Summary
Células madre se investigan continuamente como tratamientos potenciales para individuos con daño miocárdico, sin embargo, su disminución de la viabilidad y retención dentro del tejido lesionado puede afectar su eficacia a largo plazo. En este manuscrito describimos un método alternativo para la entrega de células madre en un modelo murino de lesión por reperfusión de isquemia.
Abstract
Existe un interés significativo en el uso de células madre (SCs) para la recuperación de la función cardíaca en individuos con lesiones miocárdicas. Más comúnmente, la terapia con células madre cardíacas se estudia mediante la administración de SCs simultáneamente con la inducción de la lesión miocárdica. Sin embargo, este enfoque presenta dos limitaciones significativas: el entorno isquémico proinflamatorio temprano puede afectar la supervivencia de las CC trasplantadas, y no representa el escenario de infarto subagudo donde es probable que se utilicen los CC. Aquí describimos una serie de procedimientos quirúrgicos de dos partes para la inducción de la lesión de isquemia-reperfusión y la administración de células madre mesenquimales (MSC). Este método de administración de células madre puede permitir la viabilidad más larga y la retención alrededor del tejido dañado al eludir la respuesta inmunitaria inicial. Un modelo de lesión por reperfusión de isquemia fue inducido en ratones acompañado de la administración de células madre mesenquimales (3,0 x 105), expresando establemente el gen reportero de la luciérnqueasa luciferasa bajo el promotor de CMV expresado constitutivamente, intramiicciardialmente 7 días después. Los animales fueron objeto de imágenes por ultrasonido e imágenes bioluminiscentes para la confirmación de lesiones e inyección de células, respectivamente. Es importante destacar que no hubo una tasa de complicaciones adicional al realizar este enfoque de dos procedimientos para la entrega de SC. Este método de administración de células madre, colectivamente con la utilización de genes reporteros de última generación, puede permitir el estudio in vivo de viabilidad y retención de CC trasplantados en una situación de isquemia crónica comúnmente vista clínicamente, al tiempo que se elude la respuesta proinflamatoria inicial. En resumen, establecimos un protocolo para la entrega retardada de células madre en el miocardio, que puede ser utilizado como un nuevo enfoque potencial en la promoción de la regeneración del tejido dañado.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la causa más común de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Se ha encontrado que los eventos isquémicos cardíacos son perjudiciales para la función general del miocardio y las células circundantes1. Sólo ̴0,45-1,0% de los cardiomiocitos se regenerarán cada año después de que se produzca daño miocárdico2. A pesar de la creciente demanda y el enfoque inherente en el desarrollo de tratamientos, las terapias que ayudan en la regeneración del tejido lesionado han sido difíciles de establecer y todavía requieren una mayor optimización3,,4,,5. Terapias de células madre se han introducido como un camino alternativo para rejuvenecer el tejido dañado después de un evento isquémico; sin embargo, el avance de estas terapias ha sido desafiado por la limitada supervivencia y retención de las células a una zona lesionada6.
El microambiente del corazón después de un evento isquémico se puede caracterizar como hipoxico, pro-oxidante y proinflamatorio, presentando condiciones hostiles para que las células madre terapéuticas se adapten a la supervivencia7,,8. Como respuesta inmunitaria se desencadena después de una lesión, linfocitos ingenuos, macrófagos, neutrófilos y células del mástil intentan reparar el daño mediante la eliminación de las células moribundas y la modulación del proceso de remodelación de tejidos9,,10,,11. Dentro de los primeros 3 días post-isquemia, la inflamación está en su apogeo con la liberación de citoquinas proinflamatorias con un alto número de neutrófilos y monocitos en la zona10,,12. Después de 7 días, gran parte de la inflamación ha disminuido y comienza la transición a células reparadoras, continuando hasta que se complete la cascada de remodelación, aproximadamente 14 días en ratones13. Nuestro método quirúrgico es un enfoque alternativo potencial a la introducción de productos biológicos en el miocardio para evitar la respuesta inmune innata pico después de la lesión por reperfusión de isquemia. Al mismo tiempo, permitirá el estudio de cualquier tratamiento en una condición de isquemia subaguda/crónica donde puede haber diferentes variables a considerar en comparación con el infarto agudo de miocardio.
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Protocol
Los experimentos se realizaron en ratones hembra C57BL/6, edad 10-12 semanas y 20-25 g de peso corporal. Todos los procedimientos con animales cumplieron con las normas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Recursos Animales de Laboratorio, Academia Nacional de Ciencias, Bethesda, MD, EE. UU.) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Institucionales (IACUC) de mayo Clinic College of Medicine.
1. Preparación e intubación
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Si se van a realizar varias cirugías en una sesión, limpie los instrumentos después de cada animal y vuelva a esterilizar con un esterilizador de perlas calientes.
- Anestesar a los ratones con 3.5-4% de isoflurano a 1 L/min O2 en una cámara de inducción.
- Administrar Buprenorfina SR 1 mg/kg (analgésico) por vía subcutánea, pesar el animal e introducir el peso en el respirador.
- Afeitar el lado izquierdo del pecho desde el esternón hasta el nivel del hombro y aplicar crema depilatoria para eliminar el exceso de piel.
- Para el procedimiento de reperfusión de isquemia mantener la presión final positiva (PEEP) en el respirador a 2 cmH2O. Para la inyección retardada de células procedimiento cambiar la PEEP a 3 cmH2O para evitar el colapso pulmonar.
- Intubar al animal utilizando un tubo endotraqueal de 20 G, transferir a una almohadilla de calentamiento controlada para mantener una temperatura corporal de 35-37 oC.
- Coloque el ratón sobre un respirador en recumbencia lateral con extremo craneal a la izquierda y extremo caudal a la derecha.
- Mantener la anestesia en 2-2.5% isoflurano a 1 L/min O2 durante el resto del procedimiento.
- Frote el área quirúrgica alternando entre povidona-yodo y hisopos de alcohol tres veces y aplique pomada oftálmica en ambos ojos.
2. Lesión por reperfusión de isquemia
- Usando un bisturí de hoja #10 hacer una incisión vertical de 2,5 mm a la derecha del pezón más a la izquierda en el campo de visión.
- Usando tijeras cortadas a través de las capas musculares superficiales hasta que los músculos intercostales y las costillas son visibles.
- Mientras levanta las costillas y el tejido circundante, corte el espacio intercostal entre las costillas 4a y 5a, luego inserte el retractor del párpado en el espacio abierto.
- Retirar el pericardio usando fórceps curvos, moviendo el pulmón hacia arriba y fuera de la vista.
- Visualice la arteria LAD y, usando una sutura de nylon 9-0, pase a través del miocardio debajo de la arteria 2.5 mm distal a la aurícula izquierda y ate un nudo cuadrado suelto.
- Corte 1 cm de tubo de polietileno y colóquelo dentro del nudo suelto.
- Asegure la sutura alrededor del tubo, confirme la isquemia y luego suéltela después de 35 minutos.
NOTA: Confirme la isquemia por palidez y arritmia ventricular. - Después de liberar la ligadura y retirar el tubo, espere 5 minutos para confirmar la reperfusión del miocardio.
- Coloque un tubo de catéter I.V. de 24 G en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura.
- Cierre la incisión intercostal con una sutura absorbible 6-0 en un patrón interrumpido simple.
- Cierre la capa muscular con una sutura absorbible 6-0 en un patrón de sutura continua.
- Después de cerrar la capa muscular superficial, retire el tubo torácico mientras retira el aire de la cavidad torácica con una jeringa de tuberculina de 1 ml.
- Cierre la incisión de la piel con una sutura absorbible 6-0 en un patrón de colchón horizontal continuo
NOTA: Las suturas de nylon y un patrón de sutura discontinua también se pueden utilizar para la capa de la piel. - Administrar 1,5 ml de solución salina caliente por vía subcutánea y aplicar un pomada de triple antibiótico en el lugar de la incisión para prevenir la infección.
- Apague el isoflurano y deje que el animal respire a través del respirador al 100% O2 hasta que pueda respirar continuamente sin ayuda.
- Transfiera el ratón a una jaula sin ropa de cama o a una jaula con ropa de cama cubierta (toalla de papel o cortina) en una almohadilla caliente con una temperatura de 35-37 oC hasta que esté completamente recuperado.
3. Entrega de células madre mesenquimales de ratón
NOTA: La cepa de ratones utilizada para el procedimiento es una línea endogáctica y se considera genéticamente idéntica. Las células madre mesenquimales se obtuvieron de animales de la misma cepa y, mediante el diseño protocoltivo, no se indujo inmunosupresión1.
- Complete los pasos de preparación e intubación como se hizo anteriormente para el primer procedimiento.
- Retire la sutura de la capa de la piel con tijeras y fórceps.
