Summary
Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.
Abstract
A desregulação epitelial é um nó para uma variedade de condições e doenças humanas, incluindo ferimentos crônicos, inflamação e mais de 80% de todos os cânceres humanos. Como tecido forro, o epitélio da pele é frequentemente sujeito a lesões e tem se adaptado evolutivamente adquirindo a plasticidade celular necessária para reparar tecido danificado. Ao longo dos anos, vários esforços foram feitos para estudar a plasticidade epitelial usando modelos in vitro e ex vivo baseados em células. No entanto, esses esforços têm sido limitados em sua capacidade de recapitular as várias fases da plasticidade celular epitelial. Descrevemos aqui um protocolo para a geração de esferoides epidérmicos 3D e células derivadas de esferoides epidérmicos de queratinócitos humanos neonatais. Este protocolo descreve a capacidade das culturas eferóides epidérmicas de modelar funcionalmente estágios distintos da plasticidade generativa de queratinócitos e demonstra que a re-platide epidérmica pode enriquecer culturas heterogênicas normais de queratinócitos (NHKc) para subpopulações intenα6hi/EGFRlo queraatinóte com características avançadas de tronco. Nosso relatório descreve o desenvolvimento e manutenção de um sistema de alto rendimento para o estudo da plasticidade da queratinócito da pele e da regeneração epidérmica.
Introduction
O epitélio estratificado dos mamíferos é a arquitetura epitelial mais complexa em todos os sistemas vivos e está frequentemente sujeito a danos e lesões. Como um tecido protetor, o epitélio estratificado evoluiu para gerar uma resposta complexa e eficaz de danos teciduais. Após a lesão, essas células devem ativar programas de plastifica de linhagem, que permitem migrar para o local lesionado e realizar o reparo1,2,3. Essa resposta multifacetada ocorre em várias etapas sequenciais que permanecem mal compreendidas.
Um grande obstáculo no estudo do intrincado processo de regeneração epitelial está na escassez de sistemas de modelos de alto rendimento que podem capturar atividades celulares dinâmicas em estágios definidos de regeneração celular. Enquanto os modelos de mouse in vivo oferecem uma visão relevante sobre a cicatrização de feridas e mais intimamente recapitulam o processo regenerativo humano, seu desenvolvimento exige esforços trabalhosos e custo significativo, limitando sua capacidade de rendimento. Existe, portanto, uma necessidade crítica de estabelecer sistemas que permitam a investigação funcional da regeneração do tecido epitelial humano em alta escala de rendimento.
Nos últimos anos, várias tentativas foram feitas para enfrentar o desafio de escalabilidade. Isso é visto através de uma grande expansão de modelos inovadores baseados em células in vitro e ex vivo que imitam de perto o contexto regenerativo in vivo. Isso inclui avanços nas culturas organ-on-chip4, esferoide5,organoide6e organotípica7. Esses sistemas baseados em células 3D oferecem vantagens únicas e apresentam limitações experimentais distintas. Até o momento, a cultura esferoide continua sendo o modelo de cultura celular 3D mais econômico e amplamente utilizado. E embora vários relatórios tenham indicado que culturas esferoides podem ser usadas para estudar características de células-tronco da pele, esses estudos têm sido conduzidos em grande parte com tecido animal8,9, ou com fibroblastos dérmicos10,sem praticamente nenhum relato caracterizando completamente as propriedades regenerativas das culturas esferoides epidérmicas humanas. Neste protocolo detalhamos o desenvolvimento funcional, a cultura e a manutenção das culturas eferóides epidérmicas de queratinócitos humanos normais (NHKc). Descrevemos igualmente a utilidade deste sistema para modelar as fases sequenciais da regeneração epidérmica e da plasticidade das células-tronco queratinócitos in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo de coleta e manuseio de amostras de pele e isolamento de queratinócitos humanos foi revisado pela Universidade da Carolina do Sul (UofSC) IRB e classificado como "pesquisa não envolvendo seres humanos", pois os espécimes de prepúcio eram descartes cirúrgicos produzidos durante procedimentos cirúrgicos de rotina (circuncisão de meninos recém-nascidos) e eram completamente desprovidos de identificação de informações. O protocolo também foi revisado e aprovado pelo Comitê de Biossegurança da UofSC regularmente, e todos os funcionários do laboratório foram submetidos a treinamento de biossegurança laboratorial. Todos os procedimentos foram realizados em concordância com as normas de segurança e ética da UofSC.
1. Isolamento e cultura de queratinócitos humanos a partir de tecido neonatal de prepúcio
- Prepare o meio de lavagem adicionando 0,1 M de tampão HEPES a 500 mL de meio KSFM e ajuste-o a um pH de 7,2. Esterilize o meio em um filtro de vácuo de 500 mL (tamanho de poros de 0,22 μm). O meio basal MCDB 153-LB também pode ser usado como uma solução alternativa de lavagem no lugar do KSFM.
- Em uma capa de fluxo laminar, lave o prepúcio neonatal com 5 mL de mídia de lavagem em um tubo cônico de 50 mL. Repita duas vezes.
- Transfira prepúcio lavado para uma placa de Petri estéril. Usando um bisturi e fórceps, raspe os tecidos adiposos e soltos da camada dérmica. Relave o prepúcio com 5 mL de mídia de lavagem em um tubo cônico de 50 mL.
- Coloque o lado da epiderme prepúcio em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de enzima despase diluída em mídia de lavagem (50 U/mL).
- Transfira a placa para uma incubadora por 4 horas (37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade).
- Remova o prepúcio da incubadora e, em condições estéreis, transfira-o para uma placa de Petri. Usando fórceps finos, separe a epiderme da camada de derme.
- Coloque a epiderme em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Usando um tubo sorológico de 5 mL, esmague mecanicamente a epiderme flutuante. Incubar por 15 min a 37 °C com vórtice periódico para 5 s a cada 5 min.
- Após a incubação, adicione 2 mL de inibidor de trippsina de soja e misture por pipetação para neutralizar a trippsina.
- Suspensão celular centrífuga por 2 min a 450 x g, e depois por 8 min a 250 x g.
- Remova detritos flutuantes com fórceps, tomando cuidado para não desalojar a pelota celular. Aspirar cuidadosamente o supernaente da pelota celular.
- Resuspend pelotas em 12 mL de meio KSFM-scm completo e placa em um prato de 10 cm. Incubar prato durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).
- No dia seguinte, remova o meio usando uma pipeta aspirando e substitua por 12 mL completo KSFM-scm. Repita nos dias 4 e 7.
- Para manter o crescimento ideal das culturas normais de queratinócitos humanos (NHKc), as células de passagem 1:5 no dia 10 para evitar que as células atinjam maiores que 80% de confluência.
2. Gerando culturas de epidermófera da pele in vitro
- Prepare uma mistura de 5% de agarose adicionando 2,5 g de agarose a 50 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS), em uma garrafa de vidro de 50 mL. Garrafa de autoclave sob ciclo líquido. Deixe esfriar até a temperatura ambiente.
- Para preparar as placas, coloque a garrafa de vidro resfriada contendo solução agarose em um béquer plástico 1 L recheado com 200 mL de água deionizada (dH2O). Derreter a mistura de agarose em um micro-ondas de nível de pesquisa por até 2 minutos, misturando o ágar a cada 60 s, inclinando suavemente a garrafa de um lado para o outro.
ATENÇÃO: O derretimento do ágar no micro-ondas fará com que o recipiente de frasco fique extremamente quente, resultando em acúmulo de pressão. Liberar acúmulo de pressão a cada 30 s. Use equipamentos de proteção adequados para evitar ferimentos. - Adicione 3 mL de 5% de relados a 12 mL KSFM-scm pré-equipado a 42 °C para uma concentração final de 1% de agarose (wt/vol).
Opcional: pré-aqueça as pipetas sorológicas e as pontas da pipeta para evitar a polimerização prematura do ágar macio. - Pipeta rápida 200 μL da mistura de 1% de ágar em poços individuais de uma placa de fundo redondo de 96 poços usando um pipettor multicanal(Figura 1A). Deixe a placa em ambiente estéril a 25 °C por 4h para permitir que a agarose polimerize completamente.
NOTA: A experimentação pode ser interrompida aqui e continuada no dia seguinte. As placas de agarose polimerizadas podem ser mantidas a 37 °C até 24 h ou a 4 °C por até 48 h quando seladas com envoltório de parafilm. Placa quente a 37 °C em uma incubadora umidificada por pelo menos 1 h antes de usar. - Passagem de NHKc formador de spheroids aspirando mídia e células de lavagem em 2 mL de PBS. Aspire PBS e adicione 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar por 5 min a 37 °C ou até que todas as células se desprendem completamente. Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e lave as células da placa em um tubo de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 5 min.
