Summary
ここでは、3D懸濁液培養における表皮スフェロイドの系統的培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な上皮組織タイプで使用し、いくつかのヒト疾患および状態のモデリングのための幅広い用途を有する。
Abstract
上皮調節不全は、慢性創傷、炎症、およびすべてのヒト癌の80%以上を含む様々なヒトの状態および病気のためのノードである。ライニング組織として、皮膚上皮はしばしば損傷を受け、損傷した組織を修復するために必要な細胞可塑性を獲得することによって進化的に適応している。長年にわたり、in vitroおよびex vivo細胞ベースのモデルを用いて上皮可塑性を研究するためにいくつかの努力がなされてきた。しかし、これらの取り組みは、上皮細胞可塑性の様々な段階を再現する能力が限られている。ここでは、原発性新生児ヒトケラチノサイトから3D表皮スフェロイドおよび表皮スフェロイド由来細胞を生成するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、ケラチノサイト生成可塑性の異なる段階を機能的にモデル化する表皮スフェロイド培養の能力を概説し、表皮スフェロイド再めっきが、integrinα6hi/EGFRlo ケラチノサイト亜集団の不均種正常ヒトケラチノサイト(NHKc)培養を増強できることを示している。我々の報告書は、皮膚角化細胞の可塑性および表皮再生の研究のための高スループットシステムの開発および維持について述べている。
Introduction
哺乳類の階層化上皮は、すべての生活システムにおいて最も複雑な上皮アーキテクチャであり、ほとんどの場合、損傷および損傷を受ける。保護組織として、階層化上皮は複雑で効果的な組織損傷応答を生成するように進化した。損傷を受けた細胞は、系統可塑性プログラムを有効にする必要があり、これを使用して損傷した部位に移行し、修復1、2、3を実行できるようにする必要があります。この多面的な応答は、よく理解されていないいくつかの連続したステップで発生します。
上皮再生の複雑なプロセスを研究する上の主要な障害は、細胞再生の定義された段階で動的な細胞活動をキャプチャすることができる高スループットモデルシステムの枯渇にあります。in vivoマウスモデルは創傷治癒に関する関連する洞察を提供し、人間の再生プロセスを最も密接に再現しますが、その開発には手間のかかる労力と大幅なコストが必要であり、スループット能力が制限されます。したがって、高スループットスケールでヒト上皮組織再生の機能調査を可能にするシステムを確立する上で重要なニーズが存在する。
近年、スケーラビリティの課題に対応するために、いくつかの試みが行われています。これは、インビボ再生コンテキストを密接に模倣する革新的なin vitroおよびex vivo細胞ベースのモデルの大きな拡大を通じて見られます。これには、オルガンオンチップ4、スフェロイド5、オルガノイド6、オルガノイド文化7の進歩が含まれます。これらの3D細胞ベースのシステムは、それぞれ独自の利点を提供し、独特の実験的限界を提示します。現在までに、スフェロイド培養は、最も費用対効果が高く、広く使用されている3D細胞培養モデルです。また、いくつかの報告では、スフェロイド培養物を皮膚幹細胞の特性を研究するために使用できることが示されているが、これらの研究は主に動物組織8、9、または皮膚線維芽細胞10で行われ、ヒト表皮スフェロイド培養物の再生特性を徹底的に特徴付ける報告はほとんどない。本プロトコルでは、通常ヒトケラチノサイト(NHKc)由来の表皮スフェロイド培養物の機能開発、培養、維持について詳述する。我々は、このシステムの有用性を同様に、表皮再生およびケラチノサイト幹細胞可塑性の逐次相を試験的にモデル化する。
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Protocol
皮膚標本の採取と取り扱い、ヒトケラチノサイトの分離に関するプロトコルは、サウスカロライナ大学(UofSC)IRBによってレビューされ、「ヒト被験者を含まない研究」に分類され、包皮標本は定期的な外科的処置(新生児の男の子の割礼)の間に作製された外科的廃棄であり、識別情報を完全に欠いていた。この議定書は、UofSCバイオセーフティ委員会によって定期的に審査および承認され、すべての研究室職員が実験室のバイオセーフティトレーニングを受けました。すべての手続きは、UofSCの安全と倫理基準に合わせて行われました。
1. 新生児包皮組織からのヒトケラチノサイトの分離と培養
- KSFM培地500mLに0.1M HEPESバッファーを加えて洗浄媒体を調製し、7.2のpHに調整します。500 mL真空フィルター(0.22 μmの細孔サイズ)で、培地を殺菌します。MCDB 153 LB基底媒体はまたKSFMの代わりに別の洗浄解決として使用することができる。
