Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62361
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Biomedical Engineering, Sungkyunkwan University, 2Center for Neuroscience Imaging Research, Institute for Basic Science, 3School of Biological Sciences, Seoul National University

Summary

המאמר מציג את מכשיר μTongue (microfluidics-on-a-tongue) להדמיית תאי טעם פונקציונליים ב- vivo על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיה תוך-וינטלי על הלשון.

Abstract

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות תוך-וינטלית היא כלי המשמש באופן נרחב לחקר דינמיקה רב-תאית בחיה חיה. עם זאת, זה לא נעשה שימוש מוצלח באיבר החושי טעם. על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי, ה- μTongue מספק תמונות פונקציונליות אמינות של תאי טעם ב- vivo תחת חשיפה מבוקרת לטעמים מרובים. במאמר זה מוצג הליך מפורט שלב אחר שלב לשימוש במערכת μTongue. קיימות חמש סעיפים: הכנת פתרונות טעימים, הקמת מודול מיקרופלואידי, הרכבה לדוגמה, רכישת נתוני תמונה פונקציונליים וניתוח נתונים. כמה טיפים וטכניקות כדי לפתור את הבעיות המעשיות שעלולות להתעורר בעת שימוש μTongue מוצגים גם.

Introduction

מיקרוסקופ פלואורסצנטיות תוך-וינטלית נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את הדינמיקה השופעת על רקמות חיות. חוקרים מפתחים במהירות חיישנים מקודדים גנטית המספקים טרנספורמציות ספציפיות ורגישות של התהליכים הביולוגיים לאותות פלואורסצנטיות - אשר ניתן להקליט בקלות באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב1,2. למרות שרוב האיברים הפנימיים במכרסמים נחקרו באמצעות המיקרוסקופ, היישום המוצלח שלה ללשון עדיין לא הצליח3.

מחקרים קודמים על הדמיית סידן של תאי טעם נערכו ex vivo על ידי חתך דק של רקמת לשון כדי לקבל בלוטות טעם להקיף4,5,6 או על ידי קילוף אפיתל הטעם כדי להשיגבלוטות טעםפטרייתיות7,8. הכנת דגימות אלה הייתה פולשנית באופן בלתי נמנע, ולכן המיקרו-סביבה הטבעית כגון פנימיות העצבים, מחסומי החן וזרימת הדם, היו מוטרדות במידה רבה. חלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי הראשון דווח בשנת 2015 על ידי Choi et al., אך הקלטה פונקציונלית אמינה לא הייתה ברת השגה בגלל התנועה וממצאים אופטיים הנגרמים על ידי גירויים טעימים נוזלים9.

לאחרונה, microfluidics-על-לשון (μTongue) הוצג10. התקן זה משלב מערכת מיקרופלואידית עם חלון הדמיה על לשון העכבר. על-ידי השגת זרימה מעין-יציבה-יציבה של גירויים טעימים לאורך כל תקופת ההדמיה, ניתן היה למזער חפצים מתנועה נוזלית (איור 1). יציאת הקלט ניזונה מסדרה של בקרי לחץ רב-ערוציים, בעוד שיציאת הפלט מחוברת למשאבת מזרק, השומרת על 0.3 מ"ל/דקה. בנוסף, ממצאים אופטיים שנגרמו על ידי ההבדל במדדים שבירה של פתרונות טעימים צומצמו על ידי ניתוח יחסי המציג אינדיקטור סידן חסר רגישות (tdTomato) כמו גם מחוון סידן (GCaMP6)11. עיצוב זה סיפק יציבות מיקרוסקופית של תאי טעם ב- vivo אפילו עם מעבר פתאומי בין ערוצים נוזליים. כתוצאה מכך, μTongue ליישם הקרנה פונקציונלית אמינה של tastants מרובים בלוטות הטעם של העכבר ב vivo.

בפרוטוקול זה, ההליכים הניסיוניים מוסברים בפירוט עבור הדמיית סידן של בלוטות הטעם פטריות העכבר ב vivo באמצעות μTongue. ראשית, הכנת רוק מלאכותי ופתרונות טעימים מתוארת. שנית, הקמת המערכת המיקרופלואידית להשגת זרימת מצב מעין-יציבה מוצגת. שלישית, ההליכים המשמשים להרכבה של לשון העכבר על μTongue כדי לאפשר רכישת תמונה הם מתויגים. לבסוף, כל שלב לניתוח תמונה, כולל תיקון של ממצאי תנועה לרוחב ויחס, מצוין. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לכל מעבדת מחקר עם מתקן עכבר ומיקרוסקופ שני פוטון או ציוד שווה ערך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הכירורגיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סונגקיונקוואן והאוניברסיטה הלאומית של סיאול.