- Resuspend pelotas em 1 mL de PBS. Quantifique a viabilidade celular usando coloração azul trypan e um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
- Aliquot 2 x 104 NHKc em 100 μL de KSFM-scm e semente em poços individuais de placa redonda de 96 poços previamente preparados. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).
- Usando um microscópio de contraste de fase invertida, analise bem semeado para formação da epidermófera.
NOTA: As epidermosfófilas humanas dos queratinócitos humanos normais podem permanecer viáveis na cultura de suspensão 3D por até 96 h, embora com uma diminuição considerável na viabilidade celular(Figura 2).
3. Ensaio de reesplação esferoide epidérmico
- 24-48 h após a formação da epidermófera 3D, adicione 4 mL de KSFM-scm pré-armado a um prato de 6 cm. Use uma ponta de pipeta de 1 mL larga para transferir um único esferoide para a placa, garantindo não quebrá-lo. Alternativamente, amplie uma ponta de pipeta de 1 mL usando uma lâmina de barbear estéril para cortar a ponta.
- Incubar a placa durante a noite (37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade).
- Analise o esferoide semeado para fixação na parte inferior da placa e observe para propagar células usando um microscópio de contraste de fase invertida(Figura 3). Alimentar células a cada 96 h removendo suavemente 2 mL da mídia dentro da placa e adicionando lentamente 2 mL de mídia KSFM-scm fresca à placa.
- Passagem spheroid-derivado (SD) NHKc uma vez que atingem 70-80% de confluência e continuam com o ensaio de escolha. Monitore o SD-NHKc com frequência para evitar que as células atinjam total confluência na cultura, pois isso resulta em diferenciação prematura e prisão de crescimento celular(Figura 3E-F).
- O ensaio de reseferóide epidérmico modelos de ensaio mediado por queratinócitos, capturando cada uma das fases sequenciais chave da plasticidade regenerativa epidérmica: a) manutenção homeostática, b) mobilidade de linhagem de estresse/mobilidade de linhagem de estresse d (Figura 1B; Tabela 2). Este ensaio também pode ser usado para produzir populações celulares para culturas organotípicas de jangadas ou para modelar neoplasia mediada pelo HPV, como demonstrado em nosso trabalho anterior 11,12.
Rastreamento celular de fluorescência 4.3D
- Em um prato de 6 cm, transfeto spheroid-formando culturas 2D monocamada NHKc com 1 μg de pMSCV-IRES-EGFP vetor plasmid carregando o gene de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP). Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade) microscópio(Figura 4A).
NOTA: É importante que a transfecção seja concluída em condições livres de antibióticos sem soro. - Sem remover a mistura de transfecção, adicione 2 mL de KSFM-scm pré-armado às células. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).
- Aspire todas as mídias de transfecção de células de placa e alimentação com 3 mL de KSFM-scm pré-armados. Avalie a presença de células expressas por EGFP sob o canal FITC de um microscópio fluorescente.
- Passagem e semente 2 x 104 células transfectadas de EGFP em poços individuais de uma placa de fundo redondo previamente preparada. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade). Visualize e monitore o movimento decélulas eferóides EGFP sob o canal FITC de um microscópio de fluorescência(Figura 4B-C).
- 24 h após o revestimento, adicione 3 mL de KSFM-scm pré-armado a um prato de 6 cm. Use uma ponta de pipeta de 1 mL larga para transferir um único esferoide para a placa, garantindo não quebrá-lo. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).
- Observe e analise a propagação SD-NHKcEGFP usando um microscópio de fluorescência. Alimentar células a cada 96 h removendo suavemente 2 mL da mídia dentro da placa e adicionando lentamente 2 mL de mídia KSFM-scm fresca à placa.
- Colher SD-NHKCEGFP para isolamento facs ou ensaios de escolha.
5. Caracterização de subséduas derivadas de esferoides (SD) pela FACS
- Passagem SD-NHKc e culturas de monocamadas 2D autólogas correspondentes aspirando mídia antiga e células de lavagem em 2 mL de PBS. Remova o PBS e adicione 2 mL de 0,25% trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar a 37 °C por 5 min ou até que todas as células se desprendem completamente.
- Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e transfira células para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 5 min.
- Resuspend pelotas em 1 mL de PBS. Quantifique a viabilidade celular usando o azul trypan e um contador automatizado de células do hemócitometro.
- Aliquot 100 μL contendo 0,1-4 x 106 células NHKc a tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo em um ambiente escuro, criado desligando luzes brilhantes dentro do capô laminar.
- Adicione 2 μL de anti-integrinα6 conjugados fitc e 2 μL de anti-EGFR conjugado pe aos tubos para obter uma diluição de 1:50. Prepare um tubo sem anticorpos adicionados para servir como o controle não manchado. Incubar tubos no gelo no escuro ou a 4 °C por 30 min. O uso de contas ou uma linha SCC da pele pode servir como controle positivo, já que as células SCC da pele expressam níveis elevados de integrinα6 e EGFR.
- Realize a análise de citometria de fluxo usando o citômetro de fluxo de escolha contendo lasers apropriados.
- Use os controles negativos e positivos para estabelecer portões. Classificar a subpopulação de células delo integrinα6/EGFR; estas são a fração de células-tronco epidérmicas. Integrinα6hi/EGFRhi cells são a fração celular progenitora proliferativa. As célulasde oi integrinα6lo/EGFR são a fração celular progenitora comprometida(Figura 4D). A classificação dos tubos FACS deve conter pelo menos 1 mL de KSFM-scm gelado.
- Teste para capacidade proliferativa de subpopulações celulares classificadas transferindo o conteúdo de cada tubo de classificação respectivo para um tubo cônico de 15 mL contendo 10x o volume de células classificadas em PBS. NOTA: É importante remover todas as células presas à borda, encanar a parede do tubo FACS de classificação várias vezes, pois os queratinócitos podem muitas vezes aderir lá.
- Centrifugar tubos de 15 mL a 250 x g por 5 min. Remova a pelota supernascida e resuspendida em 12 mL de KSFM-scm. Transfira as células resuspended em uma placa de 6 cm e incubar durante a noite (37 °C, 5% DE CO2,95% de umidade).
- No dia seguinte, remova a mídia nas placas e adicione 8 mL de KSFM-scm pré-aquecido. Incubar a 37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade. Re-alimentar células com 12 mL de meio a cada 3 dias até 70-80% confluentes(Figura 4E).
6. Imunofluorescência e coloração de epidermosférteis para marcadores de células-tronco basais
- Transfira epidermoses para tampas revestidas com poli-lisina. Permita que o SD-NHKc se propague até 75% de confluente.
- Lave as células duas vezes em PBS (4 °C) por 5 min cada.
- Fixar células com 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos à temperatura ambiente.
- Células permeabilizes com 0,5% Triton X-100 em 1% de glicocina. Bloqueie usando 0,5% de BSA e 5% soro de cabra por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Incubar amostras com anticorpos contra P63 (1:200) e citokeratina 14 (1:200) em solução de bloqueio durante a noite a 4 °C.
- Lave três vezes com PBS (4 °C) contendo Interpol 20 (PBST), seguida de incubação com anticorpos secundários FITC-e Alexa 568 (diluição de 1:1000).
- Núcleos de manchas com 4', 6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) (diluição 1:5000) antes da montagem das células.
- Observe células usando um microscópio com capacidade fluorescente com linhas laser FITC e PE(Figura 4F).
7. Análise transcricional das culturas da epidermófera
- Configurar placas triplicadas de culturas NHKc de baixa passagem para isolar o RNA pode ser de culturas derivadas de monóbóias, esferoides da mesma linha celular autóloga.
- As epidermómos correspondentes da piscina 3-5 em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Colher separadamente culturas autólogas de SD-NHKc e monocamadas 2D.
- Isole o RNA total dos três grupos.
- Realize a transcrição reversa com 1 μg de RNA total.
- Utilizando cDNA, execute PCR em tempo real, utilizando GAPDH como controle interno(Tabela 1).
- Validar o tamanho do produto amplicon por eletroforese de gel agarose (2% v/v).
