Summary
As células-hastes são continuamente investigadas como tratamentos potenciais para indivíduos com danos do miocárdio, no entanto, sua diminuição da viabilidade e retenção dentro do tecido lesionado pode afetar sua eficácia a longo prazo. Neste manuscrito descrevemos um método alternativo para a entrega de células-tronco em um modelo murino de lesão de reperfusão de isquemia.
Abstract
Há um interesse significativo no uso de células-tronco (SCs) para a recuperação da função cardíaca em indivíduos com lesões do miocárdio. Mais comumente, a terapia de células-tronco cardíacas é estudada através do parto de SCs simultaneamente com a indução de lesão miocárdia. No entanto, essa abordagem apresenta duas limitações significativas: o ambiente isquêmico pró-inflamatório hostil precoce pode afetar a sobrevivência de SCs transplantadas, e não representa o cenário de infarto subagutado onde as SCs provavelmente serão utilizadas. Aqui descrevemos uma série de dois procedimentos cirúrgicos para a indução de lesão de isquemia-reperfusão e entrega de células-tronco mesenquimais (MSCs). Este método de administração de células-tronco pode permitir a maior viabilidade e retenção em torno do tecido danificado, contornando a resposta imune inicial. Um modelo de lesão de reperfusão de isquemia foi induzido em camundongos acompanhados da entrega de células-tronco mesenquimais (3,0 x 105), expressando com estoquá-lo sob o promotor de CMV expresso constitutivamente, intramiocardialmente 7 dias depois. Os animais foram imagens por ultrassom e bioluminescente para confirmação de lesão e injeção de células, respectivamente. É importante ressaltar que não houve taxa adicional de complicação ao realizar essa abordagem de dois procedimentos para o parto em SC. Este método de administração de células-tronco, coletivamente com a utilização de genes repórteres de última geração, pode permitir o estudo in vivo de viabilidade e retenção de SCs transplantados em uma situação de isquemia crônica comumente vista clinicamente, ao mesmo tempo em que contorna a resposta inicial pró-inflamatória. Em resumo, estabelecemos um protocolo para a entrega atrasada de células-tronco no miocárdio, que pode ser usado como uma nova abordagem potencial na promoção da regeneração do tecido danificado.
Introduction
As doenças cardiovasculares continuam sendo a causa mais comum de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eventos isquêmicos cardíacos têm sido prejudiciais para a função geral do miocárdio e células circundantes1. Apenas 0,45-1,0% dos cardiomiócitos se regenerarão a cada ano após a ocorrência de danos no miocárdio2. Apesar da crescente demanda e do foco inerente no desenvolvimento de tratamentos, as terapias que auxiliam na regeneração do tecido lesionado têm sido difíceis de estabelecer e ainda requerem maior otimização3,4,5. As terapias com células-tronco foram introduzidas como um caminho alternativo para rejuvenescer o tecido danificado após um evento isquêmico; no entanto, o avanço dessas terapias tem sido desafiado pela sobrevivência limitada e retenção das células para uma área ferida6.
O microambiente do coração após um evento isquêmico pode ser caracterizado como hipoxico, pró-oxidante e pró-inflamatório, apresentando condições hostis para células-tronco terapêuticas se adaptarem à sobrevivência7,,8. Como uma resposta imune é desencadeada após lesões, linfócitos ingênuos, macrófagos, neutrófilos e células de mastro tentam reparar o dano removendo células moribundas e modulando o processo de remodelação tecidual9,,10,,11. Nos primeiros 3 dias pós-isquemia, a inflamação está no seu auge com a liberação de citocinas pró-inflamatórias com alto número de neutrófilos e monócitos na área10,12. Após 7 dias, grande parte da inflamação diminuiu e a transição para células reparados começa, continuando até que a cascata remodelante esteja completa, aproximadamente 14 dias em camundongos13. Nosso método cirúrgico é uma abordagem alternativa potencial para a introdução de biológicos no miocárdio para contornar o pico de resposta imune inata após lesão de reperfusão de isquemia. Ao mesmo tempo, permitirá o estudo de quaisquer tratamentos em condição de isquemia subacute/crônica onde possa haver diferentes variáveis a considerar em comparação com o infarto agudo do miocárdio.
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Protocol
Os experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6 femininos, idade de 10-12 semanas e 20-25 g de peso corporal. Todos os procedimentos animais cumpriram as normas indicadas no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais (IACUC) da Mayo Clinic College of Medicine.
1. Preparação e entubação
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Se várias cirurgias forem realizadas em uma sessão, limpe os instrumentos após cada animal e reesterirei usando um esterilizador de contas quentes.
- Anestesia os camundongos com 3,5-4% de isoflurano a 1 L/min O2 em uma câmara de indução.
- Administre Buprenorfina SR 1 mg/kg (analgésico) subcutâneo, pese o animal e insira o peso no ventilador.
- Raspe o lado esquerdo do peito do esterno até o nível do ombro e aplique creme depilatório para remover o excesso de pele.
- Para o procedimento de reperfusão da isquemia mantenha a pressão final-expiratória positiva (PEEP) no ventilador a 2 cmH2O. Para a injeção retardada do procedimento de células mude o PEEP para 3 cmH2O para evitar o colapso pulmonar.
- Entubar o animal usando um tubo endotraqueal de 20 G, transfira para uma almofada de aquecimento controlada para manter uma temperatura corporal de 35-37 °C.
- Coloque o mouse sobre um ventilador em recumbência lateral com extremidade craniana à esquerda e caudal na direita.
- Mantenha a anestesia em 2-2,5% de isoflurane a 1 L/min O2 para o restante do procedimento.
- Esfregue a área cirúrgica alternando entre cotonetes de povidona-iodo e álcool três vezes e aplique pomada oftálmica em ambos os olhos.
2. Lesão de reperfusão de isquemia
- Usando um bisturi de lâmina #10 faça uma incisão vertical de 2,5 mm para a direita do mamilo mais à esquerda no campo de visão.
- Usando uma tesoura corta as camadas musculares superficiais até que os músculos intercostais e costelas sejam visíveis.
- Enquanto levanta as costelas e o tecido circundante, corte o espaço intercostal entre as costelas 4 e 5, em seguida, insira o retrátil das pálpebras no espaço aberto.
- Retraia o pericárdio usando fórceps curvos, movendo o pulmão para cima e para fora da vista.
- Visualize a artéria LAD e, usando uma sutura de nylon 9-0, passe pelo miocárdio sob a artéria 2,5 mm distal até a aurícula esquerda e amarre um nó quadrado solto.
- Corte 1 cm de tubos de polietileno e coloque-o dentro do nó solto.
- Fixar a sutura ao redor da tubulação, confirmar isquemia e depois soltar após 35 min.
NOTA: Confirme a isquemia por palidez e arritmia ventricular. - Depois de liberar a ligadura e remover a tubulação, espere 5 minutos para confirmar a reperfusão do miocárdio.
- Coloque um tubo de cateter intravenoso de 24 G I.V. na cavidade torácica um espaço intercostal à direita da abertura.
- Feche a incisão intercostal com uma sutura absorvível de 6-0 em um padrão simples interrompido.
- Feche a camada muscular com uma sutura absorvível de 6-0 em um padrão de sutura contínua.
- Após fechar a camada muscular superficial, remova o tubo torácico enquanto retira o ar da cavidade torácica usando uma seringa tuberculina de 1 mL.
- Feche a incisão da pele com uma sutura absorvível de 6-0 em um padrão de colchão horizontal contínuo
NOTA: Suturas de nylon e um padrão de sutura descontínua também podem ser usados para a camada de pele. - Administre 1,5 mL de soro fisiológico quente subcutâneamente e aplique pomada com antibiótico triplo no local de incisão para prevenir a infecção.
- Desligue isoflurane e deixe o animal respirar através do ventilador em 100% O2 até que possa respirar continuamente sem ajuda.
- Transfira o mouse para uma gaiola sem roupa de cama ou para uma gaiola com roupa de cama coberta (papel toalha ou cortina) em uma almofada quente com uma temperatura de 35-37 °C até que esteja totalmente recuperada.
3. Entrega de células-tronco mesenquimais do rato
NOTA: A variedade de camundongos utilizados para o procedimento é uma linha de raça e são considerados geneticamente idênticos. As células-tronco mesenquimais foram obtidas de animais da mesma cepa e, pelo projeto do protocolo, a imunossupressão não foi induzida1.
- Complete as etapas de preparação e entubação, conforme feito anteriormente para o primeiro procedimento.
- Remova a sutura da camada da pele usando tesouras e fórceps.
- Com um bisturi #10, faça uma incisão no mesmo local da cirurgia anterior.