1. הכנת פתרונות: רוק מלאכותי וטרסמים

  1. הכן רוק מלאכותי על ידי המסת 2 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 מ"מ CaCl2, 0.25 מ"מ MgCl2, 0.12 מ"מ K2HPO4, 0.12 מ"מ KH2PO4, ו 1.8 mM HCl במים מזוקקים (>1 L), ולהתאים את ה- pH של הפתרון ל 7 (ראה טבלת חומרים)12.
  2. הכן טעים, כגון חמוץ: 10 mM חומצת לימון; מלוח: 400 mM NaCl, אופציונלי עם 50 מיקרומטר אמילורי; מתוק: 40 מ"מ אצסולפאם K; מריר: תערובת של 5 mM כינין, 5 mM denatonium ו 20 μM cycloheximide, על ידי המסת כימי הטעימה ברוק מלאכותי מוכן בשלב 1.1.

2. הכנת המערכת המיקרופלואידית

הערה: פריטים טעימים הועברו ללשון העכבר באמצעות מערכת משלוח נוזלית רב-ערוצית בלחץ (עיין באיור 1 ובטבלת החומרים).

  1. מלאו את המאגרים של מערכת זלוף הזרימה בלחץ ברוק מלאכותי וטסמים.
  2. חבר את קו האוויר הדחוס לקלט הווסת והגדר את לחץ האוויר בין 30 ל -50 פסאיי במערכת האספקה הנוזלית.
  3. הגדר את לחץ הפלט של הרגולטור ל 0.4 פסאיי ולבדוק אם נוזל יוצא מהצינור תחת לחץ זה.
  4. חבר את הסעפת מהמאגרים ליציאת הקלט של μTongue.
  5. חבר את יציאת הפלט של μTongue למשאבת מזרק ולמשוך נוזל עם ~ 300 μL∙min-1 כדי לקבוע את מצב יציב. שימו לב לנפח הקבוע של טיפה תלויה מתחת ל-μTongue. התאם את הערך של פרמטר ההגדרה בהתאם לגובה הדוגמה.
  6. נתק את קו האוויר הדחוס והפסק את משאבת המזרק עד להשלמת שלב 3 של הפרוטוקול.

3. הכנת עכבר להדמיית ויוו (איור 2).

הערה: כל ההכנות לבעלי חיים בוצעו בשעות היום בתנאים אספטיים על שולחן עבודה במעבדה.

