Summary
Her beskriver vi en protokoll for systematisk dyrking av epidermale sfæroider i 3D-suspensjonskultur. Denne protokollen har omfattende applikasjoner for bruk i en rekke epitelvevstyper og for modellering av flere menneskelige sykdommer og forhold.
Abstract
Epitelial dysregulering er en node for en rekke menneskelige tilstander og plager, inkludert kronisk såring, betennelse og over 80% av alle menneskelige kreftformer. Som fôrvev er hudepitelet ofte utsatt for skade og har evolusjonært tilpasset seg ved å skaffe seg den cellulære plastisiteten som er nødvendig for å reparere skadet vev. Gjennom årene har det blitt gjort flere anstrengelser for å studere epitel plastisitet ved hjelp av in vitro og ex vivo cellebaserte modeller. Imidlertid har disse anstrengelsene vært begrenset i deres evne til å rekapitulere de ulike fasene av epitelcelleplastisitet. Vi beskriver her en protokoll for generering av 3D epidermale sfæroider og epidermale sfæroid-avledede celler fra primære neonatale humane keratinocytter. Denne protokollen skisserer kapasiteten til epidermale sfæroidkulturer for å funksjonelt modellere distinkte stadier av keratinocyttisk generativ plastisitet og viser at epidermal sfæroid re-plating kan berike heterogene normale menneskelige keratinocytter (NHKc) kulturer for integrinα6hi/ EGFRlo keratinocytt subpopulations med forbedrede stammelignende egenskaper. Vår rapport beskriver utvikling og vedlikehold av et høyt gjennomstrømningssystem for studiet av hud keratinocyttplastisitet og epidermal regenerering.
Introduction
Pattedyret stratifisert epitel er den mest komplekse epitelarkitekturen i alle levende systemer og er oftest utsatt for skade og skade. Som et beskyttende vev har stratifisert epitel utviklet seg for å generere en kompleks og effektiv vevsskaderespons. Ved skade må disse cellene aktivere plastisitetsprogrammer for avledning, noe som gjør dem i stand til å migrere til det skadede stedet og utføre reparasjon1,2,3. Denne mangefasetterte responsen forekommer i flere sekvensielle trinn som forblir dårlig forstått.
Et stort hinder for å studere den intrikate prosessen med epitelregenerering ligger i den kjære av høy gjennomstrømningsmodellsystemer som kan fange dynamiske cellulære aktiviteter på definerte stadier av celleregenerering. Mens in vivo musemodeller gir relevant innsikt i sårheling og mest rekapitulerer den menneskelige regenerative prosessen, krever deres utvikling arbeidskrevende innsats og betydelige kostnader, noe som begrenser deres gjennomstrømningskapasitet. Det finnes derfor et kritisk behov for å etablere systemer som muliggjør funksjonell undersøkelse av human epitelial vevregenerering i høy gjennomstrømningsskala.
De siste årene har det blitt gjort flere forsøk på å møte skalerbarhetsutfordringen. Dette ses gjennom stor utvidelse av innovative in vitro- og ex vivo-cellebaserte modeller som etterligner den in vivo regenerative konteksten tett. Dette inkluderer fremskritt i organ-on-chip4, sfæroid5, organoid6og organotypiske kulturer7. Disse 3D-cellebaserte systemene tilbyr hver unike fordeler og presenterer tydelige eksperimentelle begrensninger. Til dags dato er sfæroidkultur fortsatt den mest kostnadseffektive og mye brukte 3D-cellekulturmodellen. Og mens flere rapporter har indikert at sfæroidkulturer kan brukes til å studere hudstammecelleegenskaper, har disse studiene i stor grad blitt utført med dyrevev8,9, eller med dermale fibroblaster10, med nesten ingen rapporter som grundig karakteriserer de regenerative egenskapene til menneskelige epidermale sfæroidkulturer. I denne protokollen beskriver vi funksjonell utvikling, kultur og vedlikehold av epidermale sfæroidkulturer fra normale menneskelige keratinocytter (NHKc). Vi beskriver også nytten av dette systemet for å modellere de sekvensielle fasene av epidermal regenerering og keratinocytt stamcelleplastisitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for innsamling og håndtering av hudprøver og isolering av humane keratinocytter har blitt gjennomgått av University of South Carolina (UofSC) IRB og klassifisert som "forskning som ikke involverer mennesker", da forhudsprøvene var kirurgiske kasser produsert under rutinemessige kirurgiske prosedyrer (omskjæring av nyfødte gutter) og var helt blottet for å identifisere informasjon. Protokollen ble også gjennomgått og godkjent av UofSC Biosafety Committee med jevne mellomrom, og alt laboratoriepersonell gjennomgikk laboratoriebiosikkerhetsopplæring. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med sikkerhets- og etikkstandardene til UofSC.
1. Isolasjon og kultur av menneskelige keratinocytter fra neonatal forhudsvev
- Forbered vaskemediet ved å legge til 0,1 M HEPES-buffer til 500 ml KSFM-medium og juster det til en pH på 7,2. Steriliser medium i et 500 ml vakuumfilter (0,22 μm porestørrelse). MCDB 153-LB basal medium kan også brukes som en alternativ vaskeløsning i stedet for KSFM.
- I en laminær strømningshette, vask neonatal forhud med 5 ml vaskemedier i et 50 ml konisk rør. Gjenta to ganger.
- Overfør vasket forhud til en steril Petri-tallerken. Bruk en skalpell og tang, skrap av fett og løs bindevev fra det dermale laget. Rewash forhud med 5 ml vaskemedier i et 50 ml konisk rør.
- Plasser forhud epidermis side opp i en 6-brønns plate som inneholder 2 ml dispase enzym fortynnet i vaskemedier (50 U / ml).
- Overfør platen til en inkubator i 4 timer (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Fjern forhuden fra inkubatoren og, under sterile forhold, overfør den til en Petri-tallerken. Bruk finspiss tang, skille epidermis fra dermis lag.
- Plasser epidermis i et 15 ml konisk rør som inneholder 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA. Bruk en 5 ml serologisk pipet, knuse den flytende epidermis mekanisk. Inkuber i 15 min ved 37 °C med periodisk virvel i 5 s hver femte min.
- Etter inkubasjon, tilsett 2 ml soyabønne trypsinhemmer og bland ved pipettering for å nøytralisere trypsin.
- Sentrifuger celle suspensjon i 2 min ved 450 x g, og deretter i 8 min ved 250 x g.
- Fjern flytende rusk med tang, vær forsiktig så du ikke løsner cellepellet. Forsiktig aspirerer supernatant fra cellepelleten.
- Resuspend pellet i 12 ml komplett KSFM-scm medium og plate i en 10 cm tallerken. Inkuber retten over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Påfølgende dag, fjern medium ved hjelp av en aspirerende pipette og erstatt med 12 ml komplett KSFM-scm. Gjenta på dag 4 og 7.
- For å opprettholde optimal vekst av normale menneskelige keratinocyttkulturer (NHKc), passasjeceller 1:5 på dag 10 for å forhindre at celler oppnår større enn 80% samløp.
2. Generere hud epidermosphere kulturer in vitro
- Forbered en 5% agaroseblanding ved å tilsette 2,5 g agarose til 50 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS), i en 50 ml glassflaske. Autoklavflaske under væskesyklus. La det avkjøles til romtemperatur.
- For å tilberede plater, plasser den avkjølte glassflasken som inneholder agaroseoppløsning i et 1 L plastbeger fylt med 200 ml deionisert vann (dH2O). Smelt agaroseblanding i en mikrobølgeovn av forskningsklasse i opptil 2 minutter, bland agaren hver 60.
FORSIKTIG: Smeltende agar i mikrobølgeovnen vil føre til at kolbebeholderen blir ekstremt varm, noe som resulterer i trykkoppbygging. Frigjør trykkoppbygging hver 30. Bruk egnet verneutstyr for å unngå personskade. - Tilsett 3 ml smeltet 5% agarose til 12 ml KSFM-scm forhåndsvarslet til 42 °C for en endelig konsentrasjon på 1% agarose (wt/vol).
Valgfritt: Forvarm de serologiske pipettene og pipettespissene for å forhindre for tidlig polymerisering av den myke agaren. - Rør raskt 200 μL av den 1% agarblandingen i individuelle brønner av en 96-brønns rundbunnplate ved hjelp av en flerkanals pipettor (figur 1A). La platen stå i sterilt miljø ved 25 °C i 4 timer, slik at agarose kan polymeriseres fullt ut.
MERK: Eksperimentering kan stoppes her og fortsette neste dag. Polymeriserte agaroseplater kan opprettholdes ved 37 °C opp til 24 timer eller ved 4 °C i opptil 48 timer når de er forseglet med parafilminnpakning. Varm plate til 37 °C i en fuktet inkubator i minst 1 time før bruk. - Passasje sfæroiddannende NHKc ved å aspirere medier og vaskeceller i 2 ml PBS. Aspirer PBS og tilsett 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA til vaskede celler. Inkuber i 5 min ved 37 °C eller til alle cellene løsner helt. Tilsett 2 ml Soyabønner Trypsin Inhibitor til platen og vask av celler fra platen i et 15 ml rør. Sentrifuge ved 250 x g i 5 min.
- Resuspend pellet i 1 ml PBS. Kvantifisere celle levedyktighet ved hjelp av trypan blå flekker og et hemocytometer eller en automatisert celle teller.
- Aliquot 2 x 104 NHKc i 100 μL KSFM-scm og frø i individuelle brønner av tidligere tilberedt 96-brønns rundbunnsplate. Inkuber plate over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Bruk et invertert fasekontrastmikroskop, analyser frøbrønn for epidermosfæredannelse.
MERK: Menneskelige epidermosfærer fra normale humane keratinocytter kan forbli levedyktige i 3D-suspensjonskultur i opptil 96 timer, men med betydelig reduksjon i celle levedyktighet (Figur 2).
3. Epidermal sfæroid re-plating analyse
- 24-48 h etter 3D epidermosphere formasjon, tilsett 4 ml forvarsel KSFM-scm til en 6 cm tallerken. Bruk en bred bore 1 ml pipettespiss for å overføre en enkelt sfæroid til platen, og sørg for ikke å bryte den fra hverandre. Alternativt kan du utvide en 1 ml pipettespiss ved hjelp av et sterilt barberblad for å kutte spissen.
- Inkuber platen over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Analyser frøsfæroid for feste til bunnen av platen og observer for forplantning av celler ved hjelp av et invertert fasekontrastmikroskop (figur 3). Mat celler hver 96 h ved å forsiktig fjerne 2 ml av mediet inne i platen og sakte legge til 2 ml friskt KSFM-scm-medium til platen.
- Passasje sfæroid-avledet (SD) NHKc når de når 70-80% samløp og fortsetter med analyse av valg. Overvåk SD-NHKc ofte for å forhindre at celler når full sammenheng i kulturen, da dette resulterer i for tidlig differensiering og cellevekststans (Figur 3E-F).
- Den epidermale sfæroid replating analyse modeller keratinocyte-mediert sår reparasjon ved å fange hver av de viktigste sekvensielle faser av epidermal regenerativ plastisitet: a) homeostatisk vedlikehold, b) differensiering stopp / reversering c) stress avstamming mobilitet, og d) vev restaurering (Figur 1B; Tabell 2). Denne analysen kan også brukes til å produsere cellepopulasjoner for organotypiske flåtekulturer eller til å modellere HPV-mediert neoplasi som vist i vårt tidligere arbeid 11,12.
