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Developmental Biology

Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes

Published: January 30, 2021 doi: 10.3791/62182
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, University of South Carolina School of Medicine, 2Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine Baltimore, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, University of South Carolina

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour la culture systématique de sphéroïdes épidermiques en culture en suspension 3D. Ce protocole a de nombreuses applications pour une utilisation dans une variété de types de tissus épithéliaux et pour la modélisation de plusieurs maladies et affections humaines.

Abstract

La dérégulation épithéliale est un nœud pour une variété de conditions et de maux humains, y compris les blessures chroniques, l’inflammation et plus de 80% de tous les cancers humains. En tant que tissu de la muqueuse, l’épithélium cutané est souvent sujet à des blessures et s’est adapté à l’évolution en acquérant la plasticité cellulaire nécessaire pour réparer les tissus endommagés. Au fil des ans, plusieurs efforts ont été déployés pour étudier la plasticité épithéliale à l’aide de modèles cellulaires in vitro et ex vivo. Cependant, ces efforts ont été limités dans leur capacité à récapituler les différentes phases de la plasticité des cellules épithéliales. Nous décrivons ici un protocole pour générer des sphéroïdes épidermiques 3D et des cellules dérivées de sphéroïdes épidermiques à partir de kératinocytes humains néonatals primaires. Ce protocole décrit la capacité des cultures de sphéroïdes épidermiques à modéliser fonctionnellement des stades distincts de la plasticité générative des kératinocytes et démontre que le repoingage des sphéroïdes épidermiques peut enrichir les cultures hétérogéniques normales de kératinocytes humains (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytes intégriens (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytesintégriens hi/EGFRlo présentant des caractéristiques améliorées semblables à celles de la tige. Notre rapport décrit le développement et le maintien d’un système à haut débit pour l’étude de la plasticité kératinocytaire cutanée et de la régénération épidermique.

Introduction

L’épithélium stratifié des mammifères est l’architecture épithéliale la plus complexe de tous les systèmes vivants et est le plus souvent sujet à des dommages et à des blessures. En tant que tissu protecteur, l’épithélium stratifié a évolué pour générer une réponse complexe et efficace aux lésions tissulaires. En cas de blessure, ces cellules doivent activer des programmes de plasticité de lignée, qui leur permettent de migrer vers le site blessé et d’effectuer des réparations1,2,3. Cette réponse multiforme se produit en plusieurs étapes séquentielles qui restent mal comprises.

Un obstacle majeur dans l’étude du processus complexe de régénération épithéliale réside dans la pénurie de systèmes modèles à haut débit qui peuvent capturer les activités cellulaires dynamiques à des stades définis de la régénération cellulaire. Alors que les modèles murins in vivo offrent des informations pertinentes sur la cicatrisation des plaies et récapitulent le plus fidèlement le processus de régénération humaine, leur développement nécessite des efforts laborieux et des coûts importants, limitant leur capacité de débit. Il existe donc un besoin critique d’établir des systèmes qui permettent l’étude fonctionnelle de la régénération des tissus épithéliaux humains à grande échelle.

Ces dernières années, plusieurs tentatives ont été faites pour relever le défi de l’évolutivité. Cela se voit à travers une grande expansion de modèles cellulaires in vitro et ex vivo innovants qui imitent étroitement le contexte régénératif in vivo. Cela inclut les progrès dans les organes sur puce4,le sphéroïde5,l’organoïde6et les cultures organotypiques7. Ces systèmes à base de cellules 3D offrent chacun des avantages uniques et présentent des limites expérimentales distinctes. À ce jour, la culture sphéroïde reste le modèle de culture cellulaire 3D le plus rentable et le plus utilisé. Et bien que plusieurs rapports aient indiqué que les cultures de sphéroïdes peuvent être utilisées pour étudier les caractéristiques des cellules souches de la peau, ces études ont été menées en grande partie avec des tissus animaux8,9ou avec des fibroblastes dermiques10,sans pratiquement aucun rapport caractérisant de manière approfondie les propriétés régénératrices des cultures de sphéroïdes épidermiques humains. Dans ce protocole, nous détaillons le développement fonctionnel, la culture et le maintien des cultures de sphéroïdes épidermiques à partir de kératinocytes humains normaux (NHKc). Nous décrivons également l’utilité de ce système pour modéliser les phases séquentielles de la régénération épidermique et de la plasticité des cellules souches kératinocytes in vitro.

