תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר
Summary
הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.
Abstract
המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. הם מכילים גנום מעגלי ומנגנון ביטוי גנים. גנום מיטוכונדריאלי של שמרי אופה מקודד שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p. מטרת השיטה המתוארת כאן היא לתייג במיוחד חלבונים אלה עם 35S methionine, להפריד אותם על ידי אלקטרופורזה לדמיין את האותות כמו להקות נפרדות על המסך. ההליך כרוך במספר שלבים. ראשית, תאי שמרים מתרבתים במדיום המכיל גלקטוז עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמי המאוחר. לאחר מכן, טיפול ציקלוהקסימיד חוסם תרגום ציטופלסמי ומאפשר 35S שילוב מתיון רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, כל החלבונים מופקים מתאי שמרים ומופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילמיד. לבסוף, הג’ל מיובש ומדגיר עם מסך זרחן האחסון. המסך נסרק על זרחן החושף את הלהקות. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעור הביוסינתזה של פוליפפטיד יחיד במיטוכונדריה של זן שמרים מוטציה לעומת סוג הבר, אשר שימושי לחקר פגמים ביטוי גנים מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מספק מידע רב ערך על קצב התרגום של כל mRNAs המיטוכונדריה שמרים. עם זאת, הוא דורש מספר בקרות וניסויים נוספים כדי להסיק מסקנות נכונות.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים מעורבים עמוק בחילוף החומרים של תא אוקריוטי. שרשרת העברת האלקטרונים שלהם מספקת לתא ATP, המטבע האנרגטי העיקרי המשמש במסלולים ביוכימיים מרובים. חוץ מזה, הם מעורבים אפופטוזיס, חומצת שומן סינתזה heme, ותהליכים אחרים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא מקור ידוע של מחלה אנושית1. זה יכול לנבוע מוטציות בגנים גרעיניים או מיטוכונדריאליים קידוד רכיבים מבניים או רגולטוריים של organelles2. שמרי בייקר Saccharomyces cerevisiae הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר ביטוי גנים מיטוכונדריאלי בשל מספר סיבות. ראשית, הגנום שלהם רצף לחלוטין3, מבואר היטב, וסכום גדול של נתונים כבר זמין בספרות הודות להיסטוריה הארוכה של חקירות שבוצעו עם האורגניזם הזה. שנית, המניפולציות עם הגנום הגרעיני שלהם הן מהירות וקלות יחסית בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם ומערכת רקומביניזציה הומולוגית יעילה מאוד. שלישית, שמרי האופה S. cerevisiae הוא אחד האורגניזמים הבודדים שעבורם המניפולציות עם הגנום המיטוכונדריאלי מפותחות. לבסוף, שמרי האופה הוא אורגניזם פקולטטיבי אווירוב-אנארוב, המאפשר בידוד וחקר של מוטציות פגומות בדרכי הנשימה, שכן הם יכולים לגדול במדיה המכילה מקורות פחמן מותססים.
אנו מתארים את השיטה ללמוד ביטוי גנים מיטוכונדריאלי של שמרי אופה S. cerevisiae ברמה התרגומית4. העיקרון העיקרי שלה מגיע מכמה תצפיות. ראשית, הגנום המיטוכונדריאלי של השמרים מקודד רק שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p5. מספר זה קטן, וניתן להפריד את כולם על ידי אלקטרופורזה על ג’ל יחיד בתנאים המתאימים. שנית, ריבוזומים מיטוכונדריאליים שייכים למעמד הפרוקריוטי ולא לאוקריוטיקה6, ולכן הרגישות לאנטיביוטיקה שונה עבור ריבוזומים ציטופלזמים ומיטוכונדריאליים. זה מאפשר עיכוב של תרגום ציטופלסמי עם ציקלוהקסימיד, מתן התנאים כאשר חומצת אמינו שכותרתו(35S-מתיונין) משולב רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, הניסוי מספק מידע על קצב שילוב חומצות האמינו בחלבונים המיטוכונדריים מסונתז דה נובו, המשקף את היעילות הכוללת של תרגום מיטוכונדריאלי עבור כל אחד משמונת המוצרים
Protocol
Representative Results
Discussion
חקירות של ביטוי גנים תופסות חלק מרכזי במדעי החיים המודרניים. פותחו שיטות רבות המספקות תובנות על תהליך מורכב זה. כאן, תיארנו את השיטה המאפשרת גישה לביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה S. cerevisiae של בייקר. זה מיושם בדרך כלל כדי להשוות יעילות תרגום של mRNAs במיטוכונדריה של זן שמרים מוטנטים לעומ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי הקרן הרוסית למחקר בסיסי, מענק מספר 18-29-07002. P.K. נתמך על ידי הקצאת המדינה של משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מספר מענק AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. נתמך על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מספר 075-15-2019-1659 (תוכנית מרכז Kurchatov לחקר הגנום). העבודה נעשתה בחלקה על הציוד שנרכש במסגרת תוכנית הפיתוח של אוניברסיטת מוסקבה. I.C., S.L., ו M.V.B נתמכו בנוסף על ידי אוניברסיטת מוסקבה סטייט מענק “בית הספר המדעי המוביל תיבת נח”.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