- Continue a usar o bisturi para cortar o tecido cicatricial até que a sutura da camada muscular seja visível
- Usando a tesoura e fórceps, remova a sutura e corte a camada muscular aberta.
- Visualize e remova as suturas segurando as costelas juntas e continue cortando o músculo intercostal da incisão anterior.
NOTA: Os pulmões podem ter aderido à parede torácica, se isso ocorrer, usar fórceps bruscos ou curvos para separá-los cuidadosamente e soltá-los. - Coloque o retrátil das pálpebras no espaço intercostal e localize a área da ligadura anterior.
- Carregue as células-tronco mesenquimais (3.0 x 105),suspensas em 20 μL PBS, em uma seringa de insulina de 30 G, dobre a agulha ligeiramente conforme necessário para o ângulo adequado para injetar.
NOTA: As células-tronco mesenquimais (MSCs) foram isoladas do tecido adiposo de 4-6 semanas de idade C56BL/6 camundongos. As células de passagem precoce (p3) foram transduzidas com um vetor expressando o gene da luciferase de vagalume sob o promotor do CMV para permitir o monitoramento da viabilidade celular in vivo. O MSC do camundongo derivado do adiposo foi caracterizado pela citometria de fluxo e as células foram positivas para CD44, CD29, CD90 e CD105, mas negativas para o marcador hematopoiético CD4514. Antes da injeção, os MSCs foram cultivados por pelo menos uma passagem para evitar a perda de células do processo de descongelamento. - Movendo-se na direção do ápice em direção à base do coração insira a seringa na região peri-infarto até que a abertura da agulha esteja completamente dentro do miocárdio.
- Uma vez dentro injete lentamente as células no miocárdio, espere 3 s e, em seguida, remova a agulha.
- Observe o coração de perto por 3 minutos para ter certeza de nenhuma reação anormal às células, como fibrilação ventricular.
- Coloque um tubo de cateter de 24 G IV na cavidade torácica um espaço intercostal à direita da abertura.
- Feche as camadas intercostal, muscular e de pele e remova o tubo torácico no mesmo método do primeiro procedimento.
- Administre 1,5 mL de soro fisiológico quente subcutâneamente e aplique pomada com antibiótico triplo no local de incisão para prevenir a infecção.
- Desligue isoflurane e deixe o animal respirar através do ventilador em 100% O2 até que ele seja capaz de respirar continuamente sem ajuda.
- Transfira o mouse para uma gaiola sem roupa de cama ou para uma gaiola com roupa de cama coberta (papel toalha ou cortina) em uma almofada quente com uma temperatura de 35-37 °C até que esteja totalmente recuperada.
4. Cuidados pós-operatórios seguindo ambos os procedimentos
- Observe o animal continuamente até que a respiração espontânea, a recumência severa e o movimento normal se estabeleçam.
- Continue a observação a cada 15-30 min por pelo menos 3 h no dia da cirurgia.
- Verifique os camundongos se há deshiscência ou dor anormal uma vez por dia durante 5 dias, depois 2-3 vezes por semana.
- Se o animal apresentar sinais de dor (ou seja, costas arqueadas, movimento mínimo, grimacing ou pele desajeitada) após 72 h de pós-operatório, forneça uma dose adicional do analgésico Buprenorphine SR.
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Representative Results
A lesão de reperfusão de isquemia foi induzida em camundongos no dia 0, seguida de um ecocardiograma pós-operatório e eletrocardiograma no dia anterior à implantação de células-tronco. A análise de ultrassom e eletrocardiograma confirmou o infarto e diminuiu a função contratil ventricular(Figura 1A-D). Um exame mais aprofundado dos dados mostrou que a fração de ejeção e o encurtamento fracionado foram diminuídos em camundongos que receberam lesão isquêmica, enquanto os volumes terminais diastólicos e sistólicos aumentaram(Tabela 1). Em comparação com um coração de rato normal(Figura 2A), a coloração de Masson Trichrome do tecido miocárdio 7 dias após a lesão(Figura 2B) mostrou maior deposição de colágeno e afinamento da parede ventricular esquerda. O segundo procedimento foi realizado 7 dias após a lesão; camundongos receberam uma injeção intramiocárdia de células-tronco mesenquimais (3,0 x 105 em 20 μL PBS) expressando firmemente o gene repórter de luciferase de vagalume sob o promotor do CMV expresso constitutivamente. A imagem bioluminescente in vivo (BLI) desses camundongos foi concluída no dia seguinte à implantação de células-tronco para confirmação de uma injeção bem sucedida. A entrega bem sucedida de MSCs é exemplificada pelo sinal BLI, em comparação com camundongos que tiveram lesão de reperfusão de isquemia induzida, mas não receberam MSCs (Figuras 3A,B). Este procedimento intervencionista duplo apresentou uma taxa de atrito de 22%, semelhante à observada em animais que receberam MSCs no cenário agudo.
Figura 1: Imagem da função cardíaca dos ratos. A análise de ultrassom do rato na linha de base (A) mostra contração uniforme do miocárdio ventrículo esquerdo em comparação com um rato após lesão de reperfusão de isquemia(B),que mostra diminuição do movimento ventricular. Quando comparado com o eletrocardiograma da linha de base de um mouse normal(C),há mudanças significativas no segmento ST de um rato com lesão de reperfusão de isquemia(D),indicando uma diminuição na função ventricular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| EF% | FS% | EDV (μl) | ESV (μl) | SV (μl) | |
| Base | 74,19±1,2 | 44,67±2 | 23,8±3,6 | 6,14±0,98 | 17,68±2,7 |
| Pós-IR | 43,9±3,8 | 30,65±3,8 | 33,88±4,4 | 18,11±1,4 | 15,74±3,2 |
Tabela 1: Análise de ecocardiografia. As variáveis são expressas como Erro Padrão da Média ± Da Média. EF: Fração de ejeção, FS: Encurtamento fracionado, EDV: Volume end-diastólico, ESV: Volume Sistólica final, SV: Volume de Traçado.
Figura 2: Mancha histológica do tecido cardíaco. A coloração tricrática de Masson do miocárdio em camundongo normal (A) não mostra lesão no tecido cardíaco, enquanto o rato com lesão de reperfusão de isquemia(B) mostra maior deposição de colágeno e afinamento no miocárdio do ventrículo esquerdo, apoiando a determinação de um infarto bem sucedido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem bioluminescente in vivo. Um camundongo com lesão de reperfusão de isquemia que não recebeu injeção intramiocárdica de células-tronco não mostrou sinal bioluminescente(A). Um rato com lesão de reperfusão de isquemia que recebeu uma injeção retardada de células-tronco mesenquimais (CMV-FLUC) mostrou uma quantidade significativa de sinal(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Mais de 85 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas por doenças cardiovasculares3. A alta prevalência desses eventos isquêmicos garante o desenvolvimento e a expansão de terapias alternativas para promover a regeneração do tecido danificado. Os métodos tradicionais utilizam o procedimento de reperfusão da isquemia em um ambiente agudo com posterior administração terapêutica1. As reações inflamatórias estão no seu auge entre 3 e 4 dias após um evento isquêmico cardíaco, com infiltração de neutrófilos, macrófagos e aumento da sinalização de citocinas10,,12. Após esse período de desengragação de células mortas, a resposta imune primária começa a diminuir e transição para as fases de remodelação13. Além disso, é importante que os tratamentos sejam investigados dentro do mesmo cenário apresentado no cenário clínico. Neste manuscrito, estamos mostrando resultados representativos obtidos de camundongos isquêmicos para demonstrar a viabilidade e a segurança do duplo procedimento cirúrgico, com injeção retardada de MSCs. Acreditamos que essa abordagem pode ser usada não apenas para modelos de isquemia miocárdica, mas também para modelos animais de doença onde a inflamação pode desempenhar um papel crítico, alterando o sucesso de estratégias terapêuticas que envolvem biológicos, como terapias celulares ou medicamentosas.
Portanto, neste manuscrito descrevemos um método cirúrgico para a entrega de células-tronco em um infarto subacute, 7-10 dias após induzir lesão de reperfusão de isquemia em camundongos. Essa técnica será útil no estudo da viabilidade e biologia das células-tronco em conexão com diferentes estágios da resposta imune e na fase subacute/crônica do processo da doença isquêmica. Os modelos murinos são temas ideais para este método de estudo em termos de reprodutibilidade e conveniência, no entanto, eles podem ter algumas desvantagens. O tamanho do animal garante um certo grau de habilidade cirúrgica, embora, com a prática, esses procedimentos possam ser concluídos com sucesso.
Para a realização dos procedimentos apresentados neste manuscrito, é importante observar algumas etapas e observações fundamentais para a conclusão bem sucedida dessas cirurgias. Um passo crítico do primeiro procedimento é a ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) e a colocação de tubos de polietileno para alcançar isquemia temporária do miocárdio. O uso de cotonetes de algodão de ponta afilada estéreis para colocar pressão sobre o tecido cardíaco distal ao átrio permite um delineamento aprimorado do LAD. Uma vez que a tubulação está no lugar e a sutura firmemente segura, a observação de arritmia e palidez do tecido é essencial para determinar a indução bem sucedida da isquemia. O período de isquemia e a subsequente reperfusão, uma vez liberada a sutura, é importante para a consistência da lesão em vários animais. Além disso, durante o segundo procedimento descrito, a injeção de células-tronco mesenquimais deve ser realizada com movimentos horizontais na direção distal para proximal. Devido à fibrose resultante do primeiro procedimento, é necessária uma pressão significativa, mas constante, para inserir a agulha seguida de uma injeção lenta e consistente das células para evitar o choque. Finalmente, fornecer calor contínuo e fluidos subcutâneos suplementares antes de acordar camundongos da anestesia, evitará a perda de calor e ajudará na substituição de qualquer sangue perdido durante os procedimentos, bem como a recuperação geral do animal.
Neste manuscrito, fornecemos um protocolo para completar múltiplos procedimentos como método de administração de células-tronco como tratamento terapêutico em um modelo murino de lesão de reperfusão de isquemia crônica. A utilização desses procedimentos cirúrgicos oferece uma nova abordagem para a entrega de células-tronco no ambiente isquêmico hostil após lesão para melhorar sua viabilidade ao longo do tempo. O uso dessa abordagem para o estudo da terapia com células-tronco complementará significativamente outros estudos com foco no uso de SCs no cenário agudo. Em conclusão, o protocolo descrito é bem sucedido na indução de lesões isquímicas e na implantação retardada de células-tronco para uso como modelo em estudos pré-clínicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl Irrigation, USP | Baxter | 0338-0048-04 | |
| 11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable | SAI Infusion Technologies | PSS-SD | |
| 24G 3/4" IV catheter tube | Jelco | 4053 | |
| 28G x 1/2" 1mL allergy syringe | BD | 305500 | Injection of analgesic |
| 30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe | Ulticare | 08222.0933.56 | Injection of stem cells |
| 6-0 S-29, 12" Vicryl suture | Ethicon | J556G | Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure |
| 9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture | Ethicon | 2829G | Ligation of the LAD artery |
| Absorbent underpad | Thermo Fischer Scientific | 14-206-64 | For underneath the animal |
| Alcohol prep pads, 2 ply, medium | Coviden | 6818 | |
| Anti-fog face mask | Halyard | 49235 | |
| Bonn Strabismus scissors, curved, blunt | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity). | |
| Castroviejo needle holders, curved | Fine Science Tools | 12061-01 | |
| Curity sterile gauze sponges | Coviden | 397310 | |
| Delicate suture tying forceps, 45 angle bent | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Electric Razor | Wahl | Fur removal | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Health | PI23238 | Anesthetic |
| Lab coat | |||
| Monoject 1 mL hypodermic syringe | Coviden | 8881501400 | |
| Moria iris forceps, curved, serrated (x2) | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Moria speculum retractor | Fine Science Tools | 17370-53 | |
| Mouse endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ||
| Nair depilatory cream | Johnson & Johnson | Fur removal | |
| Optixcare eye lube plus | Aventix | Sterile ocular lubricant | |
| Physiosuite ventilator | Kent Scientific | ||
| PolyE Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 72-0191 | Temporary compression of LAD artery |
| Povidone-iodine swabs | PDI | S41125 | |
| Scalpel, 10-blade | Bard-Parker | 371610 | |
| Sterile 3" cotton tipped applicators | Cardinal Health | C15055-003 | |
| Sterile 6" tapered cotton tip applicators | Puritan | 25-826-5WC | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | N8830 | |
| Sterilization pouches | Medline | MPP100525GS | |
| Surgery cap | |||
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Suture tying forceps, straight (x2) | Fine Science Tools | 10825-10 | |
| Transpore surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Triple antibiotic ointment | G&W Laboratories | 11-2683ILNC2 | Topical application to prevent infection |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Vetflo vaporizer | Kent Scientific |
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