4.3D fluorescenscellesporing
- I en 6 cm tallerken, transfekt sfæroiddannende 2D monolayer NHKc kulturer med 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plasmid vektor bærer forbedret grønn fluorescerende protein (eGFP) genet. Inkuber plate over natten (37 °C, 5 % CO2,95 % fuktighet) mikroskop (figur 4A).
MERK: Det er viktig at transfeksjon fullføres under serumfrie antibiotikafrie forhold. - Uten å fjerne transfeksjonsblanding, tilsett 2 ml forvarsel KSFM-scm i celler. Inkuber plate over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Aspirer alle transfeksjonsmedier fra plate- og fôrceller med 3 ml forhåndsvarslet KSFM-scm. Vurder for tilstedeværelse av EGFP-uttrykkende celler under FITC-kanalen til et fluorescerende mikroskop.
- Passasje og frø 2 x 104 EGFP-transfekterte celler til individuelle brønner av en tidligere tilberedt 96-brønns rundbunnsplate. Inkuber plate over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet). Visualiser og overvåk EGFPpos sfæroid cellebevegelse under FITC-kanalen til et fluorescensmikroskop (Figur 4B-C).
- 24 timer etter plating, tilsett 3 ml forvarsel KSFM-scm til en 6 cm tallerken. Bruk en bred bore 1 ml pipettespiss for å overføre en enkelt sfæroid til platen, og sørg for ikke å bryte den fra hverandre. Inkuber plate over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Observer og analyser forplantning av SD-NHKcEGFP ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Mat celler hver 96 h ved å forsiktig fjerne 2 ml mediet inne i platen og sakte legge til 2 ml friskt KSFM-scm-medium til platen.
- Høst SD-NHKCEGFP for FACS isolasjon eller analyser av valg.
5. Karakterisering av sfæroid-avledede (SD) underpopulasjoner av FACS
- Passasje SD-NHKc og tilsvarende autologe 2D monolayer kulturer ved å aspirere gamle medier og vaskeceller i 2 ml PBS. Fjern PBS og tilsett 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA til vaskede celler. Inkuber ved 37 °C i 5 minutter eller til alle cellene løsner helt.
- Tilsett 2 ml soyabønner trypsinhemmer til platen og overfør celler til et 15 ml rør. Sentrifuge ved 250 x g i 5 min.
- Resuspend pellets i 1 ml PBS. Kvantifisere celle levedyktighet ved hjelp av trypan blå og en automatisert celle teller av hemocytometer.
- Aliquot 100 μL som inneholder 0,1-4 x 106 NHKc-celler til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Plasser røret på isen i et mørkt miljø, skapt ved å slå av sterke lys i laminær hetten.
- Tilsett 2 μL FITC-konjugert anti-integrinα6 og 2 μL PE-konjugert anti-EGFR til rør for å oppnå en 1:50 fortynning. Forbered et rør uten antistoffer lagt til for å tjene som den uoppdagede kontrollen. Inkuber rør på is i mørke eller ved 4 °C i 30 minutter. Bruken av perler eller en hud SCC linje kan tjene som positiv kontroll, som huden SCC celler uttrykke forhøyede nivåer av integrinα6 og EGFR.
- Utfør strømningscytometrianalyse ved hjelp av valg av strømningscytometer som inneholder med passende lasere.
- Bruk de negative og positive kontrollene til å opprette porter. Sortere delpopulasjonen av integrinα6hi/EGFRlo celler; Dette er den epidermale stamcellefraksjonen. Integrinα6hi/EGFRhi-celler er den proliferative stamcellefraksjonen. Integrinα6lo/EGFR-hicellene er den engasjerte stamcellefraksjonen (Figur 4D). Sortering av FACS-rør skal inneholde minst 1 ml iskald KSFM-scm.