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Protocol

Le protocole de prélèvement et de manipulation des échantillons de peau et d’isolement des kératinocytes humains a été examiné par l’IRB de l’Université de Caroline du Sud (UofSC) et classé comme « recherche n’impliquant pas de sujets humains », car les échantillons de prépuce étaient des rejets chirurgicaux produits lors d’interventions chirurgicales de routine (circoncision des nouveau-nés) et étaient complètement dépourvus d’informations d’identification. Le protocole a également été examiné et approuvé régulièrement par le Comité de la biosécurité de l’Université de la Sécurité, et tout le personnel de laboratoire a suivi une formation en matière de biosécurité en laboratoire. Toutes les procédures ont été menées conformément aux normes de sécurité et d’éthique de l’UofSC.

1. Isolement et culture de kératinocytes humains à partir de tissu prépuce néonatal

  1. Préparer le milieu de lavage en ajoutant un tampon HEPES de 0,1 M à 500 mL de milieu KSFM et l’ajuster à un pH de 7,2. Stériliser le milieu dans un filtre à vide de 500 mL (taille des pores de 0,22 μm). Le milieu basal MCDB 153-LB peut également être utilisé comme solution de lavage alternative à la place de KSFM.
  2. Dans une hotte à écoulement laminaire, laver le prépuce néonatal avec 5 mL de produit de lavage dans un tube conique de 50 mL. Répétez deux fois.
  3. Transférer le prépuce lavé dans une boîte de Petri stérile. À l’aide d’un scalpel et d’une pince, grattez les tissus conjonctifs adipeux et lâches de la couche dermique. Lavez à nouveau le prépuce avec 5 mL de produit de lavage dans un tube conique de 50 mL.
  4. Placer l’épiderme du prépuce vers le haut dans une plaque de 6 puits contenant 2 mL d’enzyme dispase diluée dans un milieu de lavage (50 U / mL).
  5. Transférer la plaque dans un incubateur pendant 4 heures (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  6. Retirez le prépuce de l’incubateur et, dans des conditions stériles, transférez-le dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une pince à pointe fine, séparez l’épiderme de la couche de derme.
  7. Placer l’épiderme dans un tube conique de 15 mL contenant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 %. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, écrasez mécaniquement l’épiderme flottant. Incuber pendant 15 min à 37 °C avec un vortex périodique pendant 5 s toutes les 5 min.
  8. Après l’incubation, ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja et mélanger par pipetage pour neutraliser la trypsine.
  9. Suspension de cellule centrifuge pendant 2 min à 450 x g,puis pendant 8 min à 250 x g.
  10. Enlevez les débris flottants avec des pinces, en veillant à ne pas déloger la pastille de cellule. Aspirer soigneusement le surnageant de la pastille cellulaire.
  11. Resuspendez la pastille dans 12 mL de milieu KSFM-scm complet et la plaque dans un plat de 10 cm. Incuber le plat pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  12. Le lendemain, retirez le milieu à l’aide d’une pipette aspirante et remplacez-le par 12 mL de KSFM-scm complet. Répétez les jours 4 et 7.
  13. Pour maintenir une croissance optimale des cultures normales de kératinocytes humains (NHKc), les cellules de passage 1:5 au jour 10 pour empêcher les cellules d’atteindre une confluence supérieure à 80%.