  1. הרדמה של עכבר
    1. הכן עכבר בן 7 שבועות או מבוגר משני המינים. השתמש בקו עכבר מהונדס גנטית המבטא חלבוני פלואורסצנטיות חישת סידן בתאי הטעם.
    2. העכבר מרוסן להרדמה. תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג קסילאצין מוזרק תוך-איפריטונית לעכבר13.
  2. TRITC-dextran (500 kDa) ב 2.5% W / V תמיסת מלח פוספט הוא administrated תוך ורידי לתוך העכבר דרך מסלול רטרו-מסלולית כדי לצפות במחזור הדם במהלך מפגש הדמיה.
  3. חבר מתקן ראש על גולגולת העכבר כדי למזער את חפצי התנועה.
    1. ראש העכבר מרוסס ב- 70% ETOH בזמן שהעכבר ממוקם במצב על-גוף. הרם את העור ראש קלות עם מלקחיים ולגזור כ 7 מ"מ2 עם מספריים.
    2. נקו את השיער סביב הקרקפת, הסירו את ה- periosteum מתחת לעור, החל דבק מיידי על הגולגולת וחיברו מתקן ראש מותאם אישית.
    3. לאחר הדבקה מיידית הוא התקשה, להחיל דבק דנטלי סביב מתקן הראש ולהאיר עם אור כחול כדי לחזק את הדבק הדנטלי.
  4. מקם את לשון העכבר על היחידה התחתונה של μTongue.
    1. חבר את השפה התחתונה של העכבר ליחידה התחתונה של μTongue עם דבק מיידי.
    2. הניחו את העכבר על הלוח (לוח הכנת העכבר באיור 1B) והכניסו את היחידה התחתונה של ה-μTongue לעמדות (עמדת אחיזה של μTongue באיור 1B). ודא כי החורים בקצה היחידה התחתונה מיושרים לעמדה.
    3. הדק את מתקן ראש העכבר למחזיק מתקן הראשים בלוח. לאחר מכן, התאם את המרחק בין ראש העכבר להתקן. סובב את ראש העכבר בצורה חלקה בערך 45° באמצעות מחזיק מתקן הראש. תהליך זה מונע מגע פיזי של אף העכבר עם מטרת מיקרוסקופ.
    4. צייר את לשון העכבר בעדינות באמצעות פינצטה מפלסטיק וחבר את הצד הגחון של הלשון לצד העליון של היחידה התחתונה של ה- μTongue. לאחר מכן, לנגב את פני השטח של לשון העכבר עם צמר גפן רטוב.
    5. השרו פיסת נייר ברוק המלאכותי ומניחים אותה על המשטח החשוף של לשון העכבר כדי לשמור על מצב רטוב.
    6. הנח את מכונות הכביסה המעוקלות על העמודים המכילים את שני קצות החלק התחתון של μTongue.
  5. הנח את הכנת העכבר על במת המיקרוסקופ. מקם את לשון העכבר החשופה מתחת למרכז המשוער של האזור האובייקטיבי של המיקרוסקופ. הקפד לא לסטות מהטווח הדינמי של הבמה. לאחר מכן, הדק את לוח העכבר על הבמה עם ברגים.
  6. מניחים את כרית החימום מתחת לגוף העכבר ולשמור על הטמפרטורה ב 36 °C (37 °F) °C (5 °F) נטר את טמפרטורת גוף העכבר באמצעות חיישן טמפרטורה ושלט בטמפרטורת כרית החימום באמצעות אות משוב מחיישן הטמפרטורה.
  7. לסובב פיסת נייר דקה ומניחים אותה בפתח העכבר כדי למנוע מהנוזל להיכנס קנה הנשימה של העכבר.
  8. הסר את הרקמה הרטובה מלשון העכבר והניח את μTongue מוכן על לשון העכבר. שים ערוץ microfluidic על הלשון ולהתאים את המיקום שלה כדי לצפות את פני השטח של הלשון דרך חלון ההדמיה.
  9. אבטחו את ה-μTongue על ידי הברגה עדינה בשני הקצוות בלחץ דחיסה מינימלי.

4. רכישת הדמיה

  1. הפעל את לייזר 920 ננומטר שני פוטון ואת המיקרוסקופ לפני השימוש.
  2. הר את המטרה טבילת מים (16x, NA 0.80 או 25x, NA 1.1) על המיקרוסקופ. זרוק את המים המזוקקים על חלון ההדמיה של μTongue ולטבול את המטרה.
  3. במצב מצלמה, הפעל את האור באמצעות מנורת כספית והאיר את פני הלשון.
  4. על-ידי התאמת ציר Z, חפשו באות ההפללה האוטומטית מהפיפילה הקליפורמית כדי למצוא את מישור המוקד המשוער. לאחר מכן, באמצעות ידית ההתאמה X ו- Y, אתר בלוטות טעם.
  5. עבור למצב מולטיפוט. הגדר את תנאי רכישת התמונה כדלקמן: אורך גל עירור: 920 ננומטר; סט מסנני פליטה: 447/60 ננומטר, 525/50 ננומטר ו- 607/70 ננומטר; מצב סריקת רסטר דו-כיווני, גודל מסגרת: 512 x 512.
  6. כווננו את מיקומי X ו- Y כדי למקם את בלוטות הטעם במרכז חלון התמונה.
  7. חפש בכלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם בערך בגובה של כשני שלישים של בלוטות הטעם. דמיינו את זרימת הדם על ידי הזרקת TRITC-dextran (500 kDa) מהפרוטוקול שלב 3.2. אם זרימת הדם קבקבים, לשחרר את ברגי תיקון מעט כדי לאפשר זרימת דם.
  8. התאם את ציר Z ומצא את מישור Z של בלוטות הטעם המכיל מספר מספיק של תאי טעם.
  9. המשך הדמיית סידן עם 2-6 הרץ עבור 80 s. ספק פתרון טעם של 20 s על ידי הפעלת המאגר של המערכת הנוזלית לאחר תחילת ההדמיה. לאחר 20 s של גירוי טעם, להעביר את המאגר בחזרה לרוק מלאכותי.
  10. לאחר סיום ההדמיה הריציפה, המתן כ-3-4 דקות מראש למפגש ההדמיה הבא. שמור את הרוק המלאכותי זורם ללשון העכבר כדי לשטוף את המעכב הטעים מפגישת ההדמיה הקודמת. בהתאם לעיצוב הניסוי, חזור על הפגישה כנדרש.
  11. כאשר הדמיית סידן ויו הושלמה, להרדים את העכבר על פי הליך IACUC. העכבר תחת הרדמה מוקרב בתא CO2.
    הערה: בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת בוהן. במהלך מפגש הדמיה, רוק מלאכותי מהמאגרים צריך להיות מסופק באופן עקבי. אם בועות מופיעות בחלון ההדמיה של μTongue, להסיר את הבועות על ידי דוחף אותם דרך הקלט או את הפלט של μTongue באמצעות לחץ נוזלי חזק.

