Summary
المادة يقدم μTongue (microfluidics على اللسان) جهاز للتصوير الوظيفي خلية الذوق في الجسم الحي عن طريق دمج microfluidics في نافذة التصوير داخلفيتال على اللسان.
Abstract
المجهر الفلوري داخل الحتمية هو أداة تستخدم على نطاق واسع لدراسة الديناميات متعددة الخلايا في حي. ومع ذلك، فإنه لم يستخدم بنجاح في الجهاز الحسي الذوق. من خلال دمج microfluidics في إطار تصوير اللسان داخل الجسم ، يوفر μTongue صورا وظيفية موثوقة لخلايا الذوق في الجسم الحي تحت التعرض الخاضع للرقابة لأجهزة التثانت المتعددة. في هذه الورقة، يتم تقديم إجراء مفصل خطوة بخطوة لاستخدام نظام μTongue. هناك خمسة الأقسام الفرعية : إعداد حلول التسانت ، وإنشاء وحدة microfluidic ، تركيب العينة ، والحصول على بيانات الصورة الوظيفية ، وتحليل البيانات. كما يتم تقديم بعض النصائح والتقنيات لحل القضايا العملية التي قد تنشأ عند استخدام μTongue.
Introduction
يستخدم المجهر الفلوري داخل الجسم على نطاق واسع لدراسة الديناميكيات الصدغية على الأنسجة الحية. الباحثون بسرعة تطوير أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا التي توفر تحولات محددة وحساسة من العمليات البيولوجية إلى إشارات مضان - والتي يمكن تسجيلها بسهولة باستخدام المجاهر الفلورية التي تتوفر على نطاق واسع1،2. على الرغم من أن معظم الأعضاء الداخلية في القوارض قد تم التحقيق باستخدام المجهر ، إلا أن تطبيقه الناجح على اللسان لم ينجح بعد3.
أجريت الدراسات السابقة على تصوير الكالسيوم من خلايا الذوق السابق فيفو عن طريق رقيقة المقطع أنسجة اللسان للحصول علىبراعمالذوق circumvallate 4،5،6 أو عن طريق تقشير قبالة ظهارة الذوق للحصول على براعم الذوقالفطرية 7،8. كان إعداد هذه العينات غازيا حتما ، وبالتالي كانت البيئات الدقيقة الطبيعية مثل تدين الأعصاب ، وحواجز نفاذية ، والدورة الدموية ، مضطربة إلى حد كبير. تم الإبلاغ عن أول نافذة تصوير لسان داخل الجسم في عام 2015 من قبل Choi وآخرون ، ولكن التسجيل الوظيفي الموثوق به لم يكن قابلا للتحقيق بسبب الحركة والتحف البصرية الناجمة عن المحفزات السائلة9.
في الآونة الأخيرة ، تم تقديم microfluidics على اللسان (μTongue)10. يدمج هذا الجهاز نظام microfluidic مع نافذة التصوير على لسان الماوس. من خلال تحقيق تدفق شبه ثابت للدولة من المحفزات التسفانت طوال فترة التصوير ، يمكن تقليل القطع الأثرية من الحركة السائلة(الشكل 1). يتم تغذية منفذ الإدخال بواسطة سلسلة من وحدات تحكم الضغط متعددة القنوات ، في حين يتم توصيل منفذ الإخراج بمضخة حقنة ، والتي تحافظ على 0.3 مل / دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقليل القطع الأثرية البصرية الناجمة عن الفرق في المؤشرات الانكسارية لحلول التستان من خلال التحليل النسبي الذي أدخل مؤشرا غير حساس للكالسيوم (tdTomato) بالإضافة إلى مؤشر الكالسيوم (GCaMP6)11. وفر هذا التصميم الاستقرار المجهري لخلايا الذوق في الجسم الحي حتى مع التبديل المفاجئ بين القنوات السائلة. وبالتالي ، فإن μTongue تنفيذ فحص وظيفي موثوق بها من التيستات متعددة لبراعم طعم الماوس في الجسم الحي.
