वीवो सेल व्यवहार्यता निगरानी में अनुमति दी जा सके। Adipose-व्युत्पन्न माउस एमएससी प्रवाह साइटोमेट्री की विशेषता थी और कोशिकाओं CD44, CD29, सीडी 90 और CD105 के लिए सकारात्मक थे, लेकिन हेमेटोपोइटिक मार्कर CD4514के लिए नकारात्मक । इंजेक्शन से पहले, एमएससी को विगलन प्रक्रिया से कोशिकाओं के नुकसान से बचने के लिए कम से कम एक मार्ग के लिए सुसंस्कृत किया गया था। - दिल के आधार की ओर शीर्ष से दिशा में चल रहा है सिरिंज पेरी-infarct क्षेत्र में डालने जब तक सुई खोलने पूरी तरह से मायोकार्डियम के अंदर है ।
- एक बार अंदर धीरे-धीरे कोशिकाओं को मायोकार्डियम में इंजेक्ट करें, 3 एस रुको, फिर सुई को हटा दें।
- 3 मिनट के लिए दिल को बारीकी से देखें ताकि वेट्रिकुलर फिब्रिलेशन जैसी कोशिकाओं के प्रति कोई असामान्य प्रतिक्रिया न हो।
- खोलने के दाईं ओर वक्ष गुहा एक इंटरकोस्टल अंतरिक्ष में एक 24 जी चतुर्थ कैथेटर ट्यूब रखें।
- इंटरकोस्टल, मांसपेशी और त्वचा की परतों को बंद करें और पहली प्रक्रिया के समान विधि में छाती की ट्यूब को हटा दें।
- गर्म खारा के 1.5 एमएल को कम से कम प्रशासित करें और संक्रमण को रोकने के लिए चीरा साइट पर ट्रिपल-एंटीबायोटिक मरहम लागू करें।
- आइसोफ्लुरेन बंद करें और जानवर को 100% O2 पर वेंटिलेटर के माध्यम से सांस लेने की अनुमति दें जब तक कि यह सहायता के बिना लगातार सांस लेने में सक्षम न हो जाए।
- माउस को बिस्तर मुक्त पिंजरे में स्थानांतरित करें या पूरी तरह से बरामद होने तक 35-37 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक गर्म पैड पर कवर बिस्तर (पेपर तौलिया या कपड़ा) के साथ एक पिंजरे को स्थानांतरित करें।
4. दोनों प्रक्रियाओं के बाद पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल
- सहज श्वास, स्टर्नल रेक्यूबेंसी और सामान्य आंदोलन स्थापित होने तक जानवर का लगातार निरीक्षण करें।
- सर्जरी के दिन कम से कम 3 घंटे के लिए हर 15-30 मिनट अवलोकन जारी रखें।
- घाव dehiscence या असामान्य दर्द के लिए चूहों की जांच एक बार 5 दिनों के लिए दैनिक, तो 2-3 बार साप्ताहिक ।
- यदि जानवर 72 एच पोस्ट-ऑप के बाद दर्द (यानी धनुषाकार पीठ, न्यूनतम आंदोलन, ग्रिमाकिंग, या स्क्रैफी फर) के लक्षण दिखाता है, तो बुप्रेनोर्फिन एसआर एनाल्जेसिक की अतिरिक्त खुराक प्रदान करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस्केमिया रिपरफ्यूजन इंजरी को 0 दिन चूहों में प्रेरित किया गया था, जिसके बाद स्टेम सेल प्रत्यारोपण से पहले के दिन एक पोस्ट-ऑपरेटिव इकोकार्डियोग्राम और इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम था । अल्ट्रासाउंड और इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम विश्लेषण ने इंफेक्शन की पुष्टि की और वेंट्रिकुलर कॉन्ट्रैक्टल फंक्शन(चित्रा 1ए-डी)में कमी आई । आंकड़ों की आगे की जांच से पता चला कि इंजेक्शन अंश और आंशिक छोटा चूहों में कमी आई है कि इस्कीमिक चोट प्राप्त की, जबकि अंत डायस्टोलिक और सिस्टोलिक मात्रा में वृद्धि हुई(तालिका 1)। एक सामान्य माउस दिल(चित्रा 2 ए),मैसन ट्राइक्रोम की तुलना में मायोकार्डियल ऊतक का धुंधला 7 दिन बाद चोट(चित्रा 2B)ने बाईं वेंट्रिकुलर दीवार के बढ़ते कोलेजन जमाव और पतले को दिखाया। दूसरी प्रक्रिया चोट के 7 दिन बाद की गई; चूहों को मेसेंचिमल स्टेम सेल (20 माइक्रोन पीबीएस में 3.0 x 105) का एक इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन दिया गया था, जो संविलियन व्यक्त सीएमवी प्रमोटर के तहत रिपोर्टर जीन जुगनू लूसिफ़ेरेस को व्यक्त करता था। इन चूहों के वीवो बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग (BLI) में एक सफल इंजेक्शन की पुष्टि के लिए स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद दिन पूरा हो गया था। एमएससी की सफल डिलीवरी का उदाहरण ब्ली सिग्नल द्वारा उदाहरण दिया गया है, चूहों की तुलना में जिन्होंने इस्केमिया रिपरफ्यूजन इंजरी को प्रेरित किया था लेकिन एमएससीएस(आंकड़े 3 ए, बी)प्राप्त नहीं हुए । इस दोहरी हस्तक्षेप प्रक्रिया में 22% की उदासीनता दर थी, जो तीव्र परिदृश्य में एमएससी प्राप्त करने वाले जानवरों में देखी गई थी।