2. Génération de cultures d’épidermosphère cutanée in vitro

  1. Préparer un mélange d’agarose à 5 % en ajoutant 2,5 g d’agarose à 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans une bouteille en verre de 50 mL. Bouteille autoclave sous cycle liquide. Laisser refroidir à température ambiante.
  2. Pour préparer les plaques, placez la bouteille en verre refroidie contenant une solution d’agarose dans un bécher en plastique de 1 L rempli de 200 mL d’eau désionisée (dH2O). Faire fondre le mélange d’agarose dans un micro-ondes de qualité recherche pendant 2 minutes, en mélangeant la gélose toutes les 60 s en inclinant doucement la bouteille d’un côté à l’autre.
    ATTENTION: La fonte de la gélose au micro-ondes rendra le récipient de la fiole extrêmement chaud, ce qui entraînera une accumulation de pression. Relâchez l’accumulation de pression toutes les 30 s. Portez un équipement de protection approprié pour éviter les blessures.
  3. Ajouter 3 mL d’agarose fondue à 5 % à 12 mL de KSFM-scm préchafait à 42 °C pour une concentration finale de 1 % d’agarose (poids/vol).
    En option : préchauffez les pipettes sérologiques et les embouts de pipette pour éviter la polymérisation prématurée de la gélose souple.
  4. Pipeter rapidement 200 μL du mélange de gélose à 1 % dans des puits individuels d’une plaque à fond rond de 96 puits à l’aide d’un pipetteur multicanal(Figure 1A). Laisser la plaque dans un environnement stérile à 25 °C pendant 4 h pour permettre à l’agarose de polymériser complètement.
    REMARQUE: L’expérimentation peut être arrêtée ici et poursuivie le lendemain. Les plaques d’agarose polymérisées peuvent être maintenues à 37 °C jusqu’à 24 h ou à 4 °C jusqu’à 48 h lorsqu’elles sont scellées avec une pellicule parafilm. Plaque chaude à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant au moins 1 h avant utilisation.
  5. Passage de NHKc formant des sphéroïdes par aspiration de milieux et cellules de lavage dans 2 mL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules lavées. Incuber pendant 5 min à 37 °C ou jusqu’à ce que toutes les cellules se détachent complètement. Ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja à la plaque et laver les cellules de la plaque dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min.
  6. Resuspendez la pastille dans 1 mL de PBS. Quantifiez la viabilité cellulaire à l’aide d’une coloration au bleu de trypan et d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  7. Aliquote 2 x 104 NHKc dans 100 μL de KSFM-scm et ensemencer dans des puits individuels de plaque à fond rond de 96 puits préalablement préparée. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  8. À l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée, analysez bien ensemencé pour la formation d’épidermosphère.
    REMARQUE: Les épidermosphères humaines provenant de kératinocytes humains normaux peuvent rester viables en culture en suspension 3D jusqu’à 96 h, bien qu’avec une diminution considérable de la viabilité cellulaire (Figure 2).

3. Test de re-placage sphéroïde épidermique

  1. 24-48 h après la formation de l’épidermosphère 3D, ajoutez 4 mL de KSFM-scm préwarmed à un plat de 6 cm. Utilisez une pointe de pipette de 1 mL à large alésage pour transférer un seul sphéroïde sur la plaque, en veillant à ne pas la briser. Alternativement, élargissez une pointe de pipette de 1 mL à l’aide d’une lame de rasoir stérile pour couper la pointe.
  2. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5 % de CO2,95 % d’humidité).
  3. Analyser le sphéroïde ensemencé pour la fixation au bas de la plaque et observer la propagation des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé (Figure 3). Cellules d’alimentation toutes les 96 h en retirant doucement 2 mL de média à l’intérieur de la plaque et en ajoutant lentement 2 mL de média KSFM-scm frais à la plaque.
  4. Passage dérivé de sphéroïde (SD) NHKc une fois qu’ils atteignent 70-80% de confluence et continuent avec le test de choix. Surveillez fréquemment le SD-NHKc pour empêcher les cellules d’atteindre leur pleine confluence en culture, car cela entraîne une différenciation prématurée et un arrêt de la croissance cellulaire(Figure 3E-F).
  5. Le test de replaquage épidermique sphéroïde modélise la réparation de la plaie médiée par les kératinocytes en capturant chacune des phases séquentielles clés de la plasticité régénérative épidermique : a) entretien homéostatique, b) arrêt/inversion de la différenciation c) mobilité de la lignée de stress, et d) restauration tissulaire (Figure 1B; Tableau 2). Ce test peut également être utilisé pour produire des populations cellulaires pour des cultures organotypiques en radeau ou pour modéliser la néoplasie médiée par le VPH comme démontré dans nos travaux précédents 11,12.

4.3D suivi des cellules de fluorescence

  1. Dans une boîte de 6 cm, transfecter des cultures NHKc monocouches 2D formant des sphéroïdes avec 1 μg de vecteur plasmidique pMSCV-IRES-EGFP portant le gène de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). Plaque incubée pendant la nuit (37 °C, 5 % DE CO2,95 % d’humidité) au microscope(Figure 4A).
    REMARQUE: Il est important que la transfection soit effectuée dans des conditions sans antibiotiques sans sérum.
  2. Sans retirer le mélange de transfection, ajoutez 2 mL de KSFM-scm préwarmé aux cellules. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  3. Aspirer tous les milieux de transfection des plaques et des cellules d’alimentation avec 3 mL de KSFM-scm préwargé. Évaluer la présence de cellules exprimant l’EGFP sous le canal FITC d’un microscope fluorescent.
  4. Passage et ensemencement de 2 x10 4 cellules transfectées par l’EGFP dans des puits individuels d’une plaque à fond rond de 96 puits préalablement préparée. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité). Visualiser et surveiller le mouvement des cellules sphéroïdes EGFPpos sous le canal FITC d’un microscope à fluorescence(Figure 4B-C).
  5. 24 h après le placage, ajouter 3 mL de KSFM-scm préwargé à un plat de 6 cm. Utilisez une pointe de pipette de 1 mL à large alésage pour transférer un seul sphéroïde sur la plaque, en veillant à ne pas la briser. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  6. Observez et analysez la propagation del’EGFP SD-NHKc à l’aide d’un microscope à fluorescence. Cellules d’alimentation toutes les 96 h en retirant doucement 2 mL le média à l’intérieur de la plaque et en ajoutant lentement 2 mL de média KSFM-scm frais à la plaque.
  7. Récolte SD-NHKCEGFP pour l’isolement FACS ou les tests de choix.

5. Caractérisation des sous-populations dérivées des sphéroïdes (ET) par FACS

  1. Passage SD-NHKc et cultures monocouches 2D autologues correspondantes en aspirant de vieux milieux et en lavant les cellules dans 2 mL de PBS. Retirer le PBS et ajouter 2 mL de Trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules lavées. Incuber à 37 °C pendant 5 min ou jusqu’à ce que toutes les cellules se détachent complètement.
  2. Ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja à la plaque et transférer les cellules dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min.
  3. Resuspendez les granulés dans 1 mL de PBS. Quantifier la viabilité cellulaire à l’aide du bleu de trypan et d’un compteur cellulaire automatisé d’hémocytomètre.
  4. Aliquote 100 μL contenant 0,1-4 x 106 cellules NHKc à des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Placez le tube sur la glace dans un environnement sombre, créé en éteignant les lumières vives dans la hotte laminaire.
  5. Ajouter 2 μL d’anti-intégrine6 conjuguée au FITC et 2 μL d’anti-EGFR conjugué au PE aux tubes pour obtenir une dilution de 1:50. Préparez un tube sans anticorps ajouté pour servir de contrôle non coloré. Incuber des tubes sur de la glace dans l’obscurité ou à 4 °C pendant 30 min. L’utilisation de perles ou d’une ligne de CSC de la peau peut servir de contrôle positif, car les cellules de CSC de la peau expriment des niveaux élevés d’intégrine6 et d’EGFR.
  6. Effectuer une analyse de cytométrie en flux à l’aide du cytomètre en flux de choix contenant avec des lasers appropriés.
  7. Utilisez les contrôles négatifs et positifs pour établir des portes. Trier la sous-population de cellules integrinα6hi/EGFRlo ; il s’agit de la fraction des cellules souches épidermiques. Les cellules integrinα6hi/EGFRhi sont la fraction cellulaire progénitaire proliférative. Les cellules integrinα6lo/EGFRhi sont la fraction cellulaire progéniteur engagée(Figure 4D). Le ou les tubes FACS de tri doivent contenir au moins 1 mL de KSFM-scm glacé.
  8. Tester la capacité proliférative des sous-populations cellulaires triées en transférant le contenu de chaque tube de tri respectif dans un tube conique de 15 mL contenant 10 fois le volume des cellules triées dans PBS. REMARQUE: Il est important d’enlever toutes les cellules attachées au bord en pipetant la paroi du ou des tubes FACS de tri plusieurs fois, car les kératinocytes peuvent souvent y adhérer.
  9. Centrifuger des tubes de 15 mL à 250 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en caisse la pastille dans 12 mL de KSFM-scm. Transférer les cellules remises en caisse dans une plaque de 6 cm et incuber toute la nuit (37 °C, 5 % deCO2,95 % d’humidité).
  10. Le lendemain, retirer le support dans des plaques et ajouter 8 mL de KSFM-scm préchauffé. Incuber à 37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité. Ré-alimenter les cellules avec un milieu de 12 mL tous les 3 jours jusqu’à 70-80% confluent (Figure 4E).