- Con un #10 bisturí, haga una incisión en el mismo lugar que la cirugía anterior.
- Continúe usando el bisturí para cortar el tejido cicatricial hasta que la sutura de la capa muscular sea visible
- Usando las tijeras y fórceps quitar la sutura y cortar la capa muscular abierta.
- Visualizar y quitar las suturas que sostienen las costillas juntas y continuar cortando a través del músculo intercostal de la incisión anterior.
NOTA: Los pulmones pueden haberse adherido a la pared torácica, si esto ocurre, utilice fórceps contundentes o curvos para separarlos cuidadosamente y liberarlos. - Coloque el retractor del párpado en el espacio intercostal y localice el área de la ligadura anterior.
- Cargar las células madre mesenquimales (3,0 x 105), suspendidas en 20 l de PBS, en una jeringa de insulina de 30 G, doblar la aguja ligeramente según sea necesario para que el ángulo adecuado se inyecte.
NOTA: Las células madre mesenquimales (MSC) se aislaron del tejido adiposo de ratones C56BL/6 de 4-6 semanas de edad. Las células de paso temprano (p3) fueron transducidas con un vector que expresaba el gen de la luciosa de la luciérnnea bajo el promotor del CMV para permitir el monitoreo de la viabilidad de las células in vivo. El ratón derivado de adipose MSC se caracterizó por la citometría de flujo y las células fueron positivas para CD44, CD29, CD90 y CD105, pero negativas para el marcador hematopoyético CD4514. Antes de la inyección, los MSC se cultivaron durante al menos un pasaje para evitar la pérdida de células del proceso de descongelación. - En la dirección desde el ápice hacia la base del corazón inserte la jeringa en la región del peri-infarto hasta que la abertura de la aguja esté completamente dentro del miocardio.
- Una vez dentro, inyecte lentamente las células en el miocardio, espere 3 s y, a continuación, retire la aguja.
- Observe el corazón de cerca durante 3 minutos para asegurarse de que no hay reacciones anormales a las células como la fibrilación ventricular.
- Coloque un tubo de catéter de 24 G IV en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura.
- Cierre las capas intercostal, muscular y de la piel y retire el tubo torácico en el mismo método que el primer procedimiento.
- Administrar 1,5 ml de solución salina caliente por vía subcutánea y aplicar un pomada de triple antibiótico en el lugar de la incisión para prevenir la infección.
- Apague el isoflurano y deje que el animal respire a través del respirador al 100% O2 hasta que pueda respirar continuamente sin ayuda.
- Transfiera el ratón a una jaula sin ropa de cama o a una jaula con ropa de cama cubierta (toalla de papel o cortina) en una almohadilla caliente con una temperatura de 35-37 oC hasta que esté completamente recuperado.
4. Atención postoperatoria siguiendo ambos procedimientos
- Observar al animal continuamente hasta que se establezca respiración espontánea, recumbencia esternal y movimiento normal.
- Continuar la observación cada 15-30 min durante al menos 3 h el día de la cirugía.
- Revise a los ratones en busca de dehiscencia de la herida o dolor anormal una vez al día durante 5 días, luego 2-3 veces por semana.
- Si el animal muestra signos de dolor (es decir, espalda arqueada, movimiento mínimo, muecas o pelaje desaliñado) después de 72 h después de 72 h después de la postoperatoria, proporcione una dosis adicional del analgésico Buprenorfina SR.
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Representative Results
La lesión por reperfusión de isquemia se indujo en ratones el día 0, seguida de un ecocardiograma postoperatorio y un electrocardiograma el día anterior a la implantación de células madre. El análisis de ultrasonido y electrocardiograma confirmó el infarto y disminuyó la función contráctil ventricular(Figura 1A-D). Un examen adicional de los datos mostró que la fracción de eyección y el acortamiento fraccionado disminuyeron en ratones que recibieron lesiones isquémicas, mientras que los volúmenes diastólicos y sistólicos finales aumentaron (Tabla 1). En comparación con un corazón de ratón normal (Figura 2A), la tinción tricroma de Masson del tejido miocárdico 7 días después de la lesión (Figura 2B) mostró un aumento de la deposición de colágeno y adelgazamiento de la pared ventricular izquierda. El segundo procedimiento se realizó 7 días después de la lesión; a los ratones se les dio una inyección intramiocardio de células madre mesenquimales (3,0 x10 5 en PBS de 20 oL) expresando establemente el gen reportero de la luciérque luciferasa bajo el promotor del CMV expresado constitutivamente. La imagen bioluminiscente in vivo (BLI) de estos ratones se completó al día siguiente de la implantación de células madre para confirmar una inyección exitosa. La entrega exitosa de MSC se ejemplifica con la señal BLI, en comparación con los ratones que habían inducido lesiones por reperfusión de isquemia pero no recibieron MSC (Figuras 3A,B). Este procedimiento de intervención dual tenía una tasa de desgaste del 22 %, similar a la observada en animales que recibieron MSC en el escenario agudo.
Figura 1: Imágenes de la función cardíaca de los ratones. El análisis por ultrasonido del ratón al inicio (A) muestra una contracción uniforme del miocardio del ventrículo izquierdo en comparación con un ratón después de una lesión por reperfusión de isquemia (B), que muestra una disminución del movimiento ventricular. En comparación con el electrocardiograma basal de un ratón normal(C),hay cambios significativos en el segmento ST de un ratón con lesión por reperfusión de isquemia(D),lo que indica una disminución de la función ventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| EF% | FS% | EDV (l) | ESV (l) | SV (l) | |
| Base | 74,19 x 1,2 | 44,67 x 2 | 23,8 x 3,6 | 6,14 x 0,98 | 17,68 x 2,7 |
| Post-IR | 43,9 x 3,8 | 30,65 x 3,8 | 33,88 x 4,4 | 18,11 x 1,4 | 15,74 x 3,2 |
Tabla 1: Análisis de ecocardiografía. Las variables se expresan como Media - Error estándar de la media. EF: Fracción de eyección, FS: Acortamiento fraccional, EDV: Volumen diastólico final, ESV: Volumen sistólico final, SV: Volumen de trazo.
Figura 2: Tinción histológica del tejido cardíaco. La tinción tricroma de Masson del miocardio en el ratón normal (A) no muestra ninguna lesión en el tejido cardíaco, mientras que el ratón con lesión por reperfusión de isquemia (B) muestra un aumento de la deposición de colágeno y adelgazamiento en el miocardio del ventrículo izquierdo, lo que apoya la determinación de un infarto exitoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen bioluminiscente in vivo. Un ratón con lesión por reperfusión de isquemia que no recibió inyección intramiocardial de células madre no mostró señal bioluminiscente (A). Un ratón con lesión por reperfusión de isquemia que recibió una inyección tardía de células madre mesenquimales (CMV-FLUC) mostró una cantidad significativa de señal (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Más de 85 millones de personas en todo el mundo están afectadas por enfermedades cardiovasculares3. La alta prevalencia de estos eventos isquémicos garantiza un mayor desarrollo y expansión de terapias alternativas para promover la regeneración del tejido dañado. Los métodos tradicionales utilizan el procedimiento de reperfusión de isquemia en un entorno agudo con posterior administración de las terapias1. Las reacciones inflamatorias están en su apogeo entre 3-4 días después de un evento isquémico cardíaco, con infiltración de neutrófilos, macrófagos, y aumento de la señalización de citoquinas10,12. Después de este período de desengrasación de células muertas, la respuesta inmune primaria comienza a disminuir y la transición hacia las fases de remodelación13. Además, es importante que los tratamientos se investiguen dentro del mismo escenario que se presenta en el entorno clínico. En este manuscrito, estamos mostrando resultados representativos obtenidos de ratones isquémicos para demostrar la viabilidad y la seguridad del procedimiento quirúrgico doble, con inyección retardada de MSC. Creemos que este enfoque se puede utilizar no sólo para modelos animales de isquemia miocárdica, sino también para modelos animales de enfermedad donde la inflamación puede desempeñar un papel crítico, alterando el éxito de las estrategias terapéuticas que involucran a los biológicos, como las terapias celulares o farmacológicas.
Por lo tanto, en este manuscrito describimos un método quirúrgico para entregar células madre en un infarto subagudo, 7-10 días después de inducir la lesión por reperfusión de isquemia en ratones. Esta técnica será útil para estudiar la viabilidad y la biología de las células madre en relación con diferentes etapas de la respuesta inmunitaria y en la fase subaguda/crónica del proceso de la enfermedad isquémica. Los modelos murine son temas ideales para este método de estudio en términos de reproducibilidad y conveniencia, sin embargo, pueden soportar algunas desventajas. El tamaño del animal justifica un cierto grado de habilidad quirúrgica aunque, con la práctica, estos procedimientos se pueden completar con éxito.