- 層流フードで、50 mLの円錐管で5 mLの洗浄媒体で新生児包皮を洗浄します。2 回繰り返します。
- 洗浄された包皮を滅菌ペトリ皿に移す。メスと鉗子を使用して、脂肪を削り取り、真皮層から緩い結合組織を削り取ります。50 mLの円錐管に5 mLの洗浄媒体を使用して包皮を再洗浄します。
- 包皮表皮側を、洗浄媒体(50 U/mL)で希釈した2 mLのジスパーゼ酵素を含む6ウェルプレートに上に置きます。
- プレートをインキュベーターに4時間移します(37°C、5%CO2、湿度95%)。
- 包皮をインキュベーターから取り出し、滅菌条件下でペトリ皿に移します。細かい先端鉗子を使用して、表皮を真皮層から分離する。
- 0.25%トリプシン-EDTAの2 mLを含む15 mL円錐状のチューブに表皮を入れる。5 mL 血清学的ピペレットを使用して、浮動表皮を機械的に粉砕します。37°Cで15分間インキュベートし、5分ごとに5 sの周期的なボルテックスを行います。
- インキュベーション後、2 mLの大豆トリプシン阻害剤を加え、ピペット処理で混ぜてトリプシンを中和します。
- 遠心分離機細胞懸濁液は450 x gで2分間、250 x gで8分間の間に。
- 浮遊した破片を鉗子で取り除き、細胞ペレットを外さないよう注意してください。細胞ペレットから慎重に吸引上清上清。
- 10cm皿に完全なKSFM-scm培地とプレートの12 mLでペレットを再懸濁します。一晩(37°C、5%CO2、湿度95%)をインキュベートします。
- 翌日、吸引ピペットを使用して培地を取り出し、12 mL完全なKSFM-scmに交換します。
- 正常なヒトケラチノサイト(NHKc)培養物の最適な増殖を維持するために、10日目に細胞1:5を通過し、細胞が80%以上の合流性を達成するのを防ぐ。
2. 皮膚表皮培養物の生成
- 50 mLガラス瓶に2.5gのアガロースを50mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の50 mLに加えて調製します。液体サイクルの下でオートクレーブボトル。室温まで冷まします。
- プレートを調製するには、アガロース溶液を含む冷却ガラスボトルを、200 mL脱イオン水(dH2 O)で満たされた1Lプラスチックビーカーに入れます。研究用マイクロ波でアガロース混合物を最大2分間溶融させ、ボトルを左右に軽く傾けて60sごとに寒天を混合します。
注意:電子レンジで寒天を溶かすと、フラスコ容器が非常に熱くなり、圧力が蓄積します。30s毎に圧力の蓄積を解放する。怪我を防ぐために適切な保護具を着用してください。 - 溶かした5%アガロースの3 mLを42°Cに予熱した12 mL KSFM-scmに加え、1%アガロース(wt/vol)の最終濃度を得た。
任意:セロロジカルピペットとピペットチップを事前に温め、柔らかい寒天の早期重合を防ぎます。 - マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルの丸底プレートの個々のウェルに1%寒天のピペット200 μLを素早く混合します(図1A)。無菌環境下でプレートを25°Cで4時間放置し、アガロースを完全に重合させます。
注:実験はここで停止し、翌日に続けることができます。重合アガロースプレートは、パラフィルムラップで密封すると、37°Cから24時間まで、または4°Cで最大48時間維持することができます。使用前に少なくとも1時間加湿インキュベーターで37°Cに温めたプレート。 - PBSの2mLで媒体および洗浄細胞を吸引することによってNHKcを形成するパッセージ。PBSを吸引し、洗浄した細胞に0.25%トリプシン-EDTAの2 mLを加える。37°Cで5分間、または全ての細胞が完全に剥離するまでインキュベートする。2 mLの大豆トリプシン阻害剤を加えてプレートから15 mLチューブに細胞を洗浄します。250 x g で 5 分間の遠心分離機。
- PBSの1 mLでペレットを再懸濁します。トリパンブルー染色とヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞生存率を定量化します。
- アリコート2 x 104 NHKcはKSFM-scmの100 μLで、前に用意した96ウェルのラウンドボトムプレートの個々のウェルにシードします。インキュベートプレート(37°C、5%CO2、湿度95%)。
- 逆相対照顕微鏡を使用して、表皮形成のためによく播種を分析します。
注:正常ヒト角化細胞からのヒト表皮圏は、細胞生存率が大幅に低下したものの、最大96時間の3D懸濁液培養において生存可能であり続けることができる(図2)。