5. ניתוח תמונה (איור 3)

  1. המרת תמונה
    1. פתח את קבצי התמונה הגולמיים באמצעות פיג'י14 או תוכנת ניתוח תמונה דומה.
    2. המר את קובץ התמונה לקובץ מחסנית RGB לשימוש בקוד מנתח באד NPL.
      1. תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים
      2. תמונה > צבע > מיזוג ערוצים ובחר את התמונה מהשלב 5.2.1.
      3. תמונה > צבע > מחסנית ל- RGB
  2. רישום תמונה
    הערה: השתמש בקוד הכתוב בהתאמה אישית לניתוח נתונים. אנא עיינו https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
    1. הפעל את הקוד בשם Taste_GUI.m; חלון GUI בשם מנתח ניצני NPL יופיע. לחץ על לחצן ניתוח חדש בפינה השמאלית העליונה ולאחר מכן טען את התמונה המומרת בשלב 5.1. הגדר את קצב הפריימים מעל התמונה שנטענה.
    2. צייר את אזור העניין (ROI) מעל התמונה שנטענה לרישום. לחץ פעמיים על ההבחז הנבחר והרישום המחושב האוטומטי יתחיל.
  3. להשיג את השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות היחסית (ΔF/F)
    1. חזור לחלון מנתח באד NPL כדי להציג את התמונה הרשומה מהשלב 5.2 באופן אוטומטי. אם למשתמש כבר יש קובץ reg, לחץ על לחצן טען נתונים ובחר את הקובץ _reg.tif.
    2. לחץ על כפתור המעגל או המצולע והצב את ה- ROI של תא הטעם מעל תמונת בלוטות הטעם.
    3. זה מציג את עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית ואת עקבות הסידן (ΔF/F) של תא הטעם שנבחר באופן אוטומטי מתחת לתמונת בלוטות הטעם.
    4. לחץ על שמור מעקב כדי להציג את עקבות הסידן (ΔF/F) בצד ימין של GUI, בעוד ROI מוצג על תמונת בלוטות הטעם. חזור על שלבים 5.3.2-5.3.4 עד לסיום בחירת החזר על החזר על ההחזרה.
      הערה: לחץ על לחצן מחק מעקב אם ה- ROI נבחר בטעות כדי למנוע את עקבות ה- ROI והסידן שנבחרו לאחרונה.
    5. לאחר סיום בחירת ROI, כתוב את שם הקובץ בפינה השמאלית התחתונה ולחץ על לחצן סיום כדי לייצא את מעקב הסידן ΔF/F כתבנית .xls, ואת תמונת ניצן הבורסה עם ROIs בתבנית .bmp.
  4. ניתוח עקבות הסידן
    1. לנתח את עקבות הסידן המתקבלים בשלב 5.3. קחו בחשבון שתאי הטעם הגיבו לטעים כאשר עוצמת הפלואורסצנטיות עולה ביותר משתי סטיות תקן של קו הבסיס לאחר מסירת הטעם4, וערכי pהם פחות מ- 0.01, באמצעות t-testsמזווגים או לא משולמים10.
    2. שקול את תא הטעם כתא מגיב, אם הוא מגיב לטעם מסוים יותר מפי שניים מתוך שלושה ניסויים (~ 60%)15.
    3. השג את עקבות הסידן הייצוגיות על ידי ממוצע עקבות סידן בודדות שנרכשו בשלב 5.4.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato שימש להשגת תמונת בלוטות טעם. פני השטח של לשון העכבר היו מכוסים בפפילה פילפורמית אוטופלואורסצנטית. בלוטות הטעם מפוזרות בדלילות על פני הלשון(איור 4A). התמונות של בלוטות הטעם והמבנה שלה נרכשו באמצעות שלושה גלאי מסננים שונים. באמצעות ערכת המסננים 607/70 ננומטר, אות tdTomato מתאי הטעם התקבל לניתוח רצומטרי (איור 4B). באמצעות ערכת המסננים 525/50 ננומטר, אות GCaMP מתאי הטעם וכלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם נרכשו(איור 4B). באמצעות ערכת המסננים 447/60 ננומטר, נרכשה רקמת חיבור הקולגן, התומכת מבחינה מבנית בבלוטות הטעם (איור 4B).