NOTA: Para o perfil transcriômico de culturas epidermóferas usando análise de microarray de genoma inteiro, isole o RNA total das culturas de massa de um único doador NHKc e correspondente SD-NHKc do mesmo doador, em seis réplicas cada. - Avalie a qualidade do RNA usando um bioanalílise para alcançar os Números de Integridade do RNA (RIN) variando de pelo menos 9,0 a 9,1.
- Realize experimentos de microarray amplificando e biotiningando amostras totais de RNA.
- Transcreva reversa 100 ng de RNA total por amostra em ds-cDNA usando primers aleatórios NNN contendo uma sequência de promotor de polimerase T7 RNA.
- Adicione a polimerase T7 RNA às amostras de cDNA para amplificar o RNA e, em seguida, copie o RNA para ss-cDNA. Degrade o excesso de RNA usando RNase H.
- Fragmentar moléculas de SSCDNA e rotular com biotina.
- Amplie amostras rotuladas por 16 h a 45 °C.
- Hibridize amostras usando um forno de hibridização e um kit de lavagem e mancha.
- Matrizes hibridizadas de lavagem e coloração.
- Digitalize os arrays usando um sistema e uma estação de trabalho do computador.
- Após a conclusão das varreduras de array, importe arquivos de intensidade celular (CEL) em software de console de expressão e processe no nível genético usando arquivo de biblioteca e algoritmo robust Multichip Analysis (RMA) para gerar arquivos CHP.
- Depois de confirmar a qualidade dos dados no Expression Console, importe arquivos CHP contendo sinais de expressão log2 para cada teste em um software de análise de transcriptome para analisar respostas transcricionais específicas do tipo celular usando uma análise unidirecional entre os sujeitos de variância.
8. Avaliação da eficiência formadora de colônias SD-NHKc
- Aspirar a mídia das placas quando as células atingirem 70-80% de confluência. Lave as células três vezes em PBS (4 °C) por 5 min cada.
- Fixar células com 3 mL de 100% de metanol (4 °C) por 15 min. Lave três vezes em PBS por 5 min cada.
- Células de manchas em 3 mL de 10% Giemsa por 30 min. Lave três vezes em PBS por 5 min cada. Deixe as células secarem durante a noite.
- Analisar a formação de colônias no dia seguinte e quantificar o número de colônias obtidas
9. Determinar duplicações populacionais do SD-NHKc
- Passagem SD-NHKc e culturas de monocamadas 2D autólogas correspondentes aspirando mídia antiga e células de lavagem em PBS de 2mL. Remova o PBS e adicione 2 mL 0,25% trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar por 5 min ou até que todas as células se desprendem completamente (37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade).
- Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e transfira células para um tubo de 15 mL.
- Centrifugar a 250 x g por 5 min.
- Remova a pelota supernasce e resuspend em 12 mL de KSFM-scm.
- Células de sementes em baixa densidade 1-2 x 104 NHKc em pratos individuais de 10 cm e incubam durante a noite (37 °C, 5% DE CO2,95% de umidade).
- Placas de alimentação com 8 mL KSMF-scm no dia seguinte. Alimente a cada 4 dias até pelo menos 25% confluentes, depois se alimente a cada 2 dias.