6. Immunofluorescence et coloration des épidermosphères pour les marqueurs de cellules souches basales

  1. Transférer les épidermosphères sur des couvercles recouverts de poly-lysine. Laissez le SD-NHKc se propager jusqu’à 75% de confluent.
  2. Lavez les cellules deux fois dans du PBS (4 °C) pendant 5 min chacune.
  3. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante.
  4. Perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton X-100 dans 1% de glycine. Bloquer en utilisant 0,5% de BSA et 5% de sérum de chèvre pendant 30 min à température ambiante.
  5. Incuber des échantillons avec des anticorps contre P63 (1:200) et cytokératine 14 (1:200) dans une solution bloquante pendant la nuit à 4 °C.
  6. Laver trois fois avec du PBS (4 °C) contenant du Tween 20 (PBST), suivi d’une incubation avec des anticorps secondaires conjugués FITC et Alexa 568 (dilution 1:1000).
  7. Coloration des noyaux avec du 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilution 1:5000) avant de monter les cellules.
  8. Observez les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent avec des raies laser FITC et PE (Figure 4F).

7. Analyse transcriptionnelle des cultures d’épidermosphère

  1. Mettre en place des plaques triples de cultures NHKc à faible passage pour isoler l’ARN peut provenir de cultures monocouches, sphéroïdes et dérivées de sphéroïdes de la même lignée cellulaire autologue.
  2. Regrouper 3 à 5 épidermosphères correspondantes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Récoltez séparément les cultures autologues SD-NHKc et monocouches 2D.
  3. Isoler l’ARN total des trois groupes.
  4. Effectuer une transcription inverse avec 1 μg d’ARN total.
  5. À l’aide de l’ADNc, effectuez une PCR en temps réel, en utilisant GAPDH comme contrôle interne (Tableau 1).
  6. Valider la taille du produit amplicon par électrophorèse sur gel d’agarose (2% v / v).
    REMARQUE: Pour le profilage transcriptomique des cultures d’épidermosphère à l’aide de l’analyse de microréseaux du génome entier, isolez l’ARN total à partir de cultures de masse d’un seul donneur nhKc et le SD-NHKc correspondant du même donneur, en six répliques chacune.
  7. Évaluer la qualité de l’ARN à l’aide d’un bioanalyseur pour obtenir des nombres d’intégrité de l’ARN (RIN) allant d’au moins 9,0 à 9,1.
  8. Effectuer des expériences de microréseaux en amplifiant et en biotinylant des échantillons d’ARN total.
  9. Transcrire à l’envers 100 ng d’ARN total par échantillon en ds-ADNc à l’aide d’amorces aléatoires NNN contenant une séquence promotrice d’ARN polymérase T7.
  10. Ajouter l’ARN polymérase T7 aux échantillons d’ADNc pour amplifier l’ARN, puis copier l’ARN dans l’ADNcs-SS. Dégrader l’excès d’ARN en utilisant la RNase H.
  11. Fragmenter les molécules d’ADNSc et étiqueter avec de la biotine.
  12. Amplifier les échantillons marqués pendant 16 h à 45 °C.
  13. Hybridez les échantillons à l’aide d’un four d’hybridation et d’un kit de lavage et de teinture.
  14. Laver et colorer les matrices hybrides.
  15. Analysez les baies à l’aide d’un système et d’un poste de travail informatique.
  16. Une fois les analyses de matrice terminées, importez les fichiers d’intensité cellulaire de sonde (CEL) dans le logiciel de console d’expression et traitez-les au niveau du gène à l’aide d’un fichier de bibliothèque et d’un algorithme d’analyse multipuce robuste (RMA) pour générer des fichiers de cogénération.
  17. Après avoir confirmé la qualité des données dans Expression Console, importez des fichiers CHP contenant des signaux d’expression log2 pour chaque sonde dans un logiciel d’analyse de transcriptome afin d’analyser les réponses transcriptionnelles spécifiques au type de cellule à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance entre les sujets.

8. Évaluation de l’efficacité de la formation de colonies SD-NHKc

  1. Aspirer les milieux des plaques lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence. Lavez les cellules trois fois dans du PBS (4 °C) pendant 5 min chacune.
  2. Fixez les cellules avec 3 mL de méthanol à 100 % (4 °C) pendant 15 min. Laver trois fois dans PBS pendant 5 min chacun.
  3. Colorez les cellules dans 3 mL de Giemsa à 10% pendant 30 min. Laver trois fois dans PBS pendant 5 min chacun. Laissez les cellules sécher à l’air libre pendant la nuit.
  4. Analyser la formation des colonies le lendemain et quantifier le nombre de colonies obtenues