表皮スフェロイド再めっきアッセイ
- 3D表皮圏形成後24〜48時間、6cmの皿に4mLのプリウォームKSFM-scmを加える。広いボア1 mL ピペットチップを使用して、単一のスフェロイドをプレートに移し、分解しないようにします。または、滅菌カミソリブレードを使用して1mLピペットチップを広げ、先端を切断します。
- プレートを一晩(37°C、5%CO2、湿度95%)インキュベートします。
- プレートの底部に付着するスフェロイドを播種して分析し、反転位相コントラスト顕微鏡を用いて細胞を伝播する観察を行う(図3)。プレート内の培地2 mLを静かに取り除き、2 mLの新鮮なKSFM-scm培地をプレートにゆっくりと添加することで、96時間ごとに細胞を供給します。
- 70~80%の合流度に達し、選択したアッセイを継続すると、パッセージススフェロイド由来(SD)NHKc。SD-NHKc を頻繁にモニターして、細胞が培養で完全な合流に達するのを防ぎます。
- 表皮スフェロイド再めっきアッセイモデルケラチノサイト媒介性創傷修復は、表皮再生可塑性の主要な連続相をそれぞれ捉えることによって、a)ホメオスタティックメンテナンス、b)分化停止/逆転c)ストレス系統移動性、およびd)組織修復(図1B;表 2.このアッセイは、organotypic raft培養のための細胞集団を生成したり、前作11,12で示したようにHPV媒介性新生物をモデル化するためにも使用できる。
4.3D蛍光細胞追跡
- 6cmの皿の中で、トランスフェクトスフェロイド形成2D単層NHKc培養は、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子を運ぶpMSCV-IRES-EGFPプラスミドベクターの1μgを有する。インキュベートプレートは一晩(37°C、5%CO2、湿度95%)顕微鏡(図4A)。
注:トランスフェクションは、無血清抗生物質フリーの状態で完了することが重要です。 - トランスフェクションミックスを除去せずに、2 mLのプリウォームKSFM-scmを細胞に加える。インキュベートプレート(37°C、5%CO2、湿度95%)。
- 3 mLのプレウォームKSFM-scmを有するプレートおよびフィードセルからすべてのトランスフェクション媒体を吸引し、蛍光顕微鏡のFITCチャネル下でEGFP発現細胞の存在を評価します。
- パッシンおよびシード2 x 104 EGFPトランスフェクト細胞は、以前に調製された96ウェルラウンドボトムプレートの個々の井戸に入った。インキュベートプレート(37°C、5%CO2、湿度95%)。蛍光顕微鏡のFITCチャネル下でのEGFPポスススフェロイド細胞の動きを可視化および監視する(図4B-C)。
- めっき後24時間、6cmの皿に3mLのプリウォームKSFM-scmを加える。広いボア1 mL ピペットチップを使用して、単一のスフェロイドをプレートに移し、分解しないようにします。インキュベートプレート(37°C、5%CO2、湿度95%)。
- 蛍光顕微鏡を用いてSD-NHKcEGFP を伝播する観察と分析を行います。プレート内の培地を2mL軽く取り出し、2mLの新鮮なKSFM-scm培地をプレートにゆっくりと添加して、96時間ごとに細胞を供給します。
- FACSの絶縁または選択のアッセイのためのSD-NHKCEGFP を収穫する。
5. FACS によるスフェロイド由来(SD)サブ集団の特性評価
- PBSの2mLで古い培地および洗浄細胞を吸引することにより、SD-NHKc及びそれに対応する自家用2D単層培養物を含む。PBSを取り除き、洗浄した細胞に0.25%トリプシン-EDTAの2 mLを加えます。37°Cで5分間、または全ての細胞が完全に剥離するまでインキュベートします。
- 2 mLの大豆トリプシン阻害剤を添加し、細胞を15 mLチューブに入れ、細胞をプレートに移します。250 x g で 5 分間の遠心分離機。
- PBS 1 mLでペレットを再懸濁します。トリパンブルーとヘモサイトメーターの自動細胞カウンターを使用して細胞生存率を定量化します。
- アリコート100 μLは、1.5 mLマイクロ遠心チューブに0.1-4 x 106 NHKc細胞を含む。薄層フード内の明るいライトをオフにすることによって作成された暗い環境で氷の上にチューブを配置します。
- FITC共役抗インテグリンα6の2μLと2μLのPE共役抗EGFRをチューブに加えて、1:50希釈を達成します。未染色制御として機能する抗体を添加しないチューブを準備します。氷の上のチューブを暗くするか、4°Cで30分間インキュベートします。ビーズまたは皮膚SCCラインの使用は、皮膚SCC細胞がインテグリンα6およびEGFRの上昇レベルを発現するので、肯定的なコントロールとして役立つことができる。
- 適切なレーザーを含む選択したフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリー分析を行います。
- 負と正のコントロールを使用して、ゲートを確立します。インテグリンα6ハイ/EGFRlo細胞のサブ集団をソートします。これらは表皮幹細胞画分です。インテグリンα6ハイ/EGFRhi細胞は増殖前駆細胞画である。インテグリンα6lo/EGFRハイセルは、コミット前駆細胞分画である(図4D)。FACSチューブの並べ替えには、氷冷KSFM-scmの少なくとも1 mLが含まれている必要があります。
- PBS内の細胞の10倍の体積を含む15 mL円錐状チューブに各並べ替えチューブの含有量を移すことによって、細胞亜集団の増殖能力を試験する。注:ケラチノサイトはしばしばそこに付着することができるように、ソートFACSチューブの壁を数回ピペットすることによってリムに取り付けられたすべての細胞を除去することが重要です。
- 遠心分離機 250 x gで 5 分間の遠心分離管。上清を取り除き、KSFM-scmの12 mLでペレットを再懸濁します。
- 翌日、プレートにメディアを取り出し、8 mLの予温KSFM-scmを加え、37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。3日ごとに12 mL培地を持つ細胞を70~80%コンフルエントまで再供給する(図4E)。
基礎幹細胞マーカーの表皮球の蛍光と染色
- ポリリジンでコーティングされたカバーリップに表皮球を移す。SD-NHKcが75%コンフルエントまで伝播することを許可します。
- 細胞をPBS(4°C)で2回洗浄し、それぞれ5分間洗浄します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を室温で20分間固定します。
- 1%グリシンで0.5%トリトンX-100で細胞を透過させます。0.5%BSAと5%のヤギの血清を室温で30分間使用してブロックします。
- P63(1:200)およびサイトケラチン14(1:200)に対する抗体を含むインキュベートサンプルを、4°Cで一晩ブロッキング溶液に入れます。
- Tween 20(PBST)を含むPBS(4°C)で3回洗浄し、FITCおよびAlexa 568-共役二次抗体(1:1000希釈)でインキュベーションを行います。
- 細胞を取り付ける前に4'、6-ジミディミノ-2-フェニリンドール(DAPI)(1:5000希釈)を有する核を染色する。
- FITCとPEレーザーラインを用いた蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する(図4F)。
表皮圏培養の転写解析
- 低通路NHKc培養液の三重プレートを設定して、RNAを単層、スフェロイド、および同じ自家細胞株由来のスフェロイド由来培養物から分離することができる。
- 1.5 mLマイクロ遠心チューブに3-5対応の表皮をプールします。自家のSD-NHKcと2D単層培養を別途収穫する。
- 3つのグループすべてから全RNAを分離します。
- 総RNAの1 μgで逆転写を行います。
- cDNAを用いて、GAPDHを内部制御として使用してリアルタイムPCRを行う(表1)。
- アガロースゲル電気泳動(2%v/v)によりアンプリコン製品サイズを検証します。
注:全ゲノムマイクロアレイ解析を用いた表皮圏培養物のトランスクリプトーム全体プロファイリングでは、単一のNHKcドナーの大量培養から全RNAを単一のドナーから分離し、対応するSD-NHKcをそれぞれ6回ずつ複製します。 - バイオアナライザを使用してRNAの品質を評価し、少なくとも9.0から9.1までの範囲のRNAインテグリティ・ナンバー(RIN)を達成します。
- RNAサンプルの全量を増幅し、ビオチン化することによりマイクロアレイ実験を行います。
- T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含むNNNランダムプライマーを用いて、サンプル当たりの全RNAの100ngをds-cDNAに逆転写する。
- T7 RNAポリメラーゼをcDNAサンプルに加え、RNAを増幅し、RNAをss-cDNAにコピーします。RNase Hを用いて過剰なRNAを分解する。
- sscDNA分子をフラグメント化し、ビオチンで標識する。
- 標識サンプルを45°Cで16時間増幅する。
- ハイブリダイゼーションオーブンと洗浄と汚れキットを使用してサンプルをハイブリダイズします。
- ハイブリダイズされたアレイを洗浄し、染色します。
- システムとコンピュータのワークステーションを使用してアレイをスキャンします。
- 配列スキャンの完了後、プローブ細胞強度(CEL)ファイルを発現コンソールソフトウェアにインポートし、ライブラリファイルと堅牢なマルチチップ分析(RMA)アルゴリズムを使用してCHPファイルを生成する遺伝子レベルで処理します。
- Expression Consoleでデータ品質を確認した後、各プローブのlog2発現信号を含むCHPファイルをトランスクリプトーム分析ソフトウェアにインポートし、細胞タイプ特異的転写応答を被験者間の分散分析を用いて分析します。
8. SD-NHKcコロニー形成効率の評価
- 細胞が70-80%の合流に達したときのプレートからの吸引媒体。細胞をPBS(4°C)で3回洗浄し、それぞれ5分間洗浄します。
- 100%メタノール(4°C)の3 mLで細胞を15分間固定します。PBSで3回、それぞれ5分間洗います。
- 30分間10%ギームサの3mLで細胞を染色する。PBSで3回、それぞれ5分間洗います。細胞が一晩空気乾燥することを可能にする。
- 翌日のコロニー形成を分析し、得られたコロニー数を定量化する
9. SD-NHKcの人口倍増を決定する
- 2mL PBSで古い培地や洗浄細胞を吸引することにより、SD-NHKcとそれに対応する自家用2D単層培養液を用いた。PBSを取り除き、洗浄した細胞に2mL 0.25%トリプシン-EDTAを加えます。5分間、またはすべての細胞が完全に剥離するまでインキュベート(37°C、5%CO2、湿度95%)。
- 2 mLの大豆トリプシン阻害剤を添加し、細胞を15 mLチューブに入れ、細胞をプレートに移します。
- 250 x g で 5 分間の遠心分離機。
- 上清を取り除き、KSFM-scmの12 mLでペレットを再懸濁します。
- 低密度1-2 x 104 NHKcの種子細胞を個々の10cm皿に入れ、一晩(37°C、5%CO2、湿度95%)インキュベートします。
- 翌日8mL KSMF-scmの送りプレート。少なくとも25%のコンフルエントまで4日ごとに給餌し、2日ごとに給餌します。
- 細胞増殖能力が尽きるまで60cmの皿の連続的な通過細胞1:5。トリパンブルー染色による細胞生存率の定量化。式を用いて各通路での母集団の倍増を決定する: log(N/N0) / log2, ここで N は各通路で得られた総細胞数を表し、 N0 は実験の開始時にメッキされた細胞数を表す。
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Representative Results
皮膚表皮球アッセイの間、NHKc培養物は96ウェルプレートのアガロースコーティングされたウェルに播種される(図1A)。球状形成細胞は48時間以内に自己凝集するべきである。自律回転楕円体形成は、標準の反転位相コントラスト顕微鏡を用いて、早くも24時間評価することができる。表皮組織形成および再めっきアッセイは、表皮組織再生の様々な相をモデル化する(図1B)。図2は、3D培養における表皮スフェロイド形成能についてアッセイした各種NHKc株の高解像度画像を示す。これは自発的な回転楕円体形成の特徴であるため、細胞の密な球体凝集を調べることが重要です。我々は、適切な自発的な凝集を確実にするために2 x 104以上の細胞を使用する必要があることがわかった。株2Aに見られるような非球形細胞凝集は、十分な表皮形成とは考えられない。2D単層培養で非スフェロイド形成細胞懸濁液をめっきすると、生じるNHKc細胞増殖が生じることはめったにありません。しかし、2D培養における表皮圏のめっきは、小型の生き生きとNHKcの増殖をもたらす(図3)。表皮圏とSD-NHKcの画像は、標準的な反転位位の位相対照顕微鏡を使用して、表示および監視することができます。これらの培養物は、培養における増殖や幹細胞状態をかなり損なう可能性があるため、これらの培養物を100%以下に維持することが重要である(図3E-F)。表皮スフェロイド形成の過程は、蛍光レポーターと細胞をトランスフェクトすることによって、単一細胞レベルで機能的に追跡することができる(図4A-C)。最適な条件下では、主にSD-NHKc培養で富化したケラチノサイト亜集団は、Integrinα6 hi/EGFRlo細胞である。これらの細胞は、一般に、すべてのSD-NHKc培養物の約25%を占めており、FACSによって容易に単離することができる(図4D)。ただし、前方側散乱領域(FSC-A)およびサイドスキャッタエリア(SSC-A)ゲートを確立して、ダブレットを除外することが重要です(図4D)。この茎様角化細胞のさらなる特徴付けは、基底細胞ケラチン14(K14)や腫瘍タンパク質63(P63)などの表皮幹細胞マーカー発現の免疫蛍光染色解析によって達成できる(図4F;表 2.
図1:3D懸濁液におけるNHKc表皮圏の培養(A)11から適応した表皮球形再めっきアッセイの模式的表現。 (B)表皮球形再めっきアッセイの各逐次工程におけるNHKc培養物、表皮スフェロイド、およびSD-NHKcの代表的な位相コントラスト画像。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:皮膚表皮の成長を評価する(A) 浮遊3D懸濁液中の6個のスフェロイド非形成及び(B)スフェロイド形成NHKc株の画像。(C)浮動3D懸濁液培養中に得られた異なる量のNHKcを用いて得られた各種NHKc(D)の平均表皮サイズの定量化を用いて得られた表皮圏。バーは標準偏差を示します。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:成長するスフェロイド由来培養物(A)2D プラスチック培養における再めっき後に、SD-NHKc単層培養物のSD-NHKc単層培養物の位相対画像化(B)48時間、(C)72時間、及び(D)96時間。(E)SD-NHKc培養物は、それぞれ2Dプラスチック培養で再めっきしてから15日及び20日後に80%合流、(F)100%合流度で培養する。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:スフェロイド由来(SD)サブ集団の特徴付け(A) Woappi et al. 202012で記述されたインビトロにおける表皮圏の3D細胞追跡アッセイの概略表現。(B)3D培養で播種した後のEGFP発現表皮球2時間及び(C)24時間。(D) SD-NHKc亜集団の蛍光活性化細胞分類(FACS)全ての細胞の約1/4分の1は、integrinα6hi/EGFRloであるべきである。(E) インテグリンα6ハイ/EGFRlo亜集団はケラチノサイトホロクローンを産生する。(F) Integrinα6 hi/EGFRlo細胞における基底上皮幹細胞マーカー発現の免疫蛍光染色解析スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| プライマーシーケンス(5'-3') | ||
| 遺伝子名 | フォワードプライマー | リバースプライマー |
| アルド1 | GCACGCCACTタッククト | CCTCCTCAGTTGCAGGAAGAGAG |
| エグフル | アカッカガガタカグカッカ | アガガカタアカマクスク |
| ギャップド | ガトCCCカサア | グクトキャットキャット |
| K14 | タグックチャットクトガッカガグ | ガッガクトGCGCッカガ |
| KI-67 | アクトッヘッツタクトカアグ | カガマクラテットアククトGTGtTGGGGA |
| KLF4 | カタトガグCGACTTCCC | カグチャガトクトガー |
| TP63 | ガッカガガガタットカガックッグ | アガカックグクCGAアクトグクGC |
| βアクチン | キャットタッグトゥットGCC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | アクトクトクトタッタッヒッガガーアカートク | カッカットッカッガガート |
表 1.新生児角化細胞の可塑性に関与する選択遺伝子の検出に用いられるPCRプライマー配列を概説する。
| 文化条件 | 位相コントラストの外観 | 免疫染色 | FACS 分析 | トランスクリプトームシグネチャ | |
| ホメオスタティックメンテナンス | 2D単層 | 30 μm<小さい細胞 | K14, P63 | ITGα6メド/EGFPメド | 表皮維持(K14、P63、IVL、K10) |
| 差別化停止/反転 | 3Dスフェロイド | コンパクトな多細胞集合体>50μm | K14, P63, 木-67 | 該当する | 分化解除:ナノグ、SOX2、OCT4、KLF4、K14、P63、Ki-67 |
| ストレスリネージュモビリティ | 3D-2Dスフェロイドアタッチメント | スフェロイドエッジから小サイズセル(<20μm)を拡散 | K14, P63, 木-67 | ITGα6こんにちは/EGFPメド | 皮膚細胞増殖:K14、K16、K17、Ki-67 |
| 組織修復 | 3D-2Dスフェロイド単層 | 20μm<小さな細胞を伝播 | K14, P63, IVL | ITGα6ハイ/EGFPロ と ITGα6こんにちは/EGFPこんにちは | 表皮の形成:K14、IVL、FLG |
表 2.表皮スフェロイド再めっきアッセイの表現型および分子特性化の戦略
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Discussion
3Dスフェロイド培養システムの使用は、細胞幹細胞性を評価する上で幅広い有用性を有している。これらのシステムは、組織幹細胞13の濃縮を増強することが実証されているが、ヒト表皮幹細胞の研究に有用性は限られたものであった。ここでは、3D培養技術を用いてヒトケラチノサイト幹細胞を濃縮する戦略について述べています。このシステムでは、NHKcは、KSFM-scmを含むアガロースベッドの上に懸濁されたいくつかのケラチノサイトサブタイプで構成される自己集合型多細胞スフェロイド懸濁液として栽培される。このプロトコルのセットアップは、寒天が室温で急速に重合するので時間に敏感です。予熱血清ピペット、マイクロピペットチップ、寒天/細胞混合チューブ、および42°Cの培地は、早期重合を劇的に低減することができます。我々は、寒天/培地ミックスを井戸に添加した直後に96ウェルプレートを4°Cに置くことで、重合を大幅にスピードアップし、その後の細胞の播種に対して寒天クッションが十分に固くなるのを観察した。重合プロセス中は常にプレート)レベルを維持することが重要であり、寒天/培地ミックスの重合不良は細胞の播種または軟寒天の内部で増殖し、アッセイを無効にする結果となる。
また、このプロトコルで概説した、我々は、ステム状のスフェロイド由来細胞を生成する2D単層培養における表皮層を伝播するための戦略を提示する。表皮スフェロイド再めっきアッセイは、インテグリンα6 hi/EGFRロ角化細胞の幹細胞様亜集団に富む。これらの細胞は、表皮再建、乾癬、または細胞新生物11、12、14を研究するために使用することができる。インテグリンα6ハイ/EGFRロ角化細胞はまた、FACSによって容易に単離され、免疫蛍光染色によって特徴付けられる。このような実験を行う際に、我々は、コントロールとして並べ替えられていない自家2D単層細胞を使用することが有用であることがわかった。皮膚SCC細胞株は、これらが利用できない場合に良い選択肢である。
要約すると、ヒト表皮スフェロイド再めっきモデルは、恒常性維持、分化逆転、ストレス系統移動性、組織修復の4つの段階を捉え、 生体外でケラチノサイト再生可塑性をモデル化することを示している。しかし、寒天ベースのスフェロイド自己集合の1つの制限は、すべてのNHKc染色が自発的にスフェロイドを形成することができるわけではないということです。吊り落とし法15 は、この課題を克服し、多細胞スフェロイド形成を誘導する良い代替戦略である。このアッセイはまた、筋肉、間質、または免疫細胞を多重化して、表皮再生に対する様々な細胞集団の寄与に関するさらなる洞察を得ることができる。寒天へのマトリゲルの添加が表皮圏の生存と効力を高めることができるかどうかを探求することは興味深いでしょう。
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Disclosures
著者は開示する財務上の関係を持っていません。
Acknowledgments
UofSC医学部計装資源施設(IRF)は、イメージングおよび細胞選別装置へのアクセスと技術支援を提供しました。この作業は、グラント 1R21CA201853 によって部分的にサポートされました。MCF および IRF は、NIH グラント P20GM103499 SC INBRE から部分的なサポートを受けます。MCF は、NIH グラント P20GM109091 からのサポートも受けています。イヴォン・ウォッピは、NIH助成金2R25GM066526-06A1(PREP)とR25GM076277(IMSD)、UofSCのグレース・ジョーダン・マクファデン教授プログラムによるフェローシップによって部分的にサポートされました。ジェラルディン・エゼカとジャスティン・ヴェルチェリーノは、UofSCでNIH助成金2R25GM066526-10A1(PREP)によってサポートされました。ショーン・M・ブロースは、UofSCで2016マゼラン学者賞を受賞しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
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