- Células de passagem em série 1:5 em 60 cm pratos até que a capacidade proliferativa celular esteja esgotada. Quantifique a viabilidade celular por manchas azuis de trypan. Determinar duplicações populacionais em cada passagem usando a fórmula: log(N/N0) / log2, onde N representa o número total de células obtidas em cada passagem e N0 representa o número de células banhadas no início do experimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Durante o ensaio da epidermófera da pele, as culturas NHKc são semeadas em poços revestidos de agarose de uma placa de 96 poços(Figura 1A). As células formadoras de esferoides devem se auto-agregar dentro de 48h. A formação de esferoides autônomos pode ser avaliada a partir de 24 horas usando um microscópio de contraste de fase invertido padrão. formação da epidermófera da pele e re-plating modelo de ensaio várias fases da regeneração do tecido epidérmico(Figura 1B). A Figura 2 mostra imagens de alta resolução de várias cepas NHKc avaliadas para esferoide epidérmicos que formam habilidade na cultura 3D. É importante examinar as células para uma densa agregação em forma de esfera, pois esta é uma marca da formação espontânea de esferoides. Achamos necessário usar mais de 2 x 104 células para garantir a agregação espontânea adequada. A agregação celular não esférica, como vista em cepas Figura 2A,não é considerada formação adequada da epidermófera. O revestimento não-esferóide formando suspensões celulares de volta na cultura de monocamadas 2D raramente resulta em crescimento viável de células NHKc. No entanto, o revestimento de epidermosféres na cultura 2D resulta na proliferação de NHKc viável de pequeno porte (Figura 3). Imagens de epidermosféricos e SD-NHKc podem ser visualizadas e monitoradas usando um microscópio de contraste de fase invertido padrão. É importante manter essas culturas abaixo de 100% de confluência, pois isso pode efetivar consideravelmente seu crescimento e o estado de células-tronco na cultura (Figura 3E-F). O processo de formação epidérmica de esferoides pode ser rastreado funcionalmente ao nível de célula única por transfecção de células com um repórter fluorescente(Figura 4A-C). Em condições ideais, a subpopulação de queratinócitos enriquecida principalmente nas culturas SD-NHKc são células delo Integrinα6hi/EGFR. Essas células geralmente compõem cerca de 25% de todas as culturas SD-NHKc e podem ser prontamente isoladas por FACS (Figura 4D). No entanto, é importante estabelecer portões de área de dispersão lateral (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A) para excluir os doublets(Figura 4D). Uma caracterização adicional dessa subpopulação de queratinócitos semelhante a tronco pode ser alcançada pela análise de coloração imunofluorescente da expressão do marcador de células-tronco epidérmicas, como citoquetatina basal 14 (K14) e proteína tumoral 63 (P63) (Figura 4F; Tabela 2).
Figura 1: Cultivo de epidermosfóricas NHKc em suspensão 3D. (A) Representação esquemática do ensaio de re-revestimento esferoide epidérmico adaptado a partir de 11. (B) Imagens de contraste de fase representativas das culturas NHKc, esferoides epidérmicos e SD-NHKc em cada etapa sequencial do ensaio de re-plating epidérmico. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação do crescimento da epidermófera da pele. (A) Imagens de seis cepas de Esferoides individuais não formadoras e (B) formadores de esferoide nHKc em suspensão 3D flutuante. (C) Epidermosféres obtidas utilizando várias quantidades de NHKc. (D) Quantificação do tamanho médio da epidermófera obtidas utilizando diferentes quantidades de NHKc na cultura flutuante de suspensão 3D. As barras indicam desvio padrão. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Culturas derivadas de esferoides em crescimento. (A) Imagem de contraste de fase do curso de tempo das culturas monocamadas SD-NHKc propagando-se de uma epidermófera anexada 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h e (D) 96 h após re-plating na cultura plástica 2D. (E) Culturas SD-NHKc com 80% de confluência e (F) 100% confluência 15 e 20 dias após replacamento na cultura plástica 2D, respectivamente. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização de subsélidas derivadas de spheroid (SD). (A) Representação esquemática do ensaio de rastreamento de células 3D de epidermosferes in vitro, conforme descrito por Woappi et al. 202012. (B) Epidermosferes expressas por EGFP 2h e (C) 24 h após semeadura na cultura 3D. (D) Fluorescência ativada classificação celular (FACS) de subpopulações SD-NHKc. Aproximadamente 1/4 de todas as células devem ser integrinα6hi/EGFRlo. (E) Integrinα6hi/EGFRlo subpopulações produzem holoclones queratinócitos. (F) Análise de coloração imunofluorescente da expressão do marcador de células-tronco epiteliais basais em célulaslo Integrinα6hi/EGFR. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Sequência de primer (5'-3') | ||
| Nome do gene | Primer avançado | Primer reverso |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| EGFR | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAT | GGCTGTTGTCATACTCTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tabela 1. Descreve as sequências de primer PCR utilizadas para a detecção de genes selecionados envolvidos na plasticidade de queratinócitos neonatais.