- Test for proliferativ kapasitet for sorterte celle subpopulasjoner ved å overføre innholdet i hvert respektive sorteringsrør til et 15 ml konisk rør som inneholder 10 ganger volumet av sorterte celler i PBS. MERK: Det er viktig å fjerne alle celler som er festet til felgen ved å pipettere veggen på sorterings-FACS-rørene flere ganger, da keratinocytter ofte kan feste seg der.
- Sentrifuge 15 ml rør ved 250 x g i 5 min. Fjern supernatant og resuspend pellet i 12 ml KSFM-scm. Overfør de resuspenderte cellene til en 6 cm plate og inkuber over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Neste dag, fjern medier i plater og tilsett 8 ml forvarmet KSFM-scm. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet. Mat celler med 12 ml medium hver tredje dag til 70-80 % sammenløp (figur 4E).
6. Immunfluorescens og farging av epidermospheres for basale stamcellemarkører
- Overfør epidermospheres på coverlips belagt med poly-lysin. Tillat SD-NHKc å forplante seg til 75% sammenløp.
- Vask celler to ganger i PBS (4 °C) i 5 minutter hver.
- Fest celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min ved romtemperatur.
- Permeabiliser celler med 0,5% Triton X-100 i 1% glycin. Blokker med 0,5% BSA og 5% geitserum i 30 min ved romtemperatur.
- Inkuber prøver med antistoffer mot P63 (1:200) og cytokeratin 14 (1:200) i blokkeringsløsning over natten ved 4 °C.
- Vask tre ganger med PBS (4 °C) som inneholder Tween 20 (PBST), etterfulgt av inkubasjon med FITC- og Alexa 568-konjugede sekundære antistoffer (1:1000 fortynning).
- Flekkkjerner med 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1:5000 fortynning) før montering av celler.
- Vær oppmerksom på celler ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med FITC- og PE-laserlinjer (figur 4F).
7. Transkripsjonell analyse av epidermosphere kulturer
- Sett opp triplikatplater med lavpassasje NHKc-kulturer for å isolere RNA kan være fra monolayer, sfæroid og sfæroid-avledede kulturer fra samme autologe cellelinje.
- Basseng 3-5 tilsvarende epidermospheres i et 1,5 ml mikrosenterrør. Høst separat autologe SD-NHKc- og 2D-monolagskulturer.
- Isoler totalt RNA fra alle tre gruppene.
- Utfør omvendt transkripsjon med 1 μg totalt RNA.
- Bruk cDNA til å utføre PCR i sanntid ved hjelp av GAPDH som internkontroll (tabell 1).
- Valider amplikonproduktstørrelsen ved agarose gelelektroforese (2 % v/v).
MERK: For transkripsjonsomfattende profilering av epidermospherekulturer ved hjelp av mikroarrayanalyse av hele genomet, isoler total RNA fra massekulturer av en enkelt NHKc-donor og tilsvarende SD-NHKc fra samme donor, i seks replikerer hver. - Vurder RNA-kvalitet ved hjelp av en bioanalyse for å oppnå RNA Integrity Numbers (RIN) fra minst 9,0 til 9,1.
- Utfør mikroarrayforsøk ved å forsterke og biotinylere totale RNA-prøver.
- Omvendt transkribering 100 ng total RNA per prøve til ds-cDNA ved hjelp av NNN tilfeldige primere som inneholder en T7 RNA polymerase promotorsekvens.
- Tilsett T7 RNA-polymerase i cDNA-prøver for å forsterke RNA, og kopier deretter RNA til ss-cDNA. Forring overflødig RNA ved hjelp av RNase H.
- Fragment sscDNA molekyler og etikett med biotin.
- Forsterk merkede prøver i 16 timer ved 45 °C.
- Hybridiser prøver ved hjelp av en hybridiseringsovn og et vaske- og flekksett.
- Vask og flekk hybridiserte matriser.
- Skann matriser ved hjelp av en system- og datamaskinarbeidsstasjon.
- Etter fullføring av matriseskanninger importerer du sondecelleintensitetsfiler (CEL) til uttrykkskonsollprogramvare og behandler på gennivå ved hjelp av bibliotekfil og RMA-algoritme (Robust Multichip Analysis) for å generere CHP-filer.
