ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化
Summary
ベーカーの酵母ミトコンドリアゲノムは8つのポリペプチドをコードする。現在のプロトコルの目的は、すべてのラベルを付け、後で別々のバンドとして視覚化することです。
Abstract
ミトコンドリアは、好気性呼吸が可能な真核細胞の必須のオルガネラである。それらは円形ゲノムおよび遺伝子発現装置を含んでいる。ベーカー酵母のミトコンドリアゲノムは8つのタンパク質をコードする:シトクロムcオキシダーゼの3つのサブユニット(Cox1p、 Cox2p、およびCox3p)、ATPシンターゼ(Atp6p、Atp8p、およびAtp9p)の3つのサブユニット、ユビキノールシトクロムcオキシド還元酵素のサブユニット、シトクロムb(シtb)、およびミトコンドリアリボソームタンパク質Var1p。ここで説明する方法の目的は、これらのタンパク質を 35Sメチオニンで特異的に標識し、電気泳動によってそれらを分離し、画面上の離散バンドとして信号を視覚化することである。この手順には、いくつかの手順が含まれます。まず、酵母細胞は、ガラクトース含有培地で、対数後期増殖段階に達するまで培養される。次に、シクロヘキシミド処理は細胞質翻訳をブロックし、ミトコンドリア翻訳産物でのみ 35Sメチオニンの組み込みを可能にする。次に、すべてのタンパク質を酵母細胞から抽出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。最後に、ゲルを乾燥させ、蓄電池蛍光体スクリーンでインキュベートする。スクリーンはリンイメージャーでスキャンされ、バンドが明らかになります。この方法は、変異酵母株と野生型のミトコンドリアにおける単一ポリペプチドの生合成速度を比較するために適用することができ、これはミトコンドリア遺伝子発現欠陥の研究に有用である。このプロトコルは、全酵母ミトコンドリアmRNAの翻訳速度に関する貴重な情報を提供します。しかし、適切な結論を出すためには、いくつかの制御と追加の実験が必要です。
Introduction
ミトコンドリアは真核細胞の代謝に深く関与するオルガネラである。彼らの電子移動鎖はATP、複数の生化学的経路で使用される主要なエネルギー通貨を細胞に供給する。また、アポトーシス、脂肪酸、ヘム合成、その他のプロセスに関与しています。ミトコンドリアの機能不全は、ヒト疾患の有名な原因である1.これは、オルガネラ2の構造成分または調節成分をコードする核またはミトコンドリア遺伝子の突然変異から生じる可能性がある。ベーカーの酵母 サッカロミセス・セレビシエ は、いくつかの理由でミトコンドリア遺伝子発現を研究するための優れたモデル生物です。まず、そのゲノムは完全に配列3であり、よく注意を付けており、この生物で行われた長い調査の歴史のおかげで、すでに文献で大きなデータが利用可能です。第二に、核ゲノムによる操作は、その急速な成長速度と高効率の相同組換えシステムのために比較的迅速かつ容易である。第三に、パン酵母 S.セレビシエ は、ミトコンドリアゲノムによる操作が開発された数少ない生物の1つです。最後に、ベーカー酵母は、発酵可能な炭素源を含む培地で成長することができるので、呼吸欠陥変異体の単離と研究を可能にするエアロベ-嫌気性の栄養体です。
パン酵母 S.セレビシエ のミトコンドリア遺伝子発現を翻訳レベル4で研究する方法について説明する。その主な原理は、いくつかの観察から来ています。まず、酵母ミトコンドリアゲノムは8つのタンパク質のみをコードする:シトクロムcオキシダーゼの3つのサブユニット(Cox1p、 Cox2p、およびCox3p)、ATPシンターゼ(Atp6p、Atp8p、およびAtp9p)の3つのサブユニット、ユビキノール-チトクロムcオキシド還元酵素のサブユニット、シトクロムb(シtb)、およびミトコンドリアリボソームタンパク質Var1p5。この数は少なくて、その全ては適切な条件で単一のゲル上で電気泳動により分離することができる。第二に、ミトコンドリアリボソームは真核生物6ではなく原核生物クラスに属し、したがって、抗生物質に対する感受性は酵母細胞質およびミトコンドリアリボソームにおいて異なる。シクロヘキシミドによる細胞質翻訳の阻害を可能にし、標識アミノ酸(35S-メチオニン)がミトコンドリア翻訳産物にのみ組み込まれる条件を提供する。その結果、実験は、8つの製品のそれぞれに対するミトコンドリア翻訳の全体的な効率を反映して、デノボを合成したミトコンドリアタンパク質におけるアミノ酸の取り込み速度に関する情報を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
遺伝子発現の調査は、現代の生命科学の中心的な部分を占めています。この複雑なプロセスに関する洞察を提供する数多くの方法が開発されました。ここでは、ベーカー酵母S.セレビシエミトコンドリアにおけるタンパク質生合成へのアクセスを可能にする方法について説明した。通常、変異酵母株対野生型のミトコンドリアにおけるmRNAの翻訳効率を比較し、研究した突然変異の結果?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ロシア基礎研究財団、助成金番号18-29-07002によって資金提供されました。P.K.は、ロシア連邦の科学省と高等教育省の国家割り当てによって支援されました, 付与番号AAAA-A16-11602160073-5.M.V.P.はロシア連邦の科学・高等教育省の支援を受け、助成金番号075-15-2019-1659(ゲノム研究のクルチャトフセンターのプログラム)でした。作業の一部は、開発のモスクワ州立大学プログラムのフレームで購入した機器で行われました.I.C、S.L.、M.V..Bは、モスクワ州立大学の助成金「ノアの箱舟」によってさらに支援されました。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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