9. Déterminer les doublons de la population SD-NHKc

  1. Passage SD-NHKc et cultures monocouches 2D autologues correspondantes en aspirant de vieux milieux et en lavant les cellules dans 2mL PBS. Retirer le PBS et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules lavées. Incuber pendant 5 min ou jusqu’à ce que toutes les cellules se détachent complètement (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  2. Ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja à la plaque et transférer les cellules dans un tube de 15 mL.
  3. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min.
  4. Retirer le surnageant et resussuspender la pastille dans 12 mL de KSFM-scm.
  5. Ensemencez des cellules à faible densité 1-2 x10 4 NHKc dans des plats individuels de 10 cm et incubez pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  6. Plaques d’alimentation avec 8 mL KSMF-scm le lendemain. Nourrissez tous les 4 jours jusqu’à ce qu’au moins 25% de confluent, puis nourrissez tous les 2 jours.
  7. Cellules de passage en série 1:5 dans des plats de 60 cm jusqu’à épuisement de la capacité proliférative cellulaire. Quantifier la viabilité cellulaire par coloration au bleu trypan. Déterminer les doublons de population à chaque passage à l’aide de la formule : log(N/N0) / log2, où N représente le nombre total de cellules obtenu à chaque passage et N0 représente le nombre de cellules plaquées au début de l’expérience.

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Representative Results

Au cours du dosage de l’épidermosphère cutanée, les cultures de NHKc sont ensemenc dans des puits recouverts d’agarose d’une plaque de 96 puits(figure 1A). Les cellules formant des sphéroïdes devraient s’auto-agréger dans les 48h. La formation autonome de sphéroïdes peut être évaluée dès 24 heures à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé standard. la formation de l’épidermosphère cutanée et le modèle de test de re-placage de différentes phases de la régénération du tissu épidermique (Figure 1B). La figure 2 montre des images à haute résolution de diverses souches de NHKc dont la capacité de formation de sphéroïdes épidermiques est en culture 3D. Il est important d’examiner les cellules pour l’agrégation dense en forme de sphère, car c’est une caractéristique de la formation spontanée de sphéroïdes. Nous avons jugé nécessaire d’utiliser plus de 2 x 104 cellules pour assurer une bonne agrégation spontanée. L’agrégation cellulaire non sphérique, telle que celle observée dans les souches figure 2A,n’est pas considérée comme une formation adéquate de l’épidermosphère. Le placage de suspensions cellulaires non sphéroïdes dans une culture monocouche 2D entraîne rarement une croissance cellulaire NHKc viable. Cependant, le placage d’épidermosphères en culture 2D entraîne la prolifération de NHKc viables de petite taille(Figure 3). Les images d’épidermosphères et de SD-NHKc peuvent être visualisées et surveillées à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé standard. Il est important de maintenir ces cultures en dessous de 100% de confluence, car cela peut considérablement améliorer leur croissance et leur état de cellules souches en culture(Figure 3E-F). Le processus de formation de sphéroïdes épidermiques peut être suivi fonctionnellement au niveau de la cellule unique en transfectant les cellules avec un rapporteur fluorescent(Figure 4A-C). Dans des conditions optimales, la sous-population de kératinocytes principalement enrichie en cultures SD-NHKc sont des cellules Integrinα6hi/EGFRlo. Ces cellules représentent généralement environ 25 % de toutes les cultures de SD-NHKc et peuvent être facilement isolées par FACS(Figure 4D). Cependant, il est important d’établir des portes de zone de dispersion latérale avant (FSC-A) et de zone de dispersion latérale (SSC-A) pour exclure les doublets(Figure 4D). Une caractérisation plus poussée de cette sous-population de kératinocytes de type souche peut être réalisée par une analyse immunofluorescente de l’expression des marqueurs de cellules souches épidermiques, tels que la cytokératine basale 14 (K14) et la protéine tumorale 63 (P63)(Figure 4F; Tableau 2).

Figure 1
Figure 1: Culture d’épidermosphères NHKc en suspension 3D. (A) Représentation schématique du test de re-placage sphéroïde épidermique adapté de 11. (B) Images de contraste de phase représentatives de cultures NHKc, de sphéroïdes épidermiques et de SD-NHKc à chaque étape séquentielle du test de re-placage des sphéroïdes épidermiques. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Évaluation de la croissance del’épidermosphère cutanée. (A) Images de six souches NHKc sphéroïdes individuelles non formantes et (B) sphéroïdes en suspension 3D flottante. (C) Épidermosphères obtenues à l’aide de diverses quantités de NHKc. (D) Quantification de la taille moyenne de l’épidermosphère obtenue à l’aide de différentes quantités de NHKc dans une culture en suspension 3D flottante. Les barres indiquent l’écart-type. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Culture dérivée de sphéroïdes en croissance. (A) Imagerie par contraste de phase temporel de cultures monocouches SD-NHKc se propageant à partir d’une épidermosphère attachée 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h et (D) 96 h après replacage en culture plastique 2D. (E) Cultures SD-NHKc à 80 % de confluence et (F) 100 % de confluence 15 et 20 jours après la replaquage en culture plastique 2D, respectivement. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Caractérisation des sous-populations dérivées des sphéroïdes (ET). (A) Représentation schématique du test de suivi cellulaire 3D des épidermosphères in vitro tel que décrit par Woappi et al. 202012. (B) Épidermosphères exprimant l’EGFP 2 h et (C) 24 h après l’ensemencement en culture 3D. (D) Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des sous-populations SD-NHKc. Environ 1/4ème de toutes les cellules doivent être intégrines6hi/EGFRlo. (E) Les sous-populations d’Integrinα6hi/EGFRlo produisent des holoclones de kératinocytes. (F) Analyse immunofluorescente de l’expression des marqueurs des cellules souches épithéliales basales dans les cellules Integrinα6hi/EGFRlo . Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Séquence d’amorce (5'-3')
Nom du gène Introduction à l’avant Amorce inversée
ALDH1 GCACGCCAGACTTACCTGTC CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG
L’EGFR AGGCACGAGTAACAAGCTCAC ATGAGGACATAACCAGCCACC
GAPDH GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
K14 TGAGCCGCATTCTGAACGAG GATGACTGCGATCCAGAGGA
KI-67 ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA
KLF4 CCCACATGAAGCGACTTCCC CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA
TP63 GGACCAGCAGATTCAGAACGG AGGACACGTCGAAACTGTGC
β-Actine CATGTACGTTGCTATCCAGGC CTCCTTAATGTCACGCACGAT
ΔN TP63 ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC CAGGCATGGCACGGATAAC

Tableau 1. Décrit les séquences d’amorce de PCR utilisées pour la détection de certains gènes impliqués dans la plasticité des kératinocytes néonatals.

Culture Condition Apparence de contraste de phase Immunocoloration Analyse FACS Signature transcriptomique
Entretien homéostatique Monocouche 2D Cellules de petite taille < 30 μm K14, P63 ITGα6med/EGFPmed Entretien épidermique (K14, P63, IVL, K10)
Arrêt/inversion de différenciation Sphéroïde 3D Agrégat multicellulaire compact > 50 μm K14, P63, Ki-67 N/A Dédérenciation : NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67
Mobilité de la lignée de stress Fixation sphéroïde 3D à 2D Diffusion de cellules de petite taille (< 20 μm) à partir du bord sphéroïde K14, P63, Ki-67 ITGα6hi/EGFPmed Prolifération des cellules de la peau : K14, K16, K17, Ki-67
Restauration tissulaire Monocouche sphéroïde 3D à 2D Multiplication de cellules de petite taille < 20 μm K14, P63, IVL ITGα6hi/EGFPlo et ITGα6hi/EGFPhi Formation de l’épiderme: K14, IVL, FLG

Tableau 2. Stratégies de caractérisation phénotypique et moléculaire du test de replaquage des sphéroïdes épidermiques.

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Discussion

L’utilisation de systèmes de culture sphéroïde 3D a eu une grande utilité dans l’évaluation de la souche cellulaire. Il a été démontré que ces systèmes améliorent l’enrichissement des cellules souches tissulaires13, mais leur utilité pour l’étude des cellules souches épidermiques humaines a été peu explorée. Nous décrivons ici une stratégie d’enrichissement des cellules souches kératinocytes humaines à l’aide de techniques de culture 3D. Dans ce système, les NHKc sont cultivés sous forme de suspensions sphéroïdes multicellulaires auto-assemblées, composées de plusieurs sous-types de kératinocytes en suspension sur des lits d’agarose contenant KSFM-scm. La configuration de ce protocole est sensible au temps car la gélose polymérise rapidement à température ambiante. Le préchauffage des pipettes sérologiques, des embouts de micropipette et du tube de mélange gélose/cellule, ainsi que du milieu à 42 °C, peut réduire considérablement la polymérisation prématurée. Nous avons observé que le fait de placer la plaque de 96 puits à 4 °C peu de temps après avoir ajouté un mélange agar/média aux puits peut considérablement accélérer la polymérisation et garantir que le coussin de gélose est suffisamment ferme pour l’ensemencement ultérieur des cellules. Il est important de maintenir le niveau de la plaque à tout moment pendant le processus de polymérisation, car une mauvaise polymérisation du mélange agar/milieu entraînera l’ensemencement ou la croissance des cellules à l’intérieur de la gélose molle, annulant ainsi le dosage.

Également décrit dans ce protocole, nous présentons une stratégie de propagation d’épidermosphères en culture monocouche 2D afin de générer des cellules dérivées de sphéroïdes de type souche. Le test de re-placage de sphéroïde épidermique enrichit pour une sous-population semblable à des cellules souches d’intégrines6hi/EGFRlo kératinocytes. Ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la reconstruction épidermique, le psoriasis ou la néoplasie cellulaire11,12,14. Les kératinocytes Integrinα6hi/EGFRlo peuvent également être facilement isolés par FACS et caractérisés par une coloration immunofluorescente. Lors de la réalisation de telles expériences, nous avons trouvé utile d’utiliser des cellules monocouches 2D autologues non triées comme témoins., Les lignées cellulaires SCC de la peau sont une bonne alternative si celles-ci ne sont pas disponibles.

En résumé, ce rapport démontre que le replaçage des sphéroïdes épidermiques humains modélise la plasticité régénérative des kératinocytes in vitro,car il capture chacune des quatre phases de la régénération: maintien homéostatique, inversion de la différenciation, mobilité de la lignée de stress et restauration des tissus. Cependant, l’une des limites de l’auto-assemblage de sphéroïdes à base d’agar est que toutes les taches NHKc ne sont pas capables de former spontanément des sphéroïdes. La méthode de la goutte suspendue15 est une bonne stratégie alternative pour surmonter ce défi et forcer la formation de sphéroïdes multicellulaires. Ce test peut également être multiplexé avec des cellules musculaires, stromales ou immunitaires pour mieux comprendre la contribution de diverses populations cellulaires à la régénération épidermique. il serait intéressant d’explorer si l’ajout de Matrigel dans la gélose pourrait améliorer la survie et la puissance de l’épidermosphère.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas de relations financières à divulguer.

Acknowledgments

L’Installation de ressources en instrumentation (IRF) de l’École de médecine de l’Université de S.C. a donné accès à de l’équipement d’imagerie et de tri cellulaire et à une assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention 1R21CA201853. Le MCF et l’IRF reçoivent un soutien partiel de la subvention P20GM103499 du NIH, SC INBRE. Le MCF reçoit également le soutien de la subvention P20GM109091 des NIH. Yvon Woappi a été soutenu en partie par les subventions 2R25GM066526-06A1 (PREP) et R25GM076277 (IMSD) des NIH, et par une bourse du grace Jordan McFadden Professors Program à l’UofSC. Geraldine Ezeka et Justin Vercellino ont été soutenus par les subventions 2R25GM066526-10A1 (PREP) des NIH à l’Université de La CSI. Sean M. Bloos a été soutenu par le Magellan Scholar Award 2016 à l’UofSC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Affymetrix platform Affymetrix For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file Affymetrix Process
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466 analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer Beckman For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
Cytokeratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253 1:200 dilution
Dispase Sigma-Aldrich D4818 For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6 Abcam ab30496 For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640 Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) Cell Signaling Technology 8910 For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Cell Signaling Technology 8916 For cell media
Human Insulin Millipore Sigma 9011-M For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Bio-Rad 1708880 Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Used for RT-qPCR
KSFM ThermoFisher Scientific 17005041 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm ThermoFisher Scientific 17005042 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium Sigma-Aldrich M7403 MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS Stellar Scientific NST230111 For immunostaining
P63 Thermo Scientific 703809 1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) BD Pharmingen 555997 For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector Addgene 20672 For transfection
Promega TransFast kit Promega E2431 For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit Qiagen For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 09-740-63D For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope Zeiss Use with Axiovision Rel. 4.5 software

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References

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

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Biologie du développement numéro 167 Anoikis plasticité cellulaire épithélium cellules souches épidermiques épidermosphère kératinocytes humains sphéroïdes culture 3D cicatrisation des plaies
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Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity. J. Vis. Exp. (167), e62182, doi:10.3791/62182 (2021).

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