- Etter å ha bekreftet datakvaliteten i Expression Console, importerer du CHP-filer som inneholder log2-uttrykkssignaler for hver sonde, til en transkripsjonsanalyseprogramvare for å analysere celletypespesifikke transkripsjonssvar ved hjelp av enveis mellom-subjektanalyse av varians.
8. Vurdering av SD-NHKc kolonidannende effektivitet
- Aspirer medier fra plater når cellene når 70-80% samløp. Vask cellene tre ganger i PBS (4 °C) i 5 minutter hver.
- Fest celler med 3 ml 100% metanol (4 °C) i 15 minutter. Vask tre ganger i PBS i 5 min hver.
- Flekkceller i 3 ml 10% Giemsa i 30 min. Vask tre ganger i PBS i 5 min hver. La cellene lufttørke over natten.
- Analyser kolonidannelse neste dag og kvantifisere antall kolonier oppnådd
9. Bestem dobling av SD-NHKc-befolkningen
- Passasje SD-NHKc og tilsvarende autologe 2D monolayer kulturer ved å aspirere gamle medier og vaskeceller i 2ml PBS. Fjern PBS og tilsett 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA i vaskede celler. Inkuber i 5 min eller til alle celler løsner helt (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Tilsett 2 ml soyabønner trypsinhemmer til platen og overfør celler til et 15 ml rør.
- Sentrifuge ved 250 x g i 5 min.
- Fjern den supernatante og resuspend pellet i 12 ml KSFM-scm.
- Frøceller med lav tetthet 1-2 x 104 NHKc i individuelle 10 cm retter og inkuberer over natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet).
- Mateplater med 8 ml KSMF-scm neste dag. Fôr hver 4.
- Seriell passasjeceller 1:5 i 60 cm retter til celleproliferasjonskapasiteten er oppbrukt. Kvantifisere celle levedyktighet ved trypan blå farging. Bestem populasjonsdoblinger ved hvert avsnitt ved hjelp av formelen: log(I/N0) / log2, der N representerer det totale cellenummeret oppnådd ved hver passasje, og N0 representerer antall celler belagt i begynnelsen av eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under hud epidermosphere-analysen blir NHKc-kulturer sådd i agarosebelagte brønner av en 96-brønns plate (Figur 1A). Sfæroiddannende celler skal selv aggregeres innen 48 timer. Autonom sfæroiddannelse kan vurderes så tidlig som 24 timer ved hjelp av et standard invertert fasekontrastmikroskop. hud epidermosphere dannelse og re-plating analyse modell ulike faser av epidermal vev regenerering (Figur 1B). Figur 2 viser høyoppløselige bilder av ulike NHKc-stammer analysert for epidermal sfæroiddannende evne i 3D-kultur. Det er viktig å undersøke cellene for tett sfæreformet aggregering, da dette er et kjennetegn på spontan sfæroiddannelse. Vi fant det nødvendig å bruke mer enn 2 x 104 celler for å sikre riktig spontan aggregering. Ikke-sfærisk celleaggregering, for eksempel sett i stammer Figur 2A, regnes ikke som tilstrekkelig epidermosfæredannelse. Plating ikke-sfæroid danner celle suspensjoner tilbake i 2D monolayer kultur sjelden resulterer i levedyktig NHKc cellevekst. Plating av epidermospheres i 2D-kultur resulterer imidlertid i spredning av små størrelser levedyktig NHKc (Figur 3). Bilder av epidermospheres og SD-NHKc kan vises og overvåkes ved hjelp av et standard invertert fasekontrastmikroskop. Det er viktig å opprettholde disse kulturene under 100% samløp, da dette kan betydelig impar deres vekst og stamcelletilstand i kultur (Figur 3E-F). Prosessen med epidermal sfæroiddannelse kan funksjonelt spores på enkeltcellenivå ved å transfektere celler med en fluorescerende reporter (Figur 4A-C). Under optimale forhold er keratinocytt subpopulation primært beriket i SD-NHKc kulturer Integrinα6hi/ EGFRlo celler. Disse cellene utgjør vanligvis omtrent 25% av alle SD-NHKc-kulturer og kan lett isoleres av FACS (Figur 4D). Det er imidlertid viktig å etablere foroversidespredningsområde (FSC-A) og sidespredningsområdeporter (SSC-A) for å utelukke dobler (Figur 4D). Videre karakterisering av denne stammelignende keratinocytt subpopulasjonen kan oppnås ved immunfluorescerende farging analyse av epidermale stamcellemarkøruttrykk, som basal cytokeratin 14 (K14) og tumorprotein 63 (P63) (Figur 4F; Tabell 2).
Figur 1: Dyrking av NHKc epidermospheres i 3D suspensjon. (A) Skjematisk representasjon av epidermal sfæroid re-plating analyse tilpasset fra 11. (B) Representative fasekontrastbilder av NHKc-kulturer, epidermale sfæroider og SD-NHKc på hvert sekvensielle trinn i epidermal sfæroid re-plating analyse. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vurdering avvekst i hudepæren. (A) Bilder av seks individuelle sfæroid ikke-formende og (B) sfæroiddannende NHKc-stammer ved flytende 3D-suspensjon. (C) Epidermospheres oppnådd ved hjelp av ulike mengder NHKc. (D) Kvantifisering av gjennomsnittlig epidermosphere størrelse oppnådd ved hjelp av ulike mengder NHKc i flytende 3D suspensjon kultur. Stolper angir standardavvik. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Voksende sfæroid-avledede kulturer. (A) Tidskursfasekontrastavbildning av SD-NHKc monolagkulturer som forplanter seg fra en vedlagt epidermosphere 24 t, (B) 48 h, (C) 72 h og (D) 96 h etter re-plating i 2D plastkultur. (E) SD-NHKc kulturer på 80% samløp og (F) 100% samløp 15 og 20 dager etter replating i henholdsvis 2D plastkultur. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Karakterisering av sfæroid-avledede (SD) underpopulasjoner. (A) Skjematisk representasjon av 3D-cellesporingsanalyse av epidermospheres in vitro som beskrevet av Woappi et al. 202012. (B) EGFP-uttrykkende epidermospheres 2 h og (C) 24 h etter sådd i 3D-kultur. (D) Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) av SD-NHKc subpopulations. Omtrent 1/4av alle celler skal være integrinα6hi/EGFRlo. (E) Integrinα6hi/EGFRlo subpopulations produserer keratinocytt holokloner. (F) Immunfluorescent farging analyse av basal epitelial stamcelle markør uttrykk i Integrinα6hi/EGFRlo celler. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primer-sekvens (5-3') | ||
| Gennavn | Fremre primer | Omvendt primer |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| F.EKS. | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tabell 1. Skisserer PCR primer sekvenser som brukes til påvisning av utvalgte gener involvert i neonatal keratinocytt plastisitet.