| Condição de cultura | Aparência de contraste de fase | Imunostaining | Análise FACS | Assinatura transcriômica | |
| Manutenção homeostática | Monocamadas 2D | Pequenas células de tamanho < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Manutenção epidérmica (K14, P63, IVL, K10) |
| Parada/inversão de diferenciação | Esferoide 3D | Agregado multicelular compacto > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | N/A | De-diferenciação: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Mobilidade de linhagem de estresse | Acessório esferoide 3D-para-2D | Difusão de células de pequeno porte (< 20 μm) da borda esferoide | K14, P63, Ki-67 | ITGα6oi/EGFPmed | Proliferação de células da pele: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Restauração de tecidos | Monocamadoreira esferoide 3D-to-2D | Propagando células de pequeno porte < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo e ITGα6hi/EGFPhi | Formação de epiderme: K14, IVL, FLG |
Tabela 2. Estratégias para caracterização fenotípica e molecular do ensaio de ressarcimento esferoide epidérmico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O uso de sistemas de cultura esferoide 3D tem tido ampla utilidade na avaliação da haste celular. Esses sistemas têm sido demonstrados para melhorar o enriquecimento das células-tronco teciduais13, mas sua utilidade para o estudo de células-tronco epidérmicas humanas tem sido explorada limitadamente. Aqui, descrevemos uma estratégia para enriquecer células-tronco de queratinócitos humanos usando técnicas de cultura 3D. Neste sistema, o NHKc é cultivado como suspensões eferóides multicelulares auto-montados, compostos por vários subtipos de queratinócitos suspensos em cima de camas de ágarose contendo KSFM-scm. A configuração deste protocolo é sensível ao tempo, pois o ágar polimeriza rapidamente à temperatura ambiente. Pipetas sorológicas pré-aquecimento, pontas de micropipette e o tubo de mistura de ágar/célula, bem como a mídia a 42 °C, podem reduzir drasticamente a polimerização prematura. Observamos que colocar a placa de 96 poços em 4 °C logo após a adição de mistura de ágar/mídia aos poços pode acelerar consideravelmente a polimerização e garantir que a almofada de ágar seja suficientemente firme para a subsequente semeadura das células. É importante manter o nível da placa em todos os momentos durante o processo de polimerização, pois a má polimerização do mix de ágar/mídia resultará em semeadura de células ou crescimento dentro do ágar macio, anulando o ensaio.
Também delineado neste protocolo, apresentamos uma estratégia para propagar epidermosféricas na cultura de monocamadas 2D para gerar células derivadas de spheroid semelhantes a troncos. O ensaio de reescoramento epidérmico de reescoramento enriquece para uma subpopulação semelhante a células-tronco de integrinα6hi/EGFRlo queratinócitos. Essas células podem ser usadas para estudar reconstrução epidérmica, psoríase ou neoplasia celular11,12,14. Integrinα6oi/EGFRlo queratinócitos também podem ser facilmente isolados pelo FACS e caracterizados por coloração imunofluorescente. Ao realizar tais experimentos, achamos útil usar células monocamadas 2D auto-variadas como controles., as linhas celulares SCC da pele são uma boa alternativa se estas não estiverem disponíveis.
Em resumo, este relatório demonstra que os modelos de reequete esferoide epidérmico humanos reesquem modelos de plasticidade regenerativa in vitro,pois captura cada uma das quatro fases da regeneração: manutenção homeostática, reversão de diferenciação, mobilidade de linhagem de estresse e restauração de tecidos. No entanto, uma limitação da auto-montagem esferoide baseada em ágar é que nem todas as manchas de NHKc são capazes de formar espontaneamente esferoides. O método de queda de suspensão15 é uma boa estratégia alternativa para superar esse desafio e forçar a indução da formação de esferoides multicelulares. Este ensaio também pode ser multiplexado com células musculares, estromais ou imunes para obter mais informações sobre a contribuição de várias populações celulares na regeneração epidérmica. seria interessante explorar se a adição de Matrigel no ágar poderia aumentar a sobrevivência e potência da epidermófera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm relações financeiras para divulgar.
Acknowledgments
A UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) forneceu acesso a equipamentos de triagem de imagens e células e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão 1R21CA201853. O MCF e o IRF recebem apoio parcial da concessão do NIH P20GM103499, SC INBRE. O MCF também recebe apoio da concessão do NIH P20GM109091. Yvon Woappi foi apoiado em parte por bolsas nih 2R25GM066526-06A1 (PREP) e R25GM076277 (IMSD), e por uma Bolsa pelo Programa de Professores Grace Jordan McFadden da UofSC. Geraldine Ezeka e Justin Vercellino foram apoiados por bolsas NIH 2R25GM06526-10A1 (PREP) na UofSC. Sean M. Bloos foi apoiado pelo Prêmio Magellan Scholar 2016 na UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