לאחר רכישת התמונות של בלוטות הטעם ומבנים יחסיים, בהדמיית סידן ויו בוצעה באמצעות הפרוטוקול. עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato שימש למסך על תאי טעם (איור 5A)16. תאי הטעם הגיבו שוב ושוב לגירויי הטעם שלהם(איור 5B). תאי טעם נחשבו כמגיבים לטעם כאשר הם עמדו בתנאים שהוצגו בפרוטוקול 5.1.4. במשפט זה, תא 2 הגיב הן לתמיסות מתוקות והן לתמיסות אומאמי. התוצאה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים התבוננות בפעילות הסלולר באמצעות אלקטרופיזיולוגיה17. תא 3 הגיב הן 400 mM NaCl ו 400 mM NaCl תחת אמילורי. זה מסבך כי תא 3 השתמשו במסלול עצמאי ENaC לתגובה לטעם מלוח. בלוטות הטעם בניסוי זה לא כללו תא המגיב לטעמים חמוצים. ההקרנה של תאי הטעם בוצעה בתנאי הדמיה יציבים, וכל תא טעם הראה תגובה חוזרת לסוג טעם ייחודי.

Figure 1
איור 1: ה-μTongue, פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה. (A)מערכת אספקה נוזלית בלחץ. (i) וסת הלחץ של המערכת הנוזלית מחובר למקור האוויר החיצוני. הלחץ של מקור האוויר מותאם בין 30-50 פסאיי לפני הכניסה לווסת הלחץ. (ii) לחץ האוויר מהרגולטור הוא כ 0.4 פסאיי. (iii) מאגרים המכילים רוק מלאכותי ופתרונות טעם שונים מחוברים לתפוקה של רגולטור לחץ האוויר. (4) כל מאגר מתכנס לסעפת המחוברת ליציאת הקלט של ה- μTongue. (v) משאבת מזרק מחוברת לפלט של ה- μTongue ושולטת בזרימה. (B)ה- μTongue, פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה. השם של כל חלק מצוין באיור. (i) לוח הכנה לעכבר. (ii) לוח התקנת מערכת נוזלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תיאור רציף של הכנת העכבר. מוצגים שלבים חשובים בהכנת העכבר. (A)הזרקה רטרו-מסלולית של TRITC-dextran. (B)מוצג תהליך של התקשרות של מתקן ראש לגולגולת העכבר. עור הראש ופריוסטיום נקיים. דבק דבק ודבק דנטלי משמשים לחיבור. (C)מתקן הראש על גולגולת העכבר מוברג על לוח הכנת העכבר. (ד)הליך הרכבת לשון על היחידה התחתונה של μTongue. דבק מיידי משמש קיבוע לשון. הלשון מנוקה באמצעות צמר גפן רטוב ומכוסה ברקמות נייר רטובות למניעת יובש. (E)מכונות כביסה מעוקלות מוחלות על שני קצות היחידה התחתונה של ה- μTongue. (ו)פיסת רקמת נייר מעוותת ממוקמת בחלל הפה של העכבר. (G)לוח הכנת העכבר מותקן על במת המיקרוסקופ ומוברג בחוזקה כדי להבטיח תנאי הדמיה יציבים. (ח)הμTongue ממוקם על הלשון. עדשה אובייקטיבית מותאמת מעל חלון ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח תמונה. (A) תמונת RGB מומרת מכל תמונה בצבע בודד. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (B)רישום תמונה באמצעות קוד מותאם אישית שנערך. (C)GUI של הקוד המותאם אישית. (i) מיקום קלט עבור קצב הפריימים. קצב הפריימים המוגדר כברירת מחדל הוא 0.16 s/frame. (ii) לחצנים לציור ROIs. (iii) האזור שבו מוצגת התמונה שנטענה. (iv) אות הסידן של ה- ROI שנבחר מוצג כעקבות ירוקים, ואילו האות חסר הרגישות לסידן של ה- ROI שנבחר מוצג כעקבות אדומים. (v) ניתוח רצומטרי ו- ΔF/F מחושבים באופן אוטומטי. גרף ΔF/F מוצג במגנטה. (vi) לחצנים לטעינת תמונה. ניתוח חדש מיועד לטעינת תמונה שהומרה RGB. נתוני טעינה מיועדים לטעינת תמונה שכבר עברה רישום. (vii) לחצן שמור מעקב הוא לשמור על גרף ΔF/F ואת ROI נבחר ב viii. לחצן מחק מעקב הוא להסיר גרףF/F מ viii. (viii) עקבות סידן שמורות מוצגים. (ix) אזור למילוי שם הקובץ. לחצן סיום הוא לחלץ נתונים ולשמור אותם באותה ספריה של הקוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פני השטח של לשון העכבר ובלוטות הטעם בפפילה הפטרייתית. (א)פני השטח של לשון העכבר נלכדים בשדה גדול. פפילה פילפורמית בלוטות טעם, ואת מבנה הקולגן מוצגים. כל מבנה מצוין בצבעים שונים: מגנטה, צהוב וירוק, בהתאמה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (B)בלוטות טעם מ- (A) מוגדלת ונלכדת באמצעות שלושה גלאי מסנן פליטה שונים. הפפילה הפילפורמית, בצהוב, נלכדת באמצעות גלאי 525/50 ננומטר. מבנה זה נצפה ממש מפני השטח של הלשון עד ~ 25 מיקרומטר לעומק. אותות GCaMP באותות ירוקים ו- tdTomato באדום מייצגים את תאי הטעם. אותות אלה מזוהים על ידי גלאי 525/50 ו 607/70 ננומטר, בהתאמה. רודמין דקסטרן המייצג את זרימת הדם נלכד הן בגלאי 525/50 והן בגלאי 607/70 ננומטר. מבנה הקולגן המוצג בכחול ציאן נרכש על ידי גלאי 447/60 ננומטר. התמונה האחרונה מציגה את כל התמונות הקודמות שמוזגו. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הקרנת טעם של עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato ב- vivo. (A)בלוטות טעם מייצגות של עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato. התמונה מוצגת כצבע פסאודו מבוסס עוצמה. קווים מקווקווים תפירה של כל תא טעם. הבהירות של כל תא טעם תלויה בביטוי של חלבון פלואורסצנטי ובעומק מיקום תא הטעם. מוט קנה מידה, 10 מיקרומטר. (B)עקבות הסידן של כל תא טעם לחמשת גירויי הטעם הבסיסיים. כל ניסוי חוזר מוצג באפור על הגב והעקבות הממוצעים מוצגים מעל כל משפט. מעקבים צבעוניים מוגדרים כמגיבים ואילו מעקבים שחורים מוגדרים כלא מגיבים. כל צבע מייצג טעם שונה. מלוח(L) מייצג מלוח נמוך, עם תערובת של 400 mM NaCl ו 50 μM אמילוריד המשמש לגירוי טעם. מלוח(H) מייצג מלוח גבוה, עם 400 mM NaCl המשמש לגירוי. גירוי טעם מוצג כקופסה אפורה על הגב של כל עקבות סידן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתואר כאן פרוטוקול מפורט כדי להחיל μTongue על החקירה של פעילויות פונקציונליות של תאי טעם ב vivo. בפרוטוקול זה, מתבצעת ההדמיה התפקודית על תאי הטעם באמצעות אינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית. בנוסף לשימוש בעכברים מהונדסים, טעינה אלקטרופורטית של צבעי סידן (או צבעי חישת מתח) על תאי הטעם יכולה להיות אפשרות חלופית.

כל פתרונות הטעם פחות מ 1.336 של אינדקס שבירה שימשו בניסוי זה. למרות μTongue מספק משלוח נוזלי יציב ניתוח יחסמטרי ameliorates חפצים הדמיה, זה יהיה מאתגר עבור החוקרים להשתמש בריכוז גבוה יותר של טעם (למשל, >100 mM סוכרוז עם מדד שבירה ב 1.338). ההבדל הגדול באינדקס השבירה בין רוק מלאכותי לתמיסת טעם מעביר את מישור מוקד התמונה יותר מטווח הפיצוי בתהליך שלאחר התמונה. מבחינה אמפירית, מתקבל מגוון מסוים של אינדקס שבירה של פתרון הטעם (פחות מ- 1.336) המאפשר הדמיה תאית יציבה בזמן אמת.

עבור חוקרים מנוסים בהדמיית פלואורסצנטיות וטיפול בבעלי חיים, פרוטוקול זה ניתן ללמוד בקלות על תרגול חוזר ונשנה. עם זאת, הוא מכיל שלבים קריטיים, אשר לעתים קרובות לעכב רכישת נתונים מוצלחת. ראשית, לאחר מוחצן מן האדיבות האוראלית, הלשון צריכה להישמר לח עם רוק מלאכותי כדי לשמר את microenvironment רירי טבעי. שנית, זרימת הדם סביב בלוטות הטעם צריכה להיות שלמה, כדי לשמור על אספקה פיזיולוגית של חמצן, חומרים מזינים וגורמים המועברים בדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים: ג'יי האן ומ. צ'וי הם ממציאים של טכנולוגיית ה-μTongue המוגנת בפטנט המתוארת במאמר זה, ומערכת ה-μTongue זמינה מסחרית באמצעות SciTech Korea.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R015-D1), מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מס '2019M3A9E2061789), ועל ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) הממומן על ידי ממשלת קוריאה (מס '2019M3E5D2A01058329). אנו מודים לאונסו קים ויוג'ין לי על הסיוע הטכני שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acesulfame K Sigma Aldrich 04054-25G Artificial saliva / tastant
calcium chloride solution Sigma Aldrich 21115-100ML Artificial saliva / tastant
citric acid Sigma Aldrich C0759-100G Artificial saliva / tastant
cycloheximide Sigma Aldrich 01810-5G Artificial saliva / tastant
denatonium Sigma Aldrich D5765-5G Artificial saliva / tastant
Dental glue Denkist P0000CJT-A2 Animal preparation
Image J NIH ImageJ Data analysis
IMP Sigma Aldrich 57510-5G Artificial saliva / tastant
Instant adhesive Loctite Loctite 4161, Henkel Animal preparation
K2HPO4 Sigma Aldrich P3786-100G Artificial saliva / tastant
KCl Sigma Aldrich P9541-500G Artificial saliva / tastant
Ketamine Yuhan Ketamine 50 Animal preparation
KH2PO4 Sigma Aldrich P0662-25G Artificial saliva / tastant
KHCO3 Sigma Aldrich 237205-500G Artificial saliva / tastant
MATLAB Mathwork MATLAB Data analysis
MgCl2 Sigma Aldrich M8266-100G Artificial saliva / tastant
MPG Sigma Aldrich 49601-100G Artificial saliva / tastant
Mutiphoton microscope Thorlab  Bergamo II Microscope
NaCl Sigma Aldrich S3014-500G Artificial saliva / tastant
NaHCO3 Sigma Aldrich 792519-500G Artificial saliva / tastant
Objective Nikon N16XLWD-PF Microscope
Octaflow ALA Scientific Instruments OCTAFLOW II Fluidic control
PC LG Lg15N54 Fluidic control
PH meter Thermoscientific ORION STAR AZ11 Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich 806562 Artificial saliva / tastant
quinine Sigma Aldrich Q1125-5G Artificial saliva / tastant
Syringe pump Havard Apparatus PHD ULTRA 4400 Fluidic control
TRITC-dextran Sigma Aldrich 52194-1G Animal preparation
Ultrafast fiber laser Toptica FFultra920 01042 Microscope
Xylazine Bayer Korea Rompun Animal preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
  2. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  3. Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
  4. Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
  5. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  6. Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
  7. Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
  8. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  9. Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
  10. Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
  11. Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
  12. Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
  13. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
  16. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  17. Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).

Tags

מדעי המוח גיליון 170 טעם לשון מיקרופלואידיקה הדמיית סידן in vivo מיקרוסקופיה דו פוטונית
μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון <em>ב- Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, J., Choi, P., Choi, M.… More

Han, J., Choi, P., Choi, M. µTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo. J. Vis. Exp. (170), e62361, doi:10.3791/62361 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter