Étiquetage et visualisation des produits d'expression du génome mitochondrial dans Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.

Abstract

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Ils contiennent un génome circulaire et un appareil d’expression génique. Un génome mitochondrial de levure de boulanger code huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l’enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p. Le but de la méthode décrite ici est d’étiqueter spécifiquement ces protéines avec de la méthionine ³⁵S, de les séparer par électrophoresis et de visualiser les signaux comme des bandes discrètes à l’écran. La procédure comporte plusieurs étapes. Tout d’abord, les cellules de levure sont cultivés dans un milieu contenant de la galactose jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de croissance logarithmique tardive. Ensuite, le traitement cycloheximide bloque la traduction cytoplasmique et ^{ne permet l’incorporation de 35}S de méthionine que dans les produits de traduction mitochondrique. Ensuite, toutes les protéines sont extraites des cellules de levure et séparées par électrophoresis gel polyacrylamide. Enfin, le gel est séché et incubé avec l’écran de phosphore de stockage. L’écran est scanné sur un phosphorimager révélant les bandes. La méthode peut être appliquée pour comparer le taux de biosynthèse d’un seul polypeptide dans les mitochondries d’une souche de levure mutante par rapport au type sauvage, ce qui est utile pour étudier les défauts d’expression des gènes mitochondriaux. Ce protocole donne des informations précieuses sur le taux de traduction de tous les ARNm mitochondriaux de levure. Toutefois, il faut plusieurs contrôles et des expériences supplémentaires pour tirer des conclusions appropriées.

Introduction

Les mitochondries sont les organites profondément impliqués dans le métabolisme d’une cellule eucaryotique. Leur chaîne de transfert d’électrons fournit à la cellule de l’ATP, la principale monnaie énergétique utilisée dans de multiples voies biochimiques. En outre, ils sont impliqués dans l’apoptose, l’acide gras et la synthèse de l’hème, et d’autres processus. Le dysfonctionnement des mitochondries est une source bien connue de maladie humaine^1. Il peut résulter de mutations dans des gènes nucléaires ou mitochondriques codant des composants structurels ou réglementaires des organites². La levure saccharomyces cerevisiae de Baker est un excellent organisme modèle pour étudier l’expression des gènes mitochondriaux pour plusieurs raisons. Tout d’abord, leur génome est^{complètement séquencé 3}, bien annoté, et une grande somme de données est déjà disponible dans la littérature grâce à la longue histoire des enquêtes menées avec cet organisme. Deuxièmement, les manipulations avec leur génome nucléaire sont relativement rapides et faciles en raison de leur taux de croissance rapide et de leur système de recombinaison homologue très efficace. Troisièmement, la levure de boulanger S. cerevisiae est l’un des rares organismes pour lesquels les manipulations avec des génomes mitochondriaux sont développées. Enfin, la levure de boulanger est un organisme de faculté d’aérobe-anaérobie, qui permet l’isolement et l’étude des mutants respiratoires défectueux, car ils peuvent se développer dans des médias contenant des sources de carbone fermentescibles.

Nous décrivons la méthode pour étudier l’expression mitochondrique de gène de la levure de boulanger S. cerevisiae au niveau translationnel^4. Son principe principal provient de plusieurs observations. Tout d’abord, le génome mitochondrial de levure ne code que huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l’enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p⁵. Ce nombre est faible, et tous peuvent être séparés par électrophoresis sur un seul gel dans les conditions appropriées. Deuxièmement, les ribosomes mitochondriques appartiennent à la classe procaryotique plutôt qu’à l’eucaryotique⁶, et donc, la sensibilité aux antibiotiques est différente pour les ribosomes cytoplasmiques et mitochondriques de levure. Il permet l’inhibition de la traduction cytoplasmique avec le cycloheximide, fournissant les conditions où l’acide aminé étiqueté⁽³⁵S-méthionine) est incorporé seulement dans les produits de traduction mitochondrial. En conséquence, l’expérience donne des informations sur le taux d’incorporation d’acides aminés dans les protéines mitochondriales synthétisées de novo, reflétant l’efficacité globale de la traduction mitochondriale pour chacun des huit produits

Protocol

1. Préparation de culture de levure Streak levure des cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec le milieu approprié. Mettez les assiettes dans un incubateur de culture à 30 °C pendant 24-48 h.REMARQUE : Laissez pousser les mutants sensibles à la température à la température permissive. Inoculer les cultures de levure dans 2 mL de milieu YPGal (2% de peptone, 1% d’extrait de levure, 2% de galactose) de la strie fraîche dans des tubes de 15 mL et les incuber toute la n…

Representative Results

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrique à partir de deux souches de S. cerevisiae : le type sauvage (WT) et une suppression mutante du gène AIM23 (AIM23Δ), codant le facteur d’initiation à la traduction mitochondrique 3 (tableau 1)8. Les produits de traduction mitochondrial ont été étiquetés et séparés radioactivement dans SDS-PAAG9. Les échantillons ont été prélevés t…

Discussion

Les études de l’expression des gènes occupent une place centrale dans les sciences de la vie modernes. De nombreuses méthodes donnant un aperçu de ce processus complexe ont été développées. Ici, nous avons décrit la méthode permettant d’accéder à la biosynthèse protéique dans la levure de boulanger S. cerevisiae mitochondries. Il est généralement appliqué pour comparer l’efficacité de traduction des ARNH dans les mitochondries de souche de levure mutante par rapport au type sauvage pour accéde…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625