في هذا البروتوكول ، يتم شرح الإجراءات التجريبية بالتفصيل لتصوير الكالسيوم لبراعم الذوق الفطرية الماوس في الجسم الحي باستخدام μTongue. أولا ، يتم وصف إعداد اللعاب الاصطناعي وحلول التسات. ثانيا، يتم إدخال إنشاء نظام microfluidic لتحقيق تدفق شبه ثابت للدولة. ثالثا، يتم تحديد الإجراءات المستخدمة لتركيب لسان الماوس على μTongue للسماح بالحصول على الصورة. وأخيرا، يتم تحديد كل خطوة لتحليل الصور، بما في ذلك تصحيح القطع الأثرية للحركة الجانبية وقياس النسب. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع أي مختبر أبحاث مزود بمرفق فأر ومجهر فوتونين أو معدات مكافئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع العمليات الجراحية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) من جامعة سونغكيونكوان وجامعة سيول الوطنية.
1. إعداد الحلول: اللعاب الاصطناعي ومضادات الاختلاص
- إعداد اللعاب الاصطناعي عن طريق حل 2 mM NaCl، 5 MM KCl، 3 م م NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 mM CaCl2, 0.25 mM MgCl2, 0.12 mM K2HPO4، 0.12 م م خ2PO4و 1.8 mM HCl في الماء المقطر (>1 لتر)، وضبط درجة الحموضة للمحلول إلى 7 (انظر جدول المواد)12.
- إعداد السترات، مثل الحامض: حمض الستريك 10 MM. المالحة: 400 مليون م م كلوريد، اختياريا مع 50 ميكرومتر أميلوريد. الحلو: 40 م acesulfame K; المر: خليط من 5 mM كوينين، 5 مليون ديناتونيوم و 20 ميكرومتر سيكلوهيكسميد، عن طريق حل المادة الكيميائية تذوق في اللعاب الاصطناعي أعدت في الخطوة 1.1.
2. إعداد نظام ميكروفلويديك
ملاحظة: تم تسليم التدائن إلى لسان الماوس باستخدام نظام توصيل سائل متعدد القنوات مضغوط (انظر الشكل 1 وجدول المواد).
- ملء خزانات نظام تدفق الضغط مع اللعاب الاصطناعي وastants.
- قم بتوصيل خط الهواء المضغوط بمدخلات المنظمين وحدد ضغط الهواء بين 30 و50 psi في نظام التسليم السائل.
- تعيين ضغط الناتج من المنظم إلى 0.4 psi وتحقق مما إذا كان السائل يخرج من الأنبوب تحت هذا الضغط.
- ربط متعددة من الخزانات إلى منفذ الإدخال من μTongue.
- ربط منفذ الإخراج من μTongue إلى مضخة حقنة وسحب السائل مع ~ 300 μL∙ دقيقة-1 لتحديد حالة ثابتة. مراقبة الحجم الثابت لقطرات معلقة تحت μTongue. ضبط قيمة معلمة الإعداد استنادا إلى ارتفاع العينة.
- افصل خط الهواء المضغوط وتوقف مضخة الحقنة حتى تكتمل الخطوة 3 من البروتوكول.
3. إعداد الماوس للتصوير في الجسم الحي ( الشكل2).
ملاحظة: تم إجراء جميع الاستعدادات الحيوانية خلال النهار في ظل ظروف مطهرة على منضدة عمل مختبرية.
- تخدير الفأر
- إعداد فأر يبلغ من العمر 7 أسابيع أو أكبر من أي من الجنسين. استخدم خط فأر معدل وراثيا يعبر عن بروتينات مضان استشعار الكالسيوم في خلايا الذوق.
- يتم تقييد الماوس للتخدير. يتم حقن خليط من 100 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغ / كغ xylazine intraperitoneally في الماوس13.
- TRITC-dextran (500 كيلودا) في 2.5٪ W/ V الفوسفات العازلة المالحة يتم إدارة عن طريق الوريد في الماوس من خلال مسار مداري الرجعية لمراقبة الدورة الدموية خلال جلسة التصوير.
- إرفاق مثبت الرأس على جمجمة الماوس لتقليل القطع الأثرية الحركة.
- يتم رش رأس الماوس مع 70٪ ETOH بينما يتم وضع الماوس في موقف supine. رفع الجلد الرأس طفيفة مع ملقط وقص قبالة ما يقرب من 7 ملم2 مع مقص.
- تنظيف الشعر حول فروة الرأس، وإزالة periosteum تحت الجلد، وتطبيق لاصقة فورية على الجمجمة، وإرفاق مثبت الرأس مخصصة.
- بعد تصلب لاصقة الفورية، وتطبيق الغراء الأسنان حول المثبت الرأس وتضيء مع الضوء الأزرق لترسيخ الغراء الأسنان.
- ضع لسان الماوس على الوحدة السفلية من μTongue.
- إرفاق الشفة السفلى من الماوس إلى وحدة أسفل μTongue مع لاصقة لحظة.
- ضع الماوس على اللوحة (لوحة إعداد الماوس في الشكل 1B)ووضع الوحدة السفلية من μTongue إلى الوظائف (μTongue عقد آخر في الشكل 1B). تأكد من محاذاة الثقوب الموجودة على حافة الوحدة السفلية إلى المنشور.
- قم بشد مثبت رأس الماوس إلى حامل مثبت الرأس في اللوحة. ثم قم بضبط المسافة بين رأس الماوس والجهاز. تدوير رأس الماوس بسلاسة حوالي 45 درجة باستخدام حامل مثبت الرأس. هذه العملية تمنع الاتصال الجسدي للأنف الماوس مع الهدف المجهر.
- رسم لسان الماوس بلطف باستخدام ملاقط بلاستيكية وإرفاق الجانب البطني من اللسان إلى الجانب العلوي من الوحدة السفلية من μTongue. ثم امسح سطح لسان الفأرة بمسحة قطنية مبللة.
- نقع قطعة من الورق في اللعاب الاصطناعي ووضعها على السطح المكشوف لسان الماوس للحفاظ على حالة رطبة.
- ضع الغسالات المنحنية على المشاركات التي تحمل طرفي الجزء السفلي من μTongue.
- ضع إعداد الماوس على مرحلة المجهر. ضع لسان الفأر المكشوف تحت المركز التقريبي لمنطقة الهدف المجهر. تأكد من عدم الانحراف عن النطاق الديناميكي للمرحلة. ثم، تشديد لوحة الماوس على خشبة المسرح مع مسامير.
- ضع لوحة التدفئة تحت جسم الماوس وحافظ على درجة الحرارة عند 36.5 درجة مئوية -37.5 درجة مئوية. مراقبة درجة حرارة جسم الماوس باستخدام مستشعر درجة الحرارة والتحكم في درجة حرارة لوحة التدفئة باستخدام إشارة ملاحظات من مستشعر درجة الحرارة.
- تويست قطعة رقيقة من الورق ووضعه في فم الماوس لمنع السائل من دخول القصبة الهوائية الماوس.
- إزالة الأنسجة الرطبة من لسان الماوس ووضع μTongue المعدة على لسان الماوس. وضع قناة microfluidic على اللسان وضبط موقفها لمراقبة سطح اللسان من خلال نافذة التصوير.
- تأمين μTongue عن طريق الشد بلطف على كلا الطرفين مع الحد الأدنى من الضغط الضغط.
4. التصوير اكتساب
- بدوره على الليزر 920 نانومتر اثنين الفوتون والمجهر في وقت مبكر من الاستخدام.
- قم بتركيب هدف الغمر المائي (16x، NA 0.80 أو 25x، NA 1.1) على المجهر. إسقاط الماء المقطر على نافذة التصوير من μTongue وتزج الهدف.
- في وضع الكاميرا، قم بتشغيل الضوء باستخدام مصباح الزئبق وأنير سطح اللسان.
- عن طريق ضبط المحور Z، ابحث في إشارة الموائع التلقائية من الحليمة الخيطية للعثور على المستوى البؤري التقريبي. ثم، وذلك باستخدام مقبض التكيف X و Y، حدد موقع برعم الذوق.
- التبديل إلى وضع متعدد الفوتون. تعيين شروط الحصول على الصورة على النحو التالي: الطول الموجي الإثارة: 920 نانومتر; مجموعة فلتر الانبعاثات: 447/60 نانومتر، 525/50 نانومتر، و 607/70 نانومتر؛ وضع المسح النقطي ثنائي الاتجاه، حجم الإطار: 512 × 512.
- ضبط مواقف X و Y لوضع برعم الذوق على وسط نافذة الصورة.
- البحث في الأوعية الدموية المحيطة برعم الذوق في حوالي ثلثي ارتفاع برعم الذوق. تصور الدورة الدموية عن طريق TRITC-dextran (500 كيلودا) حقن من البروتوكول الخطوة 3.2. إذا كان تدفق الدم يسد، وتخفيف مسامير تحديد قليلا للسماح تدفق الدم.
- ضبط Z-محور والعثور على Z-الطائرة من برعم الذوق الذي يحتوي على عدد كاف من خلايا الذوق.
- تابع تصوير الكالسيوم مع 2-6 هرتز لمدة 80 s. توفير حل طعم 20 ق عن طريق التبديل على خزان النظام السائل بعد بدء التصوير. بعد 20 s من تحفيز الذوق، وتحويل الخزان مرة أخرى إلى اللعاب الاصطناعي.
- بعد الانتهاء من التصوير المتسلسل، انتظر لمدة 3-4 دقائق مقدما إلى جلسة التصوير التالية. الحفاظ على اللعاب الاصطناعي المتدفقة إلى لسان الماوس لغسل remanent تذوق من جلسة التصوير السابقة. اعتمادا على تصميم التجربة، كرر الجلسة كما هو مطلوب.
- عندما يكتمل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي، قم بالقتل الرحيم للفأر وفقا لإجراء IACUC. يتم التضحية الماوس تحت التخدير في غرفة CO2.
ملاحظة: تحقق من عمق التخدير باستخدام منعكس إصبع القدم قرصة. خلال جلسة التصوير ، يجب توفير اللعاب الاصطناعي من الخزانات باستمرار. إذا ظهرت فقاعات في إطار التصوير من μTongue، وإزالة الفقاعات عن طريق دفعها من خلال المدخلات أو إخراج μTongue باستخدام ضغط سائل قوي.
5. تحليل الصورة (الشكل 3)
- تحويل الصورة
- افتح ملفات الصور الأولية باستخدام فيجي14 أو برنامج تحليل صورة مشابه.
- تحويل ملف الصورة إلى ملف مكدس RGB لاستخدام رمز محلل برعم NPL.
- > الصور اللون > تقسيم القنوات
- > الصور اللون > دمج القنوات وحدد الصورة من الخطوة 5.2.1.
- > الصورة > اللون المكدس إلى RGB
- تسجيل الصور
ملاحظة: استخدام التعليمات البرمجية المكتوبة خصيصا لتحليل البيانات. يرجى الرجوع إلى https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- تشغيل التعليمات البرمجية المسماة Taste_GUI.m; نافذة واجهة المستخدم الرسومية اسمه NPL برعم محلل سوف يطفو على السطح. انقر على زر تحليل جديد في الزاوية العلوية اليمنى، ثم قم بتحميل الصورة المحولة من الخطوة 5.1. تعيين معدل الإطار فوق الصورة المحملة.
- رسم منطقة الاهتمام (ROI) على الصورة المحملة للتسجيل. انقر نقرا مزدوجا على عائد الاستثمار المحدد وسيبدأ التسجيل المحسوب تلقائيا.
- الحصول على التغيرات النسبية كثافة الفلورسينس (ΔF/F)
- العودة إلى إطار محلل برعم NPL لإظهار الصورة المسجلة من الخطوة 5.2 تلقائيا. إذا كان لدى المستخدم ملف reg بالفعل، انقر فوق الزر تحميل البيانات وحدد الملف _reg.tif.
- انقر على زر CIRCLE أو POLYGON وضع عائد الاستثمار للخلية الذوق على صورة برعم الذوق.
- هذا يقدم كثافة الفلورسينس الخام وتتبع الكالسيوم (ΔF/F)من خلية الذوق المحدد تلقائيا تحت صورة برعم الذوق.
- انقر على حفظ تتبع لتقديم تتبع الكالسيوم (ΔF/F)على الجانب الأيمن من واجهة المستخدم الرسومية، في حين يظهر عائد الاستثمار على صورة برعم الذوق. كرر الخطوات 5.3.2-5.3.4 حتى يتم الانتهاء من تحديد عائد الاستثمار.
ملاحظة: انقر فوق الزر حذف التتبع إذا تم اختيار عائد الاستثمار بشكل خاطئ للقضاء على العائد على الاستثمار المحدد الأخير وتتبع الكالسيوم. - بعد الانتهاء من تحديد عائد الاستثمار، اكتب اسم الملف في الزاوية السفلية اليمنى، وانقر على زر إنهاء لتصدير تتبع الكالسيوم ΔF/F كتنسيق .xls، وصورة برعم tase مع ROIs بتنسيق .bmp.
- تحليل أثر الكالسيوم
- تحليل أثر الكالسيوم التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.3. النظر في أن خلايا الذوق قد تفاعلت مع tastant عندما ترتفع كثافة الفلورسينس أكثر من اثنين من الانحرافات المعيارية لخط الأساس بعد تسليم التيستان4، و ع-القيم هي أقل من 0.01، وذلك باستخدام أزواج أو غير مدفوعة ر-الاختبارات10.
- النظر في خلية الذوق كخلية المستجيب، إذا كان يستجيب لتسانت معينة أكثر من مرتين من أصل ثلاث تجارب (~ 60٪)15.
- الحصول على آثار الكالسيوم ممثل عن طريق متوسط آثار الكالسيوم الفردية المكتسبة من الخطوة 5.4.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام الماوس بيرت-GCaMP6f-tdTomato للحصول على صورة برعم الذوق. كان سطح لسان الفأر مغطى بالبابيات الخيطية ذات الفلورسنت. تنتشر براعم الذوق بشكل متفرق على سطح اللسان (الشكل 4A). تم الحصول على صور برعم الذوق وهيكله باستخدام ثلاثة كاشفات فلتر مختلفة. باستخدام مجموعة مرشح 607/70 نانومتر، تم الحصول على إشارة tdTomato من خلايا الذوق لتحليل نسبة(الشكل 4B). باستخدام مجموعة مرشح 525/50 نانومتر، تم الحصول على إشارة GCaMP من خلايا الذوق والأوعية الدموية التي تحيط برعم الذوق(الشكل 4B). باستخدام مجموعة مرشح 447/60 نانومتر، تم الحصول على النسيج الضام الكولاجين، الذي يدعم هيكليا برعم الذوق،(الشكل 4B).
بعد الحصول على صور برعم الذوق والهياكل النسبية ، تم إجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي باستخدام البروتوكول. تم استخدام الماوس بيرت-GCaMP6f-tdTomato للفحص على خلايا الذوق (الشكل 5A)16. استجابت خلايا الذوق مرارا وتكرارا لمحفزات الذوق الخاصة بها(الشكل 5B). واعتبرت خلايا التذوق تتفاعل مع التساق عندما استوفت الشروط الواردة في البروتوكول 5-1-4. في هذه التجربة، استجابت الخلية 2 لكل من التواسات الحلوة والأومامي. والنتيجة تتفق مع البحوث السابقة مراقبة النشاط الخلوي باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية17. استجابت الخلية 3 لكل من 400 mM NaCl و 400 mM NaCl تحت الميلوريد. وهو يورط أن الخلية 3 قد استخدمت مسار مستقل ENaC للاستجابة للذوق المالح. لم يتضمن برعم الذوق في هذه التجربة خلية تستجيب للأذواق الحامضة. تم فحص خلايا الذوق في ظل ظروف تصوير مستقرة ، وأظهرت كل خلية طعم استجابة قابلة للتكرار لنوع متميز من الذوق.
الشكل 1: μTongue ، منصة تصوير وظيفية تعتمد على microfluidics. (A)نظام توصيل السوائل المضغوط. '1' يرتبط منظم الضغط في النظام السائل بمصدر الهواء الخارجي. يتم تعديل ضغط مصدر الهواء بين 30-50 psi قبل الدخول إلى منظم الضغط. '2' يبلغ ضغط الهواء من الجهة المنظمة حوالي 0.4 رطل في الثانية. '3' ترتبط الخزانات التي تحتوي على اللعاب الاصطناعي وحلول الذوق المختلفة بإخراج منظم ضغط الهواء. '4' يتلاقى كل خزان مع مشعب متصل بمنفذ الإدخال في المكتونغ. '5' يتم توصيل مضخة حقنة إلى إخراج μTongue وتسيطر على تدفق. (ب) وμTongue ، microfluidics القائم على منصة التصوير الوظيفي. يتم تحديد اسم كل جزء في الشكل. '1' لوحة إعداد الماوس. '2' لوحة إعداد النظام السائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وصف تسلسلي لإعداد الماوس. يتم عرض خطوات هامة في إعداد الماوس. (أ)حقن المدارية الرجعية من TRITC-dextran. (ب)تظهر عملية مرفق مثبت الرأس إلى جمجمة الماوس. يتم مسح الجلد الرأس والبيريوستيوم. وتستخدم لاصقة الغراء والغراء الأسنان للتعلق. (ج) يتم مشدود المثبت الرأس على الجمجمة الماوس على لوحة إعداد الماوس. (د) إجراء تركيب اللسان على الوحدة السفلية من μTongue. يتم استخدام لاصقة فورية لتثبيت اللسان. يتم تنظيف اللسان باستخدام مسحة قطنية مبللة ومغطاة بأنسجة ورقية مبللة لمنع الجفاف. (ه) يتم تطبيق غسالات منحنية على طرفي الوحدة السفلية من μTongue. (F) يتم وضع قطعة من الأنسجة الورقية الملتوية في تجويف الفم الماوس. (G) يتم تركيب لوحة إعداد الماوس على مرحلة المجهر ثمل بإحكام لضمان ظروف التصوير مستقرة. (H) يتم وضع μTongue على اللسان. يتم ضبط عدسة موضوعية عبر نافذة التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل الصورة. (أ) يتم تحويل صورة RGB من كل صورة بلون واحد. شريط المقياس، 10 ميكرومتر (B) تسجيل الصور باستخدام رمز مخصص أجريت. (C) واجهة المستخدم الرسومية للتعليمات البرمجية المخصصة. '1' موقع الإدخال لمعدل الإطار. معدل الإطار الافتراضي هو 0.16 s/frame. '2' أزرار لرسم ROIs. '3' المنطقة التي تظهر فيها الصورة المحملة. '4' تظهر إشارة الكالسيوم العائد على الاستثمار المحددة كتتبع أخضر، في حين تظهر إشارة عائد الاستثمار المختارة التي لا تراعي الكالسيوم كتتبع أحمر. '5' يحسب التحليل المعدلي و ΔF/Fتلقائيا. يتم تقديم الرسم البياني F/F باللون الأرجواني. '6' أزرار لتحميل الصور. تحليل جديد لتحميل صورة تحويل RGB. تحميل البيانات لتحميل صورة تم تسجيلها بالفعل. '7' زر حفظ التتبع هو الاحتفاظ بالرسم البيانيF/Fو ROI المحدد في الثامنة. زر حذف التتبع هو إزالة الرسم البياني F /F من الثامن. '8' تظهر آثار الكالسيوم المحفوظة. (ix) منطقة لملء اسم الملف. زر إنهاء هو لاستخراج البيانات وحفظها في نفس الدليل من التعليمات البرمجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: سطح لسان الفأرة والذوق برعم في الحليمة الفطرية. (أ) يتم التقاط سطح لسان الماوس في حقل كبير. حليمة بخيوط كيراتينية برعم الذوق، ويظهر هيكل الكولاجين. يشار إلى كل بنية باستخدام ألوان مختلفة: أرجواني، أصفر، وأخضر، على التوالي. شريط مقياس، 100 ميكرومتر (ب) يتم تكبير برعم الذوق من (A) في والتقاطها باستخدام ثلاثة كاشفات فلتر الانبعاثات المختلفة. يتم التقاط الحليمة الخيطية، باللون الأصفر، باستخدام كاشف 525/50 نانومتر. ويلاحظ هذا الهيكل من سطح اللسان يصل إلى ~ 25 ميكرومتر في العمق. إشارات GCaMP في إشارات خضراء وdTomato باللون الأحمر تمثل خلايا الذوق. يتم الكشف عن هذه الإشارات بواسطة كاشفات 525/50 و 607/70 نانومتر على التوالي. يتم التقاط رودامين ديكتران تمثل الدورة الدموية في كل من 525/50 و 607/70 نانومتر كاشفات. يتم الحصول على هيكل الكولاجين هو مبين باللون الأزرق السماوي من قبل كاشفات 447/60 نانومتر. تعرض الصورة الأخيرة جميع الصور السابقة المدمجة. شريط المقياس، 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: طعم screeningof فأر بيرت GCaMP6f-tdTomato في الجسم الحي. (أ) برعم طعم ممثل للفأر بيرت-GCaMP6f-tdTomato. تظهر الصورة على أنها لون زائف قائم على الكثافة. خطوط متقطعة ترسيم كل خلية الذوق. سطوع كل خلية الذوق يعتمد على التعبير عن البروتين الفلوري وعمق موقع الخلية الذوق. شريط مقياس، 10 ميكرومتر(ب) أثر الكالسيوم من كل خلية طعم للمحفزات الذوق الأساسية الخمسة. تظهر كل تجربة متكررة باللون الرمادي على الظهر ويتم عرض متوسط التتبع فوق كل تجربة. يتم تعريف الآثار الملونة على أنها متجاوبة بينما يتم تعريف الآثار السوداء على أنها غير مستجيبة. كل لون يمثل طعم مختلف. المالحة (L) يمثل مالح منخفض، مع خليط من 400 م م NaCl و 50 ميكرومتر amiloride المستخدمة لتحفيز الذوق. المالحة (H) يمثل مالحة عالية، مع 400 مليون م NaCl تستخدم للتحفيز. يظهر تحفيز الطعم كصندوق رمادي على الجزء الخلفي من كل أثر للكالسيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف هنا هو بروتوكول مفصل لتطبيق μTongue للتحقيق في الأنشطة الوظيفية للخلايا الذوق في الجسم الحي. في هذا البروتوكول، يتم إجراء التصوير الوظيفي على خلايا الذوق باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا. بالإضافة إلى استخدام الفئران المعدلة وراثيا، يمكن تحميل الكهربائية من الأصباغ الكالسيوم (أو الأصباغ استشعار الجهد) على خلايا الذوق يكون خيارا بديلا.
تم استخدام جميع حلول الذوق أقل من 1.336 من مؤشر الانكسار في هذه التجربة. على الرغم من أن μTongue يوفر تسليم السوائل مستقرة وتحليل نسب تحسين القطع الأثرية التصوير، سيكون من الصعب على الباحثين لاستخدام تركيز أعلى من التيستانت (على سبيل المثال، >100 مليون متر سكروز مع مؤشر الانكسار في 1.338). الفرق الكبير في مؤشر الانكسار بين اللعاب الاصطناعي وحل الذوق يحول مستوى الصورة البؤري أكثر من نطاق التعويض من خلال عملية ما بعد الصورة. من الناحية التجريبية ، يتم الحصول على مجموعة معينة من مؤشر الانكسار لمحلول الذوق (أقل من 1.336) الذي يسمح بالتصوير الخلوي المستقر في الوقت الفعلي.
بالنسبة للباحثين ذوي الخبرة في التصوير الفلوري ومناولة الحيوانات ، يمكن تعلم هذا البروتوكول بسهولة على الممارسة المتكررة. ومع ذلك، فإنه يحتوي على خطوات هامة، والتي غالبا ما تعوق الحصول على البيانات بنجاح. أولا ، بمجرد أن يتم تغريبه من الكياسة الفموية ، يجب الحفاظ على اللسان رطبا مع اللعاب الاصطناعي للحفاظ على البيئة الدقيقة المخاطية الطبيعية. ثانيا، يجب أن يكون دوران الدم حول برعم الذوق سليما، للحفاظ على إمدادات فسيولوجية من الأكسجين والمواد المغذية والعوامل المنقولة بالدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفان عن مصالح مالية متنافسة: J. Han و M. Choi مخترعان لتكنولوجيا μTongue الحاصلة على براءة اختراع الموصوفة في هذه المقالة ، ونظام μTongue متاح تجاريا عبر SciTech Korea.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل معهد العلوم الأساسية (IBS-R015-D1)، وهي منحة المؤسسة الوطنية لبحوث كوريا (NRF) التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT) (رقم 1). 2019M3A9E2061789)، ومنحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (رقم 2019M3E5D2A01058329). ونحن ممتنون لأنسو كيم ويوجين لي على مساعدتهما التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
