Märkning och visualisering av mitokondriella genomuttrycksprodukter i bagerijäst Saccharomyces cerevisiae
Summary
Bakers jäst mitokondriella genom kodar för åtta polypeptider. Målet med det nuvarande protokollet är att märka dem alla och därefter visualisera dem som separata band.
Abstract
Mitokondrier är viktiga organeller av eukaryota celler som kan aeroba andning. De innehåller cirkulärt genom och genuttrycksapparatur. Ett mitokondriellt genom av bagerijäst kodar för åtta proteiner: tre underenheter av cytokrom c oxidas (Cox1p, Cox2p och Cox3p), tre underenheter av ATP-syntasen (Atp6p, Atp8p och Atp9p), en underavdelning till ubiquinol-cytokrom c oxidoreduktasenzymet, cytokrom b (Cytb) och mitokondriellt ribosomprotein Var1p. Syftet med metoden som beskrivs här är att specifikt märka dessa proteiner med 35S metionin, separera dem med elektrofores och visualisera signalerna som diskreta band på skärmen. Förfarandet omfattar flera steg. Först odlas jästceller i ett galaktosinnehållande medium tills de når det sena logaritmiska tillväxtstadiet. Därefter blockerar cykloheximidbehandling cytoplasmisk översättning och tillåter endast 35S metionininkorporation i mitokondriella översättningsprodukter. Sedan extraheras alla proteiner från jästceller och separeras med polyakrylamidgelelektrofores. Slutligen torkas och inkuberas gelén med lagringsfosforskärmen. Skärmen skannas på en fosforimager som avslöjar banden. Metoden kan tillämpas för att jämföra biosyntesen av en enda polypeptid i mitokondrierna hos en mutantjäststam jämfört med den vilda typen, vilket är användbart för att studera mitokondriella genuttrycksdefekter. Detta protokoll ger värdefull information om översättningshastigheten för alla jäst mitokondriella mRNAs. Det krävs dock flera kontroller och ytterligare experiment för att dra lämpliga slutsatser.
Introduction
Mitokondrier är de organeller som är djupt involverade i metabolismen av en eukaryota cell. Deras elektronöverföringskedja förser cellen med ATP, den viktigaste energiska valutan som används i flera biokemiska vägar. Dessutom är de involverade i apoptos, fettsyra och hemsyntes och andra processer. Dysfunktion av mitokondrier är en välkänd källa till mänsklig sjukdom1. Det kan bero på mutationer i nukleära eller mitokondriella gener som kodar strukturella eller regulatoriska komponenter i organellerna2. Bakers jäst Saccharomyces cerevisiae är en utmärkt modellorganism för att studera mitokondriell genuttryck på grund av flera skäl. För det första är deras arvsmassa heltsekvenserad 3, väl kommenterad, och en stor mängd data finns redan i litteraturen tack vare den långa historien av undersökningar som utförs med denna organism. För det andra är manipuleringarna med sitt kärngenom relativt snabba och enkla på grund av deras snabba tillväxttakt och mycket effektiva homologa rekombinationssystem. För det tredje är bagerijäst S. cerevisiae en av de få organismer för vilka manipuleringarna med mitokondriella genom utvecklas. Slutligen är bagerijäst en aerobe-anaerobe facultative organism, som tillåter isolering och studier av luftvägarna defekta mutanter, eftersom de kan växa i medier som innehåller fermenterbara kolkällor.
Vi beskriver metoden att studera mitokondriell gen uttryck av bageri jäst S. cerevisiae på translationell nivå4. Dess huvudprincip kommer från flera observationer. För det första kodar jäst mitokondriellt genom endast åtta proteiner: tre underenheter av cytokrom c oxidas (Cox1p, Cox2p och Cox3p), tre underenheter av ATP-syntasen (Atp6p, Atp8p och Atp9p), en underavdelning till ubiquinol-cytokrom c oxidoreduktasenzymet, cytokrom b (Cytb) och mitokondriellt ribosomprotein Var1p5. Detta antal är litet, och alla kan separeras med elektrofores på en enda gel under lämpliga förhållanden. För det andra tillhör mitokondriella ribosomer den prokaryota klassen snarare än eukaryota6, och därför är känsligheten för antibiotika annorlunda för jästcytoplasmiska och mitokondriella ribosomer. Det möjliggör hämning av cytoplasmisk översättning med cykloheximid, vilket ger villkoren när den märktaaminosyran (35S-metionin) endast ingår i mitokondriella översättningsprodukter. Som ett resultat ger experimentet information om frekvensen av aminosyrainkorporering i mitokondriella proteiner syntetiserade de novo, vilket återspeglar den totala effektiviteten av mitokondriell översättning för var och en av de åtta produkterna
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersökningar av genuttryck upptar en central del i moderna livsvetenskaper. Många metoder som ger insikter om denna komplexa process har utvecklats. Här beskrev vi metoden som gör det möjligt att få tillgång till proteinbiosyntes i bagerijäst S. cerevisiae mitokondrier. Det tillämpas vanligtvis för att jämföra översättningseffektiviteten hos mRNAs i mitokondrier av mutant jäst stam kontra vild typ för att få tillgång till konsekvenserna av den studerade mutationen. Detta är ett av de grundl?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av ryska stiftelsen för grundforskning, anslag nummer 18-29-07002. P.K. stöttades av Statligt uppdrag av departement av vetenskap och högre utbildning av Ryska federationen, anslag numrerar AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. stöddes av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning, bidragsnummer 075-15-2019-1659 (Program of Kurchatov Center of Genome Research). Arbetet gjordes delvis på den utrustning som köptes inom ramen för Moskvas statliga universitetsprogram för utveckling. I.C., S.L., och M.V.B. stöttades dessutom av Moscow state university anslag “Leading Scientific School Noah’s Ark”.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