| KulturTilstand | Utseende på fasekontrast | Immunstaining | FACS-analyse | Transkripsjonssignatur | |
| Homeostatisk vedlikehold | 2D-monolag | Små celler < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Epidermalt vedlikehold (K14, P63, IVL, K10) |
| Differensiering stopp/reversering | 3D-sfæroid | Kompakt multicellulær aggregat > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | N/A | De-differensiering: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Mobilitet med stressavledning | 3D-til-2D sfæroid vedlegg | Diffuse små celler (< 20 μm) fra sfæroid kant | K14, P63, Ki-67 | ITGα6hei/EGFPmed | Spredning av hudceller: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Vev restaurering | 3D-til-2D sfæroid monolag | Forplantning av små celler < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hei/ EGFPlo og ITGα6hei/ EGFPhei | Dannelse av epidermis: K14, IVL, FLG |
Tabell 2. Strategier for fenotypisk og molekylær karakterisering av epidermal sfæroid replating analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av 3D sfæroide kultursystemer har hatt bred nytte for å vurdere cellestamme. Disse systemene har vist seg å forbedre berikelsen av vevsstammeceller13, men deres nytte for studiet av menneskelige epidermale stamceller har blitt begrenset utforsket. Her beskriver vi en strategi for å berike humane keratinocytt stamceller ved hjelp av 3D-kulturteknikker. I dette systemet dyrkes NHKc som selvmontering av multicellulære sfæroidfjæringer, bestående av flere keratinocyttundertyper suspendert på toppen av agarose senger som inneholder KSFM-scm. Oppsettet for denne protokollen er tidssensitivt ettersom agar polymeriserer raskt ved romtemperatur. Forvarming av serologiske pipetter, mikropipettespisser og agar/ celleblandingsrøret, samt media til 42 °C, kan redusere for tidlig polymerisering dramatisk. Vi observerte at plassering av 96-brønnsplaten i 4 °C kort tid etter tilsetning av agar/medieblanding til brønner kan øke polymerisasjonen betraktelig og sikre at agarputen er tilstrekkelig fast for etterfølgende sådd av celler. Det er viktig å opprettholde platen) nivå til enhver tid under polymerisasjonsprosessen, da dårlig polymerisering av agar / medieblandingen vil resultere i celler sådd eller vokser inne i den myke agaren, og annullerer analysen.
Også skissert i denne protokollen presenterer vi en strategi for å forplante epidermospheres i 2D monolayer kultur for å generere stamcelle-avledet celler. Epidermal sfæroid re-plating analyse beriker for en stamcelle-lignende subpopulation av integrinα6hi/ EGFRlo keratinocytter. Disse cellene kan brukes til å studere epidermal rekonstruksjon, psoriasis eller cellulær neoplasi11,12,14. Integrinα6hi/EGFRlo keratinocytter kan også lett isoleres av FACS og karakteriseres av immunfluorescerende farging. Når vi utførte slike eksperimenter, fant vi det nyttig å bruke usortert autologe 2D monolayer celler som kontroller., hud SCC cellelinjer er et godt alternativ Hvis disse er utilgjengelige.
Oppsummert viser denne rapporten at human epidermal sfæroid re-plating modeller keratinocyte regenerativ plastisitet in vitro, som den fanger hver av de fire fasene av regenerering: homeostatisk vedlikehold, differensiering reversering, stress avstamming mobilitet, og vev restaurering. En begrensning ved agarbasert sfæroid selvmontering er imidlertid at ikke alle NHKc-flekker er i stand til spontant å danne sfæroider. Den hengende drop-metoden15 er en god alternativ strategi for å overvinne denne utfordringen og å tvinge frem multicellulær sfæroiddannelse. Denne analysen kan også multiplekses med muskel-, stromal- eller immunceller for å få ytterligere innsikt i bidraget fra ulike cellepopulasjoner på epidermal regenerering. det ville være interessant å undersøke om tilsetning av Matrigel i agaren kunne forbedre epidermosfærens overlevelse og styrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke økonomiske forhold å avsløre.
Acknowledgments
UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) ga tilgang til bilde- og cellesorteringsutstyr og teknisk assistanse. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd 1R21CA201853. MCF og IRF får delvis støtte fra NIH grant P20GM103499, SC INBRE. MCF får også støtte fra NIH grant P20GM109091. Yvon Woappi ble delvis støttet av NIH grants 2R25GM066526-06A1 (PREP) og R25GM076277 (IMSD), og av et stipend av Grace Jordan McFadden Professors Program ved UofSC. Geraldine Ezeka og Justin Vercellino ble støttet av NIH-tilskudd 2R25GM066526-10A1 (PREP) ved UofSC. Sean M. Bloos ble støttet av Magellan Scholar Award 2016 ved UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
