Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.
Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die aerobe Atmung können. Sie enthalten kreisförmige Genom- und Genexpressionsapparate. Ein mitochondriales Genom der Bäckerhefe kodiert acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-C-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondrialem ribosomalem Protein Var1p. Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist es, diese Proteine gezielt mit 35S Methionin zu kennzeichnen, sie durch Elektrophorese zu trennen und die Signale als diskrete Bänder auf dem Bildschirm zu visualisieren. Das Verfahren umfasst mehrere Schritte. Zunächst werden Hefezellen in einem Galaktose-haltigen Medium kultiviert, bis sie das späte logarithmische Wachstumsstadium erreichen. Als nächstes blockiert die Cycloheximid-Behandlung die zytoplasmatische Translation und erlaubt 35S-Methionin-Einarbeitung nur in mitochondriale Translationsprodukte. Anschließend werden alle Proteine aus Hefezellen extrahiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Schließlich wird das Gel getrocknet und mit dem Speicherphosphor-Bildschirm inkubiert. Der Bildschirm wird auf einem Phosphorimager gescannt, der die Bänder enthüllt. Die Methode kann angewendet werden, um die Biosyntheserate eines einzelnen Polypeptids in der Mitochondrie eines mutierten Hefestamms mit dem Wildentyp zu vergleichen, der für die Untersuchung von mitochondrialen Genexpressionsdefekten nützlich ist. Dieses Protokoll liefert wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate aller Hefe mitochondrialen mRNAs. Es erfordert jedoch mehrere Kontrollen und zusätzliche Experimente, um richtige Schlussfolgerungen zu ziehen.
Mitochondrien sind die Organellen, die tief in den Stoffwechsel einer eukaryotischen Zelle involviert sind. Ihre Elektronentransferkette versorgt die Zelle mit ATP, der wichtigsten energetischen Währung, die in mehreren biochemischen Bahnen verwendet wird. Außerdem sind sie an Apoptose, Fettsäure- und Hämsynthese und anderen Prozessen beteiligt. Dysfunktion der Mitochondrien ist eine bekannte Quelle der menschlichen Krankheit1. Es kann aus Mutationen in nuklearen oder mitochondrialen Genen resultieren, die strukturelle oder regulatorische Komponenten der Organellen kodieren2. Bakers Hefe Saccharomyces cerevisiae ist aus mehreren Gründen ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung der mitochondrialen Genexpression. Erstens ist ihr Genom vollständig sequenziert3, gut annotiert, und eine große Summe von Daten ist bereits in der Literatur dank der langen Geschichte der Untersuchungen mit diesem Organismus durchgeführt. Zweitens sind die Manipulationen mit ihrem Kerngenom aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und ihres hocheffizienten homologen Rekombinationssystems relativ schnell und einfach. Drittens ist die Bäckerhefe S. cerevisiae einer der wenigen Organismen, für die die Manipulationen mit mitochondrialen Genomen entwickelt werden. Schließlich ist Bäckerhefe ein aerobe-anaerobe fakultativer Organismus, der die Isolierung und Untersuchung von atemmedizinischen defekten Mutanten ermöglicht, da sie in Medien wachsen können, die fermentierbare Kohlenstoffquellen enthalten.
Wir beschreiben die Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Genexpression der Bäckerhefe S. cerevisiae auf der Translationsebene4. Sein Hauptprinzip ergibt sich aus mehreren Beobachtungen. Erstens kodiert das Hefemitochondrialgenom nur acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-c-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondriales ribosomales Protein Var1p5. Diese Zahl ist klein, und alle von ihnen können durch Elektrophorese auf einem einzigen Gel unter den entsprechenden Bedingungen getrennt werden. Zweitens gehören mitochondriale Ribosomen eher zur prokaryotischen Klasse als zu eukaryotischen6, und daher ist die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bei Hefezytoplasma- und Mitochondrienribosomen unterschiedlich. Es ermöglicht die Hemmung der zytoplasmatischen Translation mit Cycloheximid, die Bedingungen, wenn die markierte Aminosäure(35S-Methionin) nur in mitochondrialen Übersetzungsprodukten enthalten ist. Als Ergebnis liefert das Experiment Informationen über die Rate der Aminosäure-Inkorporation in mitochondrialen Proteinen synthetisiert de novo, was die Gesamteffizienz der mitochondrialen Übersetzung für jedes der acht Produkte widerspiegelt
Untersuchungen der Genexpression spielen einen zentralen Teil der modernen Biowissenschaften ein. Es wurden zahlreiche Methoden entwickelt, die Einblicke in diesen komplexen Prozess geben. Hier beschrieben wir die Methode, die den Zugang zur Proteinbiosynthese in der Bäckerhefe S. cerevisiae mitochondria ermöglicht. Es wird in der Regel angewendet, um die Übersetzungseffizienz der mRNAs in Mitochondrien des mutierten Hefestamms im Vergleich zum Wildtyp zu vergleichen, um auf die Folgen der untersuchten Mutati…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde von der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung, Stipendium Nummer 18-29-07002, finanziert. P.K. wurde durch die staatliche Zuweisung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Fördernummer AAAA-A16-116021660073-5 unterstützt. M.V.P. wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Fördernummer 075-15-2019-1659 (Programm des Kurchatov Center of Genome Research) unterstützt. Die Arbeit wurde teilweise an der Ausrüstung im Rahmen des Moskauer Staatlichen Universitätsprogramms für Entwicklung gekauft getan. I.C., S.L. und M.V.B. wurden zusätzlich vom Stipendium der Staatlichen Universität Moskau “Leading Scientific School Noah es Ark” unterstützt.
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |