Summary
Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.
Abstract
Epitel düzensizliği, kronik yaralama, iltihaplanma ve tüm insan kanserlerinin% 80'inden fazlası dahil olmak üzere çeşitli insan koşulları ve rahatsızlıkları için bir düğümdür. Bir astar dokusu olarak, cilt epitel genellikle yaralanmaya maruz kalır ve hasarlı dokuyu onarmak için gerekli hücresel plastisiteyi elde ederek evrimsel olarak adapte olur. Yıllar boyunca, in vitro ve ex vivo hücre bazlı modeller kullanarak epitel plastisitesini incelemek için çeşitli çabalar sarf edilmiştir. Bununla birlikte, bu çabalar epitel hücre plastisitesinin çeşitli aşamalarını yeniden yakalama kapasitelerinde sınırlı olmuştur. Burada primer yenidoğan insan keratinositlerinden 3D epidermal sferoidler ve epidermal sferoid türevli hücreler üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, epidermal sferoid kültürlerinin keratinosit üretici plastisitenin farklı aşamalarını işlevsel olarak modelleme kapasitesini özetlemektedir ve epidermal küresel re-kaplamanın integrinα6hi/EGFRlo keratinosit subpopulasyonları için heterojen normal insan keratinosit (NHKc) kültürlerini gelişmiş kök benzeri özelliklerle zenginleştirebileceğini göstermektedir. Raporumuzda cilt keratinosit plastisitesi ve epidermal rejenerasyon çalışması için yüksek verimli bir sistemin geliştirilmesi ve sürdürülmesi açıklanmaktadır.
Introduction
Memeli tabakalı epitel, tüm canlı sistemlerde en karmaşık epitel mimarisidir ve en sık hasar ve yaralanmaya maruz kalır. Koruyucu bir doku olarak, tabakalı epitel karmaşık ve etkili bir doku hasarı tepkisi oluşturmak için evrimleşmiştir. Yaralanma üzerine, bu hücreler, yaralı bölgeye göç etmelerini ve onarım1,2,3'ü gerçekleştirmelerini sağlayan soy plastisite programlarını etkinleştirmelidir. Bu çok yönlü yanıt, yedenmiş olarak anlaşılan birkaç sıralı adımda gerçekleşir.
Epitel rejenerasyonunun karmaşık sürecinin incelenmesinde büyük bir engel, hücre yenilenmesinin tanımlanmış aşamalarında dinamik hücresel aktiviteleri yakalayabilen yüksek verimli model sistemlerinin değerinde yatmaktadır. In vivo fare modelleri yara iyileşmesi hakkında ilgili içgörüler sunarken ve insan rejeneratif sürecini en yakından özetlese de, gelişimleri zahmetli çabalar ve önemli maliyet gerektirir ve üretim kapasitelerini sınırlar. Bu nedenle, insan epitel dokusu yenilenmesinin yüksek verim ölçeğinde fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlayan sistemlerin kurulması için kritik bir ihtiyaç vardır.
Son yıllarda ölçeklenebilirlik zorluğunun karşılanması için çeşitli girişimlerde bulunulmuştur. Bu, in vivo rejeneratif bağlamı yakından taklit eden yenilikçi in vitro ve ex vivo hücre tabanlı modellerin büyük genişlemesi ile görülür. Bu, çip üzerindekiorgan-on-chip 4, küresel5, organoid6ve organotipik kültürlerdeki gelişmeleri içerir7. Bu 3D hücre tabanlı sistemlerin her biri benzersiz avantajlar sunar ve farklı deneysel sınırlamalar sunar. Bugüne kadar, küresel kültür en uygun maliyetli ve yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü modeli olmaya devam etmektedir. Ve birkaç rapor sferoid kültürlerinin cilt kök hücre özelliklerini incelemek için kullanılabileceğini belirtmiş olsa da, bu çalışmalar büyük ölçüde hayvan dokusu8,9veya dermal fibroblastlar10, insan epidermal küresel kültürlerinin rejeneratif özelliklerini iyice karakterize eden neredeyse hiçbir rapor olmadan yapılmıştır. Bu protokolde epidermal sferoid kültürlerin normal insan keratinositlerinden (NHKc) fonksiyonel gelişimini, kültürünü ve bakımını detaylandırıyoruz. Epidermal rejenerasyon ve keratinosit kök hücre plastisitesinin sıralı evrelerini in vitro olarak modellemek için bu sistemin yararlarını eşit olarak açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deri örneklerinin toplanması ve işlenmesi ve insan keratinositlerinin izolasyonu için protokol Güney Carolina Üniversitesi (UofSC) IRB tarafından gözden geçirilmiş ve sünnet derisi örneklerinin rutin cerrahi prosedürler sırasında (yenidoğan erkek çocukların sünneti) üretilen cerrahi atmalar olduğu ve tanımlayıcı bilgilerden tamamen yoksun olduğu için "insan deneklerini içermeyen araştırma" olarak sınıflandırılmıştır. Protokol ayrıca UofSC Biyogüvenlik Komitesi tarafından düzenli olarak gözden geçirilerek onaylandı ve tüm laboratuvar personeline laboratuvar biyogüvenlik eğitimi verildi. Tüm prosedürler UofSC'nin güvenlik ve etik standartlarına uygun olarak yürütüldü.
