Маркировка и визуализация продуктов экспрессии митохондриального генома в хлебобулочных saccharomyces cerevisiae
Summary
Дрожжи Бейкера митохондриального генома кодирует восемь полипептидов. Цель текущего протокола состоит в том, чтобы обозначить все из них, а затем визуализировать их как отдельные полосы.
Abstract
Митохондрии являются важными органеллами эукариотических клеток, способных к аэробному дыханию. Они содержат круговой геном и аппарат экспрессии генов. Митохондриальный геном хлебопекарных дрожжей кодирует восемь белков: три субъединита цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазы АТФ (Atp6p, Atp8p и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Цель метода, описанного здесь, состоит в том, чтобы конкретно обозначить эти белки с 35S метионином, отделить их электрофорезом и визуализировать сигналы как дискретные полосы на экране. Процедура включает в себя несколько этапов. Во-первых, дрожжевые клетки культури в галактозоссодержащей среде, пока они не достигнут поздней стадии логаритмического роста. Далее, циклохексимид лечения блокирует цитоплазмический перевод и позволяет 35S метионин включения только в митохондриальных переводческих продуктов. Затем все белки извлекаются из дрожжевых клеток и отделяются полиакриламинидным гель-электрофорезом. Наконец, гель сушат и инкубируется с экраном фосфора хранения. Экран сканируется на фосфоримагер выявления полос. Метод может быть применен для сравнения скорости биосинтеза одного полипептида в митохондриях штамма мутантных дрожжей по сравнению с диким типом, который полезен для изучения дефектов экспрессии митохондриального гена. Этот протокол дает ценную информацию о скорости перевода всех дрожжей митохондриальных мРНК. Тем не менее, для того, чтобы сделать правильные выводы, требуется несколько элементов управления и дополнительные эксперименты.
Introduction
Митохондрии являются органеллы глубоко участвует в метаболизме эукариотической клетки. Их цепочка передачи электронов снабжает клетку АТФ, основной энергетической валютой, используемой в нескольких биохимических путях. Кроме того, они участвуют в апоптозе, синтезе жирных кислот и гемов, а также в других процессах. Дисфункция митохондрий является известным источником болезни человека1. Это может быть результатом мутаций в ядерных или митохондриальных генах, кодирующих структурные или регулятивные компонентыорганелл 2. Дрожжи Бейкера Saccharomyces cerevisiae является отличной моделью организма для изучения митохондриальной экспрессии генов по нескольким причинам. Во-первых, их геномполностью секвенирован 3,хорошо аннотирован, и большая сумма данных уже доступна в литературе благодаря долгой истории исследований, проведенных с этим организмом. Во-вторых, манипуляции с их ядерным геномом относительно быстры и просты из-за их быстрых темпов роста и высокоэффективной гомологичной системы рекомбинации. В-третьих, хлебопекарные дрожжи S. cerevisiae являются одним из немногих организмов, для которых разрабатываются манипуляции с митохондриальными геномами. Наконец, хлебопекарные дрожжи – это аэробе-анаэробный биологический организм, который позволяет изоляцию и изучение респираторных дефектных мутантов, так как они могут расти в средствах массовой информации, содержащих ферментируемые источники углерода.
Мы описываем метод изучения митохондриальной экспрессии генов пекаря дрожжей S. cerevisiae на трансляционнойуровне 4. Его основной принцип исходит из нескольких наблюдений. Во-первых, дрожжи митохондриального генома кодирует только восемь белков: три подразделения цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазыАТФ(Atp6p, Atp8p, и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Это число невелико, и все они могут быть разделены электрофорезом на одном геле в соответствующих условиях. Во-вторых, митохондриальные рибосомы относятся к прокариотическому классу, а нек эукариотическим 6,и поэтому чувствительность к антибиотикам различна для дрожжевых цитоплазмических и митохондриальных рибосом. Это позволяет ингибировать цитоплазмический перевод циклохексимидом, обеспечивая условия, при которых маркированная аминокислота(35S-метионин) включается только в митохондриальные переводческие продукты. В результате эксперимента дается информация о скорости включения аминокислот в митохондриальные белки, синтезированные de novo, что отражает общую эффективность митохондриального перевода для каждого из восьми продуктов
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования экспрессии генов занимают центральное место в современных науках о жизни. Разработаны многочисленные методы, обеспечивающие понимание этого сложного процесса. Здесь мы описали метод, позволяющий получить доступ к биосинтезу белка в хлебопекарных дрожжах S. cerevisiae ми?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Российским фондом фундаментальных исследований, грантом No 18-29-07002. П.К. был поддержан Государственным поручением Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, грантом АААА-А16-116021660073-5. М.В.П. при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1659 (Программа Курчатовского центра геномных исследований). Работы частично были выполнены на оборудовании, закупленное в рамках Программы развития МГУ. I.C., S.L. и M.V.B. были дополнительно поддержаны грантом МГУ «Ведущая научная школа Ноев ковчег».
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