चित्रा 1: चूहों दिल समारोह की इमेजिंग। बेसलाइन(ए)पर माउस का अल्ट्रासाउंड विश्लेषण इस्केमिया रिपरफ्यूजन इंजरी(बी)के बाद माउस की तुलना में बाएं वेंट्रिकल मायोकार्डियम के एक समान संकुचन को दर्शाता है, जो कम वेंट्रिकुलर मूवमेंट को दर्शाता है। सामान्य माउस(सी)के बेसलाइन इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम की तुलना में, इस्केमिया रिपरफ्यूजन इंजरी(डी)के साथ माउस के एसटी सेगमेंट में महत्वपूर्ण बदलाव होते हैं, जो वेंट्रिकुलर फ़ंक्शन में कमी का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| ईएफ% | एफएस% | EDV (μl) | ईएसवी (माइक्रोन) | एसवी (माइक्रोन) | |
| आधार रेखा | 74.19 ± 1.2 | 44.67 ± 2 | 23.8 ± 3.6 | 6.14 ± 0.98 | 17.68 ± 2.7 |
| आईआर के बाद | 43.9 ± 3.8 | 30.65 ± 3.8 | 33.88 ± 4.4 | 18.11 ± 1.4 | 15.74 ± 3.2 |
तालिका 1: इकोकार्डियोग्राफी विश्लेषण। चर मतलब के मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। EF: इजेक्शन अंश, एफएस: आंशिक छोटा, ईडीवी: एंड-डायस्टोलिक वॉल्यूम, ईएसवी: एंड-सिस्टोलिक वॉल्यूम, एसवी: स्ट्रोक वॉल्यूम।
चित्रा 2: दिल के ऊतकों का हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग। सामान्य माउस(ए)में मायोकार्डियम के मैसन के ट्राइक्रोम धुंधला हृदय ऊतक को कोई चोट नहीं दिखाता है, जबकि इस्केमिया रिपरफ्यूजन चोट(बी)के साथ माउस में वृद्धि कोलेजन जमाव और बाएं वेंट्रिकल के मायोकार्डियम में पतला दिखाता है, जो एक सफल संक्रमण के दृढ़ संकल्प का समर्थन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: वीवो बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग में। इस्केमिया रिपरफ्यूजन इंजरी वाले माउस को स्टेम सेल का इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन नहींमिला। इस्केमिया रिपरफ्यूजन इंजरी वाले माउस को मेसेंचिमल स्टेम सेल (सीएमवी-फ्लूसी) का विलंबित इंजेक्शन मिला, जिसमें काफी मात्रा में सिग्नल(बी)दिखाई दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
दुनिया भर में 85 मिलियन से अधिक लोग हृदय रोग से प्रभावित हैं3. इन इस्कीमिक घटनाओं की उच्च व्यापकता क्षतिग्रस्त ऊतकों के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए वैकल्पिक उपचारों के आगे विकास और विस्तार की आवश्यकता है। पारंपरिक तरीके इस्केमिया रिपरफ्यूजन प्रक्रिया का उपयोग एक तीव्र सेटिंग में करते हैं जिसमें चिकित्सीय1के बाद के प्रशासन के साथ एक तीव्र सेटिंग होती है। न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज की घुसपैठ और10, 12,में वृद्धि के साथ, कार्डियक इस्कीमिक घटना को पोस्ट करने के 3-4 दिनों के बीच भड़काऊ प्रतिक्रियाएं चरम पर हैं।12 मृत कोशिका अलगाव की इस अवधि के बाद, प्राथमिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया13चरणों को फिर से तैयार करने की दिशा में कम और संक्रमण शुरू हो जाती है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि नैदानिक सेटिंग में प्रस्तुत किए गए समान परिदृश्य के भीतर उपचार की जांच की जाती है। इस पांडुलिपि में, हम एमएससी के विलंबित इंजेक्शन के साथ दोहरी शल्य प्रक्रिया की व्यवहार्यता और सुरक्षा को प्रदर्शित करने के लिए इस्कीमिक चूहों से प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दिखा रहे हैं । हमें विश्वास है कि इस दृष्टिकोण न केवल मायोकार्डियल इस्केमिया पशु मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी रोग के पशु मॉडल के लिए जहां सूजन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, चिकित्सकीय रणनीतियों की सफलता में फेरबदल है कि जीवविज्ञान, जैसे सेल या दवा चिकित्सा के रूप में शामिल है ।
इसलिए, इस पांडुलिपि में हम चूहों में इस्केमिया रिपरफ्यूजन चोट को प्रेरित करने के 7-10 दिनों बाद स्टेम कोशिकाओं को एक उप-ता्मक इंफार्क्शन में पहुंचाने के लिए एक शल्य चिकित्सा विधि का वर्णन करते हैं। यह तकनीक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न चरणों और इस्कीमिक रोग प्रक्रिया के उपक्यूट/क्रोनिक चरण में स्टेम सेल व्यवहार्यता और जीव विज्ञान का अध्ययन करने में उपयोगी होगी । मुरीन मॉडल प्रजनन क्षमता और सुविधा के मामले में अध्ययन की इस विधि के लिए आदर्श विषय हैं, हालांकि, वे कुछ नुकसान सहन कर सकते हैं। जानवर का आकार सर्जिकल कौशल की एक निश्चित डिग्री वारंट करता है, हालांकि, अभ्यास के साथ, इन प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक पूरा किया जा सकता है।
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रक्रियाओं को करने के लिए, इन सर्जरी के सफल समापन के लिए आवश्यक कुछ महत्वपूर्ण चरणों और टिप्पणियों को नोट करना महत्वपूर्ण है। पहली प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम बाएं पूर्वकाल उतरते कोरोनरी धमनी (बालक) और मायोकार्डियम के अस्थायी इस्केमिया को प्राप्त करने के लिए पॉलीथीन ट्यूबिंग की नियुक्ति का बंधन है। एट्रियम के लिए कार्डियक ऊतक डिस्टल पर दबाव दार बनाने के लिए बाँझ पतला टिप सूती झाड़ू का उपयोग बालक के बढ़ी हुई चित्रण के लिए अनुमति देता है। एक बार टयूबिंग जगह में है और सीवन कसकर सुरक्षित, अतालता और ऊतक के पल्लर का अवलोकन इस्केमिया के सफल प्रेरण का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है । इस्केमिया की अवधि और बाद में रिफ्यूजन, एक बार सीवन जारी होने के बाद, कई जानवरों में चोट की निरंतरता के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, दूसरी वर्णित प्रक्रिया के दौरान, मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन को समीपस्थ दिशा में क्षैतिज आंदोलनों के साथ किया जाना चाहिए। पहली प्रक्रिया से परिणामी फाइब्रोसिस के कारण, सदमे को रोकने के लिए कोशिकाओं के धीमी गति से लगातार इंजेक्शन के बाद सुई डालने के लिए महत्वपूर्ण लेकिन स्थिर दबाव की आवश्यकता होती है। अंत में, संज्ञाहरण से चूहों जागने से पहले निरंतर गर्मी और पूरक चमड़े के नीचे तरल पदार्थ प्रदान करना, प्रक्रियाओं के दौरान खो गए किसी भी रक्त के प्रतिस्थापन में गर्मी की कमी और सहायता को रोकदेगा, साथ ही जानवर की समग्र वसूली भी।
इस पांडुलिपि में, हम क्रोनिक इस्केमिया रिपरफ्यूजन चोट के एक मुरीन मॉडल में एक चिकित्सीय उपचार के रूप में स्टेम कोशिकाओं को प्रशासित करने की विधि के रूप में कई प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इन शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का उपयोग समय के साथ उनकी व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए चोट के बाद शत्रुतापूर्ण इस्कीमिक वातावरण में स्टेम कोशिकाओं के वितरण के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है। स्टेम सेल थेरेपी के अध्ययन के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग काफी तीव्र सेटिंग में अनुसूचित जाति के उपयोग पर ध्यान केंद्रित अन्य अध्ययनों के पूरक होगा। अंत में, वर्णित प्रोटोकॉल इस्कीमिक चोट को प्रेरित करने और पूर्व नैदानिक अध्ययनों में एक मॉडल के रूप में उपयोग के लिए स्टेम कोशिकाओं के आगामी विलंबित प्रत्यारोपण में सफल है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
कोई नहीं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl Irrigation, USP | Baxter | 0338-0048-04 | |
| 11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable | SAI Infusion Technologies | PSS-SD | |
| 24G 3/4" IV catheter tube | Jelco | 4053 | |
| 28G x 1/2" 1mL allergy syringe | BD | 305500 | Injection of analgesic |
| 30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe | Ulticare | 08222.0933.56 | Injection of stem cells |
| 6-0 S-29, 12" Vicryl suture | Ethicon | J556G | Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure |
| 9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture | Ethicon | 2829G | Ligation of the LAD artery |
| Absorbent underpad | Thermo Fischer Scientific | 14-206-64 | For underneath the animal |
| Alcohol prep pads, 2 ply, medium | Coviden | 6818 | |
| Anti-fog face mask | Halyard | 49235 | |
| Bonn Strabismus scissors, curved, blunt | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity). | |
| Castroviejo needle holders, curved | Fine Science Tools | 12061-01 | |
| Curity sterile gauze sponges | Coviden | 397310 | |
| Delicate suture tying forceps, 45 angle bent | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Electric Razor | Wahl | Fur removal | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Health | PI23238 | Anesthetic |
| Lab coat | |||
| Monoject 1 mL hypodermic syringe | Coviden | 8881501400 | |
| Moria iris forceps, curved, serrated (x2) | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Moria speculum retractor | Fine Science Tools | 17370-53 | |
| Mouse endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ||
| Nair depilatory cream | Johnson & Johnson | Fur removal | |
| Optixcare eye lube plus | Aventix | Sterile ocular lubricant | |
| Physiosuite ventilator | Kent Scientific | ||
| PolyE Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 72-0191 | Temporary compression of LAD artery |
| Povidone-iodine swabs | PDI | S41125 | |
| Scalpel, 10-blade | Bard-Parker | 371610 | |
| Sterile 3" cotton tipped applicators | Cardinal Health | C15055-003 | |
| Sterile 6" tapered cotton tip applicators | Puritan | 25-826-5WC | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | N8830 | |
| Sterilization pouches | Medline | MPP100525GS | |
| Surgery cap | |||
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Suture tying forceps, straight (x2) | Fine Science Tools | 10825-10 | |
| Transpore surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Triple antibiotic ointment | G&W Laboratories | 11-2683ILNC2 | Topical application to prevent infection |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Vetflo vaporizer | Kent Scientific |
References
- Franchi, F., et al. The Myocardial Microenvironment Modulates the Biology of Transplanted Mesenchymal Stem Cells. Molecular Imaging Biology. , (2020).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38 (2016).
- Gersh, B. J., Simari, R. D., Behfar, A., Terzic, C. M., Terzic, A. Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective. Mayo Clinic Protocol. 84 (10), 876-892 (2009).
- Terzic, A., Behfar, A. Regenerative heart failure therapy headed for optimization. European Heart Journal. 35 (19), 1231-1234 (2014).
- Beegle, J., et al. Hypoxic preconditioning of mesenchymal stromal cells induces metabolic changes, enhances survival, and promotes cell retention in vivo. Stem Cells. 33 (6), 1818-1828 (2015).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circulation Research. 111 (9), 1208-1221 (2012).
- Psaltis, P. J., et al. Noninvasive monitoring of oxidative stress in transplanted mesenchymal stromal cells. JACC Cardiovascular Imaging. 6 (7), 795-802 (2013).
- Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction. Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M. Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).
- Zhang, Z., et al. Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils. Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397 (2020).
- Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges. Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