1. Yenidoğan sünnet derisi dokusundan insan keratinositlerinin izolasyonu ve kültürü
- 500 mL KSFM ortamına 0,1 M HEPES tampon ekleyerek yıkama ortamını hazırlayın ve 7,2 pH'a ayarlayın. Ortamı 500 mL vakum filtresinde (0,22 μm gözenek boyutu) sterilize edin. MCDB 153-LB bazal ortam, KSFM yerine alternatif bir yıkama çözümü olarak da kullanılabilir.
- Laminer akış davlumbazında, yenidoğan sünnet derisi 50 mL konik bir tüpte 5 mL yıkama ortamı ile yıkayın. İki kez tekrarlayın.
- Yıkanmış foreskin'i steril bir Petri kabına aktarın. Neşter ve toparlap kullanarak, yağ ve gevşek bağ dokularını dermal tabakadan kazıyın. 50 mL konik tüpte 5 mL yıkama ortamı ile foreskin yeniden yıkayın.
- Foreskin epidermis tarafını yıkama ortamlarında seyreltilmiş 2 mL dispaz enzimi içeren 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin (50 U/mL).
- Plakayı 4 saat boyunca bir inkübatöre aktarın (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
- Foreskin'i inkübatörden çıkarın ve steril koşullar altında bir Petri kabına aktarın. İnce uçlu epepler kullanarak epidermisi dermis tabakasından ayırın.
- Epidermisi% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini içeren 15 mL konik bir tüpe yerleştirin. 5 mL serolojik pipet kullanarak, yüzen epidermisi mekanik olarak ezin. Her 5 dakikada bir 5 sn periyodik girdap ile 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
- İnkübasyondan sonra, 2 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve tripsini nötralize etmek için pipetle karıştırın.
- Santrifüj hücre süspansiyonu 450 x g'da2 dakika ve sonra 250 x g'da8 dakika .
- Hücre peletini yerinden çıkarmamaya dikkat ederek, yüzen kalıntıları kümeslerle çıkarın. Hücre peletinden süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- Peletin 12 mL'lik komple KSFM-scm orta ve plakayı 10 cm'lik bir tabakta yeniden sunun. Bir gecede kuluçka kabı (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
- Ertesi gün, aspirasyon pipet kullanarak ortamı çıkarın ve 12 mL komple KSFM-scm ile değiştirin.
- Normal insan keratinosit (NHKc) kültürlerinin optimal büyümesini sağlamak için, hücrelerin% 80'den fazla izdiah elde etmesini önlemek için 10.
2. Cilt epidermosfer kültürlerinin in vitro olarak üretilmesi
- 50 mL'lik bir cam şişeye 50 mL fosfat tamponlu saline (PBS) 2,5 g agarose ekleyerek% 5 agarose karışımı hazırlayın. Sıvı döngüsü altında otoklav şişesi. Oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın.
- Tabak hazırlamak için, agarose çözeltisi içeren soğutulmuş cam şişeyi 200 mL deiyonize su (dH2O) ile doldurulmuş 1 L plastik bir kabın içine yerleştirin. Agarose karışımını araştırma sınıfı bir mikrodalga fırında 2 dakikaya kadar eritin, şişeyi hafifçe yana yatırarak her 60 s'de bir agarı karıştırın.
DİkKAT: Mikrodalga fırında agar eritmek, şişe kabının aşırı derecede ısınmasına ve basınç birikmesine neden olur. Her 30 s'de bir basınç birikmesi bırakın. Yaralanmayı önlemek için uygun koruyucu ekipman giyin. - %1 agarose (wt/vol) son konsantrasyon için 42 °C'ye önceden ısıtılmış 12 mL KSFM-scm'ye 3 mL eritilmiş %5 agarose ekleyin.
İsteğe bağlı: yumuşak agarın erken polimerizasyonunu önlemek için serolojik pipetleri ve pipet uçlarını önceden ısıtın. - Hızlı bir şekilde pipet 200 μL% 1 agar karışımı çok kanallı pipetör kullanarak 96 kuyulu yuvarlak tabanlı plakanın bireysel kuyularına karışır (Şekil 1A). Agarose'un tamamen polimerize olmasını sağlamak için plakayı 25 °C'de 4 saat steril ortamda bırakın.
NOT: Denemeler burada durdurulabilir ve ertesi gün devam edilebilir. Polimerize agaroz plakaları, parafilm sargısı ile kapatıldığında 37 °C'de 24 saate kadar veya 4 °C'de 48 saate kadar muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce en az 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'ye kadar ılık plaka. - Pasaj sferoid oluşturan NHKc, 2 mL PBS'de ortam ve yıkama hücreleri soluyarak. PBS'yi aspire edin ve yıkanmış hücrelere% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyin. 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya ya da tüm hücreler tamamen çözülene kadar kuluçkaya yatır. Tabağa 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve plakadaki hücreleri 15 mL'lik bir tüpe yıkayın. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
- Peleti 1 mL PBS'de yeniden dirsintir. Trypan mavisi boyama ve hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ölçün.
- Aliquot 2 x 104 NHKc 100 μL KSFM-scm ve tohum daha önce hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak-alt plaka bireysel kuyulara. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
- Ters faz kontrast mikroskobu kullanarak, epidermosfer oluşumu için tohumlanmış iyi analiz edin.
NOT: Normal insan keratinositlerinden elde edilen insan epidermosferleri, hücre canlılığında önemli bir azalma olmasına rağmen, 3D süspansiyon kültüründe 96 saate kadar yaşayabilir (Şekil 2).
3. Epidermal sferoid yeniden kaplama tahlil
- 3D epidermosfer oluşumundan sonra 24-48 saat, 6 cm'lik bir yemeğe 4 mL önceden ısıtilmiş KSFM-scm ekleyin. Tek bir sferoidi plakaya aktarmak için geniş bir delikli 1 mL pipet ucu kullanın, parçalanmamasını sağlayın. Alternatif olarak, ucu kesmek için steril bir jilet kullanarak 1 mL pipet ucunu genişletin.
- Plakayı gece boyunca kuluçkaya bırakın (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
- Plakanın dibine bağlanmak için tohumlu küreseli analiz edin ve ters faz kontrast mikroskobu kullanarak hücreleri yaymak için gözlemleyin (Şekil 3). Plakanın içindeki 2 mL ortamı nazikçe çıkararak ve yavaşça plakaya 2 mL taze KSFM-scm ortam ekleyerek her 96 saat hücre besleyin.
- Pasaj sferoid türevli (SD) NHKc% 70-80 izdiah süresine ulaştıklarında ve seçim testine devam ettikleri zaman. Hücrelerin kültürde tam izdiaha ulaşmasını önlemek için SD-NHKc'yi sık sık izleyin, çünkü bu erken farklılaşma ve hücre büyümesi durması ile sonuçlanır (Şekil 3E-F).
- Epidermal sferoid replating test modelleri keratinosit aracılı yara onarımı epidermal rejeneratif plastisitenin önemli sıralı aşamalarının her birini yakalayarak: a) homeostatik bakım, b) diferansiyel durdurma/tersine çevirme c) stres soyu hareketliliği ve d) doku restorasyonu (Şekil 1B; Tablo 2). Bu tahlil, organotipik sal kültürleri için hücre popülasyonları üretmek veya önceki çalışmamızda gösterildiği gibi HPV aracılı neoplazi modellemek için de kullanılabilir 11,12.
4.3D floresan hücre takibi
- 6 cm'lik bir tabakta, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) geni taşıyan 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plazmid vektörü ile transfect sferoid oluşturan 2D monolayer NHKc kültürleri. Bir gecede inkübte plaka (37 °C, %5 CO2,%95 nem) mikroskop (Şekil 4A).