Para llevar a cabo los procedimientos presentados en este manuscrito, es importante tener en cuenta algunos pasos clave y observaciones esenciales para la finalización exitosa de estas cirugías. Un paso crítico del primer procedimiento es la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la colocación de tubos de polietileno para lograr la isquemia temporal del miocardio. El uso de hisopos estériles de algodón cónico para ejercer presión sobre el tejido cardíaco distal en la aurícula permite una mayor delineación del LAD. Una vez que el tubo está en su lugar y la sutura firmemente asegurada, la observación de la arritmia y la palidez del tejido es esencial para determinar la inducción exitosa de la isquemia. El período de isquemia y la posterior reperfusión, una vez liberada la sutura, es importante para la consistencia de la lesión en múltiples animales. Además, durante el segundo procedimiento descrito, la inyección de células madre mesenquimales debe realizarse con movimientos horizontales en la dirección distal a proximal. Debido a la fibrosis resultante del primer procedimiento, se requiere una presión significativa pero constante para insertar la aguja seguida de una inyección lenta y constante de las células para evitar golpes. Finalmente, proporcionar calor continuo y líquidos subcutáneos suplementarios antes de despertar a los ratones de la anestesia, evitará la pérdida de calor y ayudará en la sustitución de cualquier sangre perdida durante los procedimientos, así como la recuperación general del animal.
En este manuscrito, proporcionamos un protocolo para completar múltiples procedimientos como método de administración de células madre como tratamiento terapéutico en un modelo murino de lesión crónica por reperfusión de isquemia. La utilización de estos procedimientos quirúrgicos ofrece un nuevo enfoque para la administración de células madre en el ambiente isquémico hostil después de la lesión para mejorar su viabilidad con el tiempo. El uso de este enfoque para el estudio de la terapia con células madre complementará significativamente otros estudios centrados en el uso de SCs en el entorno agudo. En conclusión, el protocolo descrito tiene éxito en la inducción de lesiones isquémicas y la consiguiente implantación retardada de células madre para su uso como modelo en estudios preclínicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl Irrigation, USP | Baxter | 0338-0048-04 | |
| 11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable | SAI Infusion Technologies | PSS-SD | |
| 24G 3/4" IV catheter tube | Jelco | 4053 | |
| 28G x 1/2" 1mL allergy syringe | BD | 305500 | Injection of analgesic |
| 30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe | Ulticare | 08222.0933.56 | Injection of stem cells |
| 6-0 S-29, 12" Vicryl suture | Ethicon | J556G | Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure |
| 9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture | Ethicon | 2829G | Ligation of the LAD artery |
| Absorbent underpad | Thermo Fischer Scientific | 14-206-64 | For underneath the animal |
| Alcohol prep pads, 2 ply, medium | Coviden | 6818 | |
| Anti-fog face mask | Halyard | 49235 | |
| Bonn Strabismus scissors, curved, blunt | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity). | |
| Castroviejo needle holders, curved | Fine Science Tools | 12061-01 | |
| Curity sterile gauze sponges | Coviden | 397310 | |
| Delicate suture tying forceps, 45 angle bent | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Electric Razor | Wahl | Fur removal | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Health | PI23238 | Anesthetic |
| Lab coat | |||
| Monoject 1 mL hypodermic syringe | Coviden | 8881501400 | |
| Moria iris forceps, curved, serrated (x2) | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Moria speculum retractor | Fine Science Tools | 17370-53 | |
| Mouse endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ||
| Nair depilatory cream | Johnson & Johnson | Fur removal | |
| Optixcare eye lube plus | Aventix | Sterile ocular lubricant | |
| Physiosuite ventilator | Kent Scientific | ||
| PolyE Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 72-0191 | Temporary compression of LAD artery |
| Povidone-iodine swabs | PDI | S41125 | |
| Scalpel, 10-blade | Bard-Parker | 371610 | |
| Sterile 3" cotton tipped applicators | Cardinal Health | C15055-003 | |
| Sterile 6" tapered cotton tip applicators | Puritan | 25-826-5WC | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | N8830 | |
| Sterilization pouches | Medline | MPP100525GS | |
| Surgery cap | |||
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Suture tying forceps, straight (x2) | Fine Science Tools | 10825-10 | |
| Transpore surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Triple antibiotic ointment | G&W Laboratories | 11-2683ILNC2 | Topical application to prevent infection |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Vetflo vaporizer | Kent Scientific |
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