NOT: Serumsuz antibiyotiksiz koşullarda transfeksiyonun tamamlanması önemlidir. - Transfeksiyon karışımını çıkarmadan, hücrelere 2 mL önceden uyarılmış KSFM-scm ekleyin. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
- Plaka ve besleme hücrelerindeki tüm transfeksiyon ortamlarını 3 mL önceden ısıtılmış KSFM-scm ile aspire edin.
- Pasaj ve tohum 2 x10 4 EGFP transfected hücreler daha önce hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak tabanlı bir plakanın bireysel kuyularına. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem). Egfppos sferoid hücre hareketini floresan mikroskobun FITC kanalı altında görselleştirin ve izleyin (Şekil 4B-C).
- Kaplamadan 24 saat sonra, 6 cm'lik bir tabağa 3 mL önceden ısıtilmiş KSFM-scm ekleyin. Tek bir sferoidi plakaya aktarmak için geniş bir delikli 1 mL pipet ucu kullanın, parçalanmamasını sağlayın. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
- Floresan mikroskobu kullanarak yayılan SD-NHKcEGFP'yi gözlemleyin ve analiz edin. Plakanın içindeki 2 mL'lik ortamı nazikçe çıkararak ve yavaşça plakaya 2 mL taze KSFM-scm ortam ekleyerek her 96 saat hücre besleyin.
- FACS izolasyonu veya tercih edilen tahliller için hasat SD-NHKCEGFP.
5. Küresel türevli (SD) alt popülasyonların FACS tarafından karakterizasyonu
- Pasaj SD-NHKc ve eski medyayı aspire ederek ve hücreleri 2 mL PBS'de yıkayarak ilgili otolog 2D monolayer kültürleri. PBS'yi çıkarın ve yıkanmış hücrelere % 0,25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyin. 37 °C'de 5 dakika veya tüm hücreler tamamen çözülene kadar kuluçkaya yatır.
- Plakaya 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
- Peletleri 1 mL PBS'de yeniden sunun. Trypan mavisi ve otomatik bir hemositometre hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ölçün.
- 0,1-4 x 106 NHKc hücre içeren Aliquot 100 μL'den 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere. Laminar kaputun içindeki parlak ışıkları kapatarak oluşturulan karanlık bir ortamda tüpü buzun üzerine yerleştirin.
- 1:50 seyreltme elde etmek için tüplere 2 μL FITC konjuge anti-integrinα6 ve 2 μL PE-konjuge anti-EGFR ekleyin. Tespit edilmemiş kontrol görevi görmek için antikor eklenmemiş bir tüp hazırlayın. Tüpleri karanlıkta veya 4 °C'de 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Boncukların veya bir cilt SCC hattının kullanımı, cilt SCC hücrelerinin yüksek integrinα6 ve EGFR seviyelerini ifade ettiği için pozitif kontrol görevi görebilirsiniz.
- Uygun lazerler içeren tercih edilen akış sitometresini kullanarak akış sitometrisi analizi yapın.
- Kapıları kurmak için negatif ve pozitif kontrolleri kullanın. Integrinα6hi/EGFRlo hücrelerinin alt nüfusunu sıralayın; bunlar epidermal kök hücre fraksiyonudur. Integrinα6hi/EGFRhi hücreleri proliferatif progenitör hücre fraksiyonudur. Integrinα6lo/EGFRhi hücreleri taahhüt edilen progenitör hücre fraksiyonudur (Şekil 4D). SıRALAMA FACS tüpleri en az 1 mL buz-soğuk KSFM-scm içermelidir.
- Her bir sıralama tüpünün içeriğini PBS'deki sıralanmış hücrelerin hacminin 10 katını içeren 15 mL konik bir tüpe aktararak sıralanmış hücre alt nüfuslarının proliferatif kapasitesini test edin. NOT: Keratinositler sık sık oraya yapışabileceğinden, sıralama FACS tüplerinin duvarını birkaç kez pipetleyarak janta bağlı tüm hücrelerin çıkarılması önemlidir.
- 5 dakika boyunca 250 x g'da 15 mL tüpleri santrifüj edin. 12 mL KSFM-scm'de süpernatant ve resuspend peletini çıkarın. Yeniden sulanan hücreleri 6 cm'lik bir plakaya aktarın ve gece boyunca kuluçkaya bırakın (37 °C, %5 CO2, %95 nem).
- Ertesi gün, plakalardaki medyayı çıkarın ve 8 mL önceden ısıtılmış KSFM-scm ekleyin. Hücreleri% 70-80 birleştiği zamana kadar her 3 günde bir 12 mL ortamla yeniden besleyin (Şekil 4E).
6. Bazal kök hücre belirteçleri için epidermosferlerin immünofluoresansı ve boyanma
- Epidermosferleri poli lizin ile kaplanmış kapaklara aktarın. SD-NHKc'nin %75 bir araya gelene kadar yayılmasına izin verin.
- Hücreleri PBS'de (4 °C) iki kez 5'er dakika yıkayın.
- %4 paraformaldehit (PFA) içeren hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika sabitlayın.
- %1 glisinin %0,5 Triton X-100 ile hücreleri permeabilize eder. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca % 0.5 BSA ve% 5 keçi serumu kullanarak engelleyin.
- Örnekleri P63 (1:200) ve sitokeratin 14'e (1:200) karşı antikorlarla bir gecede 4 °C'de bloke çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
- Tween 20 (PBST) içeren PBS (4 °C) ile üç kez yıkayın, ardından FITC ve Alexa 568 konjuge ikincil antikorlarla (1:1000 seyreltme) inkübasyon.
- Hücreleri monte etmeden önce 4', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1:5000 seyreltme) ile nuclei leke.
- FITC ve PE lazer hatları ile floresan özellikli bir mikroskop kullanarak hücreleri gözlemleyin (Şekil 4F).
7. Epidermosfer kültürlerinin transkripsiyon analizi
- RNA'yı izole etmek için düşük geçişli NHKc kültürlerinin üç taraflı plakalarını kurmak, aynı otolog hücre hattından monolayer, küresel ve küresel türetilmiş kültürlerden olabilir.
- Havuz 3-5 karşılık gelen epidermosferler 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne. Otolog SD-NHKc ve 2D monolayer kültürlerini ayrı ayrı hasat edin.
- Toplam RNA'yı üç gruptan da ayır.
- Toplam RNA'nın 1 μg'si ile ters transkripsiyon gerçekleştirin.
- cDNA kullanarak, GAPDH'yi dahili kontrol olarak kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin (Tablo 1).
- Amplicon ürün boyutunu agarose jel elektroforez (%2 v/v) ile doğrulayın.
NOT: Epidermosfer kültürlerinin tam genom mikroarray analizi kullanılarak transkriptomik olarak profillenerek, toplam RNA'yı tek bir NHKc donörün kütle kültürlerinden ve aynı donörden karşılık gelen SD-NHKc'den izole edin, her biri altı kopya halinde. - En az 9,0 ile 9,1 arasında değişen RNA Bütünlük Numaraları (RIN) elde etmek için bir biyoanalyzer kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
- Toplam RNA örneklerini yükselterek ve biyotinilasyon yaparak mikroarray deneyleri yapın.
- T7 RNA polimeraz promotör serisi içeren NNN rastgele astarları kullanarak örnek başına toplam RNA'nın 100 ng'lik kısmını ds-cDNA'ya ters yazıya dökün.
- RNA'yı yükseltmek için cDNA örneklerine T7 RNA polimeraz ekleyin, ardından RNA'yı ss-cDNA'ya kopyalayın. RNase H kullanarak fazla RNA'yı düşürün.
- SscDNA moleküllerini parçala ve biotin ile etiketle.
- Etiketli numuneleri 45 °C'de 16 saat boyunca yükseltin.
- Bir hibridizasyon fırını ve yıkama ve leke kiti kullanarak numuneleri melezleştirin.
- Melez dizileri yıkayın ve lekelendirin.
- Sistem ve bilgisayar iş istasyonu kullanarak dizileri tarayın.
- Dizi taramalarının tamamlanmasının ardından, chp dosyaları oluşturmak için kütüphane dosyası ve Sağlam Çok Keskin Analiz (RMA) algoritmasını kullanarak prob hücresi yoğunluğu (CEL) dosyalarını ifade konsolu yazılımına ve gen düzeyinde işleme alın.
- Expression Console'daki veri kalitesini onayladıktan sonra, her bir prob için log2 ifade sinyallerini içeren CHP dosyalarını, varyansların tek yönlü konu analizi kullanarak hücre türüne özgü transkripsiyonel yanıtları analiz etmek için bir transkriptom analiz yazılımına aktarın.
8. SD-NHKc koloni oluşturma verimliliğinin değerlendirilmesi
- Hücreler% 70-80 izdiah süresine ulaştığında plakalardan ortam aspirat. Hücreleri PBS 'de (4 °C) her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Hücreleri 15 dakika boyunca 3 mL% 100 metanol (4 °C) ile sabitleyin. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- 30 dakika boyunca 3 mL%10 Giemsa'da leke hücreleri. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Hücrelerin gece boyunca kurumasına izin verin.
- Ertesi gün koloni oluşumunu analiz edin ve elde edilen koloni sayısını ölçün
9. SD-NHKc popülasyonu iki katına çıkması
- Pasaj SD-NHKc ve eski medyayı arzulayarak ve 2mL PBS'de hücreleri yıkayarak ilgili otolog 2D monolayer kültürleri. PBS'yi çıkarın ve yıkanmış hücrelere 2 mL% 0.25 Trypsin-EDTA ekleyin. 5 dakika boyunca veya tüm hücreler tamamen kopana kadar kuluçkaya yatır (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
- Plakaya 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
- 12 mL KSFM-scm'de süpernatant ve resuspend peletini çıkarın.
- Düşük yoğunluklu tohum hücreleri 1-2 x 104 NHKc'yi tek tek 10 cm'lik yemeklere ayırır ve gece boyunca kuluçkaya yaslar (37 °C,%5 CO 2,%95 nem).
- Ertesi gün 8 mL KSMF-scm besleme plakaları. En az% 25 birleştiği zamana kadar her 4 günde bir besleyin, ardından her 2 günde bir besleyin.
- Hücre proliferatif kapasitesi tükenene kadar 60 cm'lik yemeklerde 1:5 hücre geçişi. Trypan mavi boyama ile hücre canlılığını ölçün. Her pasajda popülasyon ikiye katlamalarını şu formülü kullanarak belirleyin: log (N/N 0) / log2, burada N her pasajda elde edilen toplam hücre sayısını veN 0 deneyin başlangıcında kaplanmış hücre sayısını temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cilt epidermosfer tahlilleri sırasında, NHKc kültürleri 96 kuyu plakasının agarose kaplı kuyularında tohumlanır (Şekil 1A). Küresel oluşturan hücreler 48 saat içinde kendi kendine toplanmalı. Otonom küresel oluşum, standart bir ters faz kontrastı mikroskobu kullanılarak 24 saat kadar erken bir sürede değerlendirilebilir. cilt epidermosfer oluşumu ve yeniden kaplama tahlil modeli epidermal doku yenilenmesinin çeşitli evreleri (Şekil 1B). Şekil 2, 3D kültüründe epidermal sferoid şekillendirme yeteneği için test edilen çeşitli NHKc suşlarının yüksek çözünürlüklü görüntülerini göstermektedir. Hücreleri yoğun küre şeklinde toplama için incelemek önemlidir, çünkü bu spontan seküler sferoid oluşumunun bir işaretidir. Uygun spontan toplamayı sağlamak için 2 x 104'ten fazla hücre kullanmayı gerekli gördük. Şekil 2Asuşlarında görüldüğü gibi küresel olmayan hücre toplaması yeterli epidermosfer oluşumu olarak kabul edilmiyor. 2D monolayer kültüründe sferoid olmayan oluşturan hücre süspansiyonlarının kaplatması nadiren uygulanabilir NHKc hücre büyümesine neden olur. Bununla birlikte, epidermosferlerin 2D kültürde kaplanması, küçük boyutlu uygulanabilir NHKc'nin çoğalmasıyla sonuçlanır (Şekil 3). Epidermosferlerin ve SD-NHKc'nin görüntüleri standart bir ters faz kontrastı mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir ve izlenebilir. Bu kültürlerin% 100'ün altında tutulması önemlidir, çünkü bu, kültürdeki büyümelerini ve kök hücre durumlarını önemli ölçüde zorlayabilir (Şekil 3E-F). Epidermal sferoid oluşum süreci, hücrelerin floresan bir muhabirle transfeksiyonu ile tek hücre düzeyinde işlevsel olarak izlenebilir (Şekil 4A-C). Optimal koşullar altında, öncelikle SD-NHKc kültürlerinde zenginleştirilmiş keratinosit alt nüfus Integrinα6hi/EGFRlo hücreleridir. Bu hücreler genellikle tüm SD-NHKc kültürlerinin yaklaşık% 25'ini oluşturan ve FACS (Şekil 4D)tarafından kolayca izole edilebilir. Bununla birlikte, çiftleri dışlamak için ileri yan dağılım alanı (FSC-A) ve yan dağılım alanı (SSC-A) kapıları kurulması önemlidir (Şekil 4D). Bu kök benzeri keratinosit subpopülasyonunun daha fazla karakterizasyonu, bazal sitokeratin 14 (K14) ve tümör proteini 63 (P63) gibi epidermal kök hücre işaretleyici ekspresyonunun immünofluoresan boyama analizi ile elde edilebilir (Şekil 4F; Tablo 2).
Şekil 1: NHKc epidermosferlerinin 3D süspansiyonda yetiştirilmesi. (A) Epidermal sferoid yeniden kaplama testinin şematik gösterimi 11 .'denuyarlanmıştır. (B) Epidermal sferoid yeniden kaplama testinin her sıralı adımında NHKc kültürlerinin, epidermal sferoidlerin ve SD-NHKc'nin temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cilt epidermosfer büyümesinin değerlendirilmesi. (A) Yüzen 3D süspansiyonda altı ayrı küresel oluşmayan ve (B) küresel oluşturan NHKc suşlarının görüntüleri. (C) Çeşitli miktarlarda NHKc kullanılarak elde edilen epidermosferler. (D) Yüzen 3D süspansiyon kültüründe farklı miktarlarda NHKc kullanılarak elde edilen ortalama epidermosfer boyutunun nicelemesi. Çubuklar standart sapmayı gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Büyüyen küresel türevli kültürler. (A) 2D plastik kültüründe yeniden kaplamadan sonra ekli bir epidermosferden yayılan SD-NHKc monolayer kültürlerinin zaman seyri faz kontrastı görüntülemesi 24 saat, (B) 48 h, (C) 72 saat ve (D) 96 saat. (E) SD-NHKc kültürleri sırasıyla 2D plastik kültüründe yeniden sıçramadan 15 ve 20 gün sonra% 80 izdiah ve (F) % 100 izdiah eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Küresel türevli (SD) alt popülasyonların karakterizasyonu. (A) Woappi ve ark. 202012tarafından açıklandığı gibi epidermosfer in vitro 3D hücre izleme test şematik gösterimi . (B) EGFP ekspresyon epidermosferleri 2 h ve (C) 24 h 3D kültüründe tohumlamadan sonra. (D) SD-NHKc alt nüfuslarının floresan aktif hücre sıralamasını (FACS). Tüm hücrelerin yaklaşık1/4'ü integrinα6hi/EGFRloolmalıdır. (E) Integrinα6hi/EGFRlo alt nüfusları keratinosit holoklonları üretir. (F) Integrinα6hi/EGFRlo hücrelerinde bazal epitel kök hücre işaretleyici ekspresyonunun immünofluoresan boyamaanalizi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar dizisi (5'-3') | ||
| Gen adı | İleri Astar | Ters Astar |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| EGFR | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tablo 1. Yenidoğan keratinosit plastisitesinde yer alan seçilmiş genlerin tespiti için kullanılan PCR astar dizilerini özetler.
| Kültür Koşulu | Faz Kontrast Görünümü | İmmünasyon | FACS Analizi | Transkriptomik imza | |
| Homeostatik bakım | 2D monolayer | 30 μm < küçük boyutlu hücreler | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Epidermal bakım (K14, P63, IVL, K10) |
| Farklılaşma durdurma/tersine çevirme | 3D küresel | Kompakt çok hücreli agrega > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | YOK | Renksizme: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Stres soyu hareketliliği | 3D'den 2D'ye küresel bağlantı | Küçük boyutlu hücrelerin (< 20 μm) küresel kenardan yayılması | K14, P63, Ki-67 | ITGα6merhaba/EGFPmed | Cilt hücrelerinin çoğalması: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Doku restorasyonu | 3D'den 2D'ye küresel monolayer | 20 μm< küçük boyutlu hücrelerin yayılması | K14, P63, IVL | ITGα6merhaba/EGFPlo ve ITGα6hi/EGFPhi | Epidermisin oluşumu: K14, IVL, FLG |
Tablo 2. Epidermal sferoid replating testinin fenotipik ve moleküler karakterizasyonu için stratejiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D küresel kültür sistemlerinin kullanımı hücre saplığını değerlendirmede geniş bir faydaya sahiptir. Bu sistemlerin doku kök hücrelerinin zenginleştirilmesini artırdığı gösterilmiştir13, ancak insan epidermal kök hücrelerinin incelenmesi için yararları sınırlı olarak araştırılmıştır. Burada, 3D kültür tekniklerini kullanarak insan keratinosit kök hücrelerini zenginleştirmek için bir strateji açıklıyoruz. Bu sistemde, NHKc, KSFM-scm içeren agarose yatakların üzerine asılan birkaç keratinosit alt tipinden oluşan kendi kendine monte edilen çok hücreli küresel süspansiyonlar olarak yetiştirilir. Agar oda sıcaklığında hızla polimerize olduğu için bu protokolün kurulumu zamana duyarlıdır. Serolojik pipetlerin, mikropipette uçlarının ve agar/hücre karıştırma tüpünün yanı sıra ortamın 42 °C'ye kadar ısıtılması erken polimerizasyonu önemli ölçüde azaltabilir. Kuyulara agar/media karışımı ekledikten kısa bir süre sonra 96 kuyu plakasının 4 °C'ye yerleştirilmesinin polimerizasyonu önemli ölçüde hızlandırabileceğini ve agar yastığının sonraki hücrelerin tohumlanması için yeterince sağlam olmasını sağlayabileceğini gözlemledik. Agar/media karışımının zayıf polimerizasyonu, hücrelerin yumuşak agar içinde tohumlanmasına veya büyümesine neden olacağından, testleri geçersiz kılacağından, polimerizasyon işlemi sırasında plaka seviyesini her zaman korumak önemlidir.
Ayrıca bu protokolde özetlenen, kök benzeri küresel türevli hücreler oluşturmak için 2D monolayer kültüründe epidermosferlerin yayılması için bir strateji sunuyoruz. Epidermal sferoid yeniden kaplama tahlil, integrinα6hi/EGFRlo keratinositlerin kök hücre benzeri bir alt nüfus için zenginleştirir. Bu hücreler epidermal rekonstrüksiyon, sedef hastalığı veya hücresel neoplazi11 , 12,14. Integrinα6hi/EGFRlo keratinositler de FACS tarafından kolayca izole edilebilir ve immünofluoresan boyama ile karakterize edilebilir. Bu tür deneyler yaparken, sıralanmamış otolog 2D monolayer hücrelerinin kontrol olarak kullanılmasını yararlı bulduk., cilt SCC hücre hatları iyi bir alternatifTir Bunlar kullanılamıyorsa.
Özetle, bu rapor göstermektedir ki insan epidermal sferoid yeniden kaplama modelleri keratinosit rejeneratif plastisite in vitro, rejenerasyonun dört aşamasının her birini yakalar: homeostatik bakım, farklılaşma tersine çevirme, stres soyu hareketliliği ve doku restorasyonu. Bununla birlikte, agar bazlı küresel kendi kendine montajın bir sınırlaması, tüm NHKc lekelerinin kendiliğinden küreseller oluşturabilmesidir. Asılı bırakma yöntemi15, bu zorluğun üstesinden gelmek ve çok hücreli küresel oluşumu teşvik etmek için iyi bir alternatif stratejidir. Bu test ayrıca çeşitli hücre popülasyonlarının epidermal rejenerasyona katkısı hakkında daha fazla bilgi edinmek için kas, stromal veya bağışıklık hücreleri ile çoklayıcı olabilir. Matrigel'in ağar içine eklenmesinin epidermosfer hayatta kalma ve gücünü artırıp artıramayacağını keşfetmek ilginç olurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak finansal ilişkileri yok.
Acknowledgments
UofSC Tıp Fakültesi Enstrümantasyon Kaynak Tesisi (IRF), görüntüleme ve hücre sıralama ekipmanlarına ve teknik yardıma erişim sağladı. Bu çalışma kısmen 1R21CA201853 hibesi ile desteklendi. MCF ve IRF, NIH hibe P20GM103499, SC INBRE'den kısmi destek alır. MCF ayrıca NIH hibe P20GM109091'den de destek alır. Yvon Woappi kısmen NIH tarafından 2R25GM066526-06A1 (PREP) ve R25GM076277 (IMSD) hibeleri ve UofSC'deki Grace Jordan McFadden Profesörler Programı tarafından burs ile desteklenmiştir. Geraldine Ezeka ve Justin Vercellino, UofSC'de NIH hibeleri 2R25GM066526-10A1 (PREP) tarafından desteklendi. Sean M. Bloos, UofSC'de 2016 Magellan Akademik Ödülü ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
