Summary
Artiklen introducerer μTongue (microfluidics-on-a-tongue) enhed til funktionel smag celle imaging in vivo ved at integrere mikrofluidics i en intravital billeddannelse vindue på tungen.
Abstract
Intravital fluorescensmikroskopi er et værktøj, der i vid udstrækning anvendes til at studere flercellet dynamik i et levende dyr. Det er dog ikke blevet anvendt med succes i smagssensororganet. Ved at integrere mikrofluidics i intravital tunge billeddannelse vindue, μTongue giver pålidelige funktionelle billeder af smagsceller in vivo under kontrolleret eksponering for flere smagsmidler. I dette papir præsenteres en detaljeret trinvis procedure for at udnytte μTongue-systemet. Der er fem underafsnit: udarbejdelse af lækre løsninger, opsætning af et mikrofluidisk modul, prøvemontering, erhvervelse af funktionelle billeddata og dataanalyse. Nogle tips og teknikker til at løse de praktiske problemer, der kan opstå, når du bruger μTongue er også præsenteret.
Introduction
Intravital fluorescens mikroskop bruges i vid udstrækning til at studere spatiotemporal dynamik på levende væv. Forskere er i rivende udvikling genetisk kodede sensorer, der giver specifikke og følsomme transformationer af de biologiske processer til fluorescenssignaler - som let kan registreres ved hjælp af fluorescensmikroskoper, der er bredt tilgængelige1,2. Selvom de fleste indre organer hos gnavere er blevet undersøgt ved hjælp af mikroskopet, har dets vellykkede anvendelse på tungen endnu ikke været vellykket3.
Tidligere undersøgelser af calcium imaging af smagsceller blev udført ex vivo ved tynd-sektion en tunge væv for at opnå circumvallate smagsløg4,5,6 eller ved peeling off smagen epitel for at opnå fungiforme smagsløg7,8. Forberedelsen af disse prøver var uundgåeligt invasiv, således var de naturlige mikromiljøer såsom nerver innervation, permeabilitet barrierer, og blodcirkulationen, stort set forstyrret. Den første intravital tunge imaging vindue blev rapporteret i 2015 af Choi et al., men pålidelig funktionel optagelse var ikke opnåelig på grund af bevægelse og optiske artefakter forårsaget af fluidictastant stimuli9.
For nylig blev mikrofluidics-on-a-tongue (μTongue) introduceret10. Denne enhed integrerer et mikrofluidisk system med et billedvindue på musetungen. Ved at opnå en kvasi-steady-state strøm af smagsfulde stimuli i hele billeddannelsesperioden, artefakter fra fluidisk bevægelse kunne minimeres (Figur 1). Indgangsporten føres af en række multikanaltrykregulatorer, mens udgangsporten er tilsluttet en sprøjtepumpe, som opretholder 0,3 mL/min. Derudover blev optiske artefakter forårsaget af forskellen i brydningsindekser for smagsopløsninger minimeret ved ratiometrisk analyse, der introducerede en calciumfølsom indikator (tdTomato) samt calciumindikatoren (GCaMP6)11. Dette design gav mikroskopisk stabilitet af smagsceller in vivo selv med pludselige skift mellem fluidic kanaler. Derfor implementerer μTongue en pålidelig funktionel screening af flere smagsstoffer til musens smagsløg in vivo.
I denne protokol forklares forsøgsprocedurerne i detaljer for calciumbilleddannelse af musesvampformsmagetasterne in vivo ved hjælp af μTongue. For det første beskrives forberedelsen af kunstig spyt og velsmagende opløsninger. For det andet indføres oprettelsen af det mikrofluidiske system for at opnå den næsten steady-state-strømning. For det tredje afgrænses de procedurer, der anvendes til at montere musetungen på μTongue for at tillade billedopsamling. Endelig er hvert trin til billedanalyse, herunder korrektion af laterale bevægelsesartefakter og ratiometri, angivet. Denne protokol kan let tilpasses ethvert forskningslaboratorium med en musefacilitet og et to-fotonmikroskop eller tilsvarende udstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Sungkyunkwan University og Seoul National University.
1. Tilberedning af opløsninger: kunstig spyt og smagsstoffer
- Klargør kunstig spyt ved opløsning 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH 2 PO4og 1,8 mM HCl i destilleret vand (>1 L), og juster opløsningens pH7(se materialetabel)12.
- Forbered smagsmidler, såsom sur: 10 mM citronsyre; salt: 400 mM NaCl, eventuelt med 50 μM amilorid; sød: 40 mM acesulfam K; bitter: en blanding af 5 mM kinin, 5 mM denatonium og 20 μM cycloheximid ved at opløse prøvesmagningskemikaliet i det kunstige spyt, der blev fremstillet i trin 1.1.
2. Udarbejdelse af det mikrofluidiske system
BEMÆRK: Smagsstoffer blev leveret til musetungen ved hjælp af et tryk på multikanalvæskeleveringssystem (se figur 1 og materialetabel).
- Fyld reservoirerne i det tryksatte flowperfusionssystem med det kunstige spyt og smagsmidler.
- Tilslut trykluftledningen til regulatorens indgang, og indstil lufttrykket mellem 30 og 50 psi i det fluidiske leveringssystem.
- Indstil regulatorens udgangstryk til 0,4 psi, og kontroller, om der kommer væske ud af røret under dette tryk.
- Tilslut manifolden fra reservoirerne til indgangsporten i μTongue.
- Tilslut udgangsporten af μTongue til en sprøjtepumpe og træk væsken tilbage med ~300 μL∙min-1 for at fastslå steady-state tilstand. Overhold den konstante volumen af en hængende dråbe under μTongue. Juster værdien af indstillingsparameteren afhængigt af eksempelhøjden.
- Afbryd trykluftledningen, og stop sprøjtepumpen, indtil protokoltrin 3 er afsluttet.
3. Museforberedelse til in vivobilleddannelse (figur 2).
BEMÆRK: Alle animalske præparater blev udført om dagen under aseptiske forhold på et laboratoriearbejdsben.
- Musebedøvelse
- Forbered en 7 uger gammel eller ældre mus af begge køn. Brug en genetisk modificeret muselinje, der udtrykker calciumsenserende fluorescensproteiner i smagscellerne.
- Musen er fastholdt for anæstesi. En blanding af 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin sprøjtes intraperitonealt ind i musen13.
- TRITC-dextran (500 kDa) i 2,5% W / V fosfat buffer saltvand administreres intravenøst ind i musen gennem en retro-orbital rute for at observere blodcirkulationen under en billeddannelse session.
- Fastgør et hoved fixer på musen kraniet for at minimere bevægelse artefakter.
- Musehovedet sprøjtes med 70% ETOH, mens musen er placeret i en liggende position. Løft hovedets hud let med sammentr vil og klip ca. 7 mm2 af med en saks.
- Rengør håret omkring hovedbunden, fjern periosteum under huden, anvende en instant lim til kraniet, og vedhæfte en tilpasset hoved fixer.
- Når det øjeblikkelige klæbemiddel er hærdet, skal du anvende dental lim omkring hovedfikseren og belyse med et blåt lys for at størkne dental lim.
- Placer musetungen på den nederste enhed af μTongue.
- Fastgør musens underlæbe til den nederste enhed af μTongue med et øjeblikkeligt klæbemiddel.
- Sæt musen på brættet (museforberedelseskortet i figur 1B) og læg den nederste enhed af μTongue til stolperne (μTongue hold stol i figur 1B). Sørg for, at hullerne ved kanten af den nederste enhed er justeret til stolpen.
- Stram musehovedet fixer til hovedet fixer indehaveren på brættet. Juster derefter afstanden mellem musehovedet og enheden. Drej musehovedet jævnt ca. 45° ved hjælp af hovedfikserholderen. Denne proces forhindrer fysisk kontakt af musenæsen med mikroskopmål.
- Træk musetungen forsigtigt ved hjælp af plastik pincet og fastgør den ventrale side af tungen til oversiden af den nederste enhed af μTongue. Tør derefter overfladen af musetungen med en våd vatpind.
- Sug et stykke papir i det kunstige spyt og læg det på den udsatte overflade af musetungen for at opretholde en våd tilstand.
- Placer de buede skiver på stolperne, der holder begge ender af den nederste del af μTongue.
- Placer musen forberedelse på mikroskop fase. Placer den eksponerede musetunge under det omtrentlige centrum af mikroskopmålområdet. Sørg for ikke at afvige fra scenens dynamiske område. Stram derefter musebrættet på scenen med skruer.
- Placer varmepuden under musekroppen, og temperaturen fastholdes ved 36,5 °C-37,5 °C. Overvåg musens kropstemperatur med en temperatursensor, og styr varmepudens temperatur ved hjælp af et feedbacksignal fra temperatursensoren.
- Drej et tyndt stykke papir og læg det ved musens mund for at forhindre væske i at komme ind i muserøret.
- Fjern det våde væv fra musetungen, og læg den forberedte μTongue på musetungen. Sæt en mikrofluidisk kanal på tungen og juster dens position for at observere tungens overflade gennem billedvinduet.
- Fastgør μTongue ved forsigtigt at skrue i begge ender med minimalt tryktryk.
4. Erhvervelse af billedbehandling
- Tænd for 920 nm to-foton laser og mikroskopet forud for brug.
- Målet om nedsænkning af vanddåb (16x, NA 0,80 eller 25x, NA 1.1) monteres på mikroskopet. Drop det destillerede vand på billedvinduet i μTongue og sænk målet.
- I kameratilstand skal du tænde lyset ved hjælp af kviksølvlampe og belyse tungens overflade.
- Ved at justere Z-aksen skal du søge i det autofluorescent signal fra filiformpapilleren for at finde det omtrentlige fokale plan. Derefter, ved hjælp af X og Y justering drejeknap, finde en smagsløg.
- Skift til multifototilstand. Indstil betingelserne for billedopsamling på følgende måde: excitation bølgelængde: 920 nm; emissionsfiltersæt: 447/60 nm, 525/50 nm og 607/70 nm tovejs rasterscanningstilstand, rammestørrelse: 512 x 512.
- Juster X- og Y-positionerne for at placere smagsløget i midten af billedvinduet.
- Søg blodkarrene omkring smagsløget på omkring to tredjedele højde af smagsløget. Visualiser blodcirkulationen ved TRITC-dextran (500 kDa) injektion fra protokoltrin 3.2. Hvis blodgennemstrømningen træsko, løsne fastsættelsen skruer lidt for at tillade blodgennemstrømning.
- Juster Z-aksen, og find smagsløgets Z-plan, der indeholder et tilstrækkeligt antal smagsceller.
- Fortsæt calciumscanning med 2-6 Hz i 80 s. Giv en smagsopløsning på 20 s ved at tænde for det fluidiske systems reservoir, når billeddannelsen er startet. Efter 20 s smagsstimulering skal du skifte reservoiret tilbage til kunstig spyt.
- Når sekventiel billeddannelse er færdig, skal du vente ca. 3-4 minutter på forhånd til den næste billedsession. Hold det kunstige spyt flyder til musetungen for at vaske den velsmagende genmanent væk fra den forrige billeddannelsessession. Afhængigt af eksperimentets design skal du gentage sessionen efter behov.
- Når in vivo calcium imaging er færdig, aflive musen i henhold til IACUC procedure. Musen under bedøvelse ofres i CO2-kammeret.
BEMÆRK: Kontroller dybden af anæstesi ved hjælp af en tå-knivspids refleks. Under en billeddannelse session, kunstig spyt fra reservoirerne bør leveres konsekvent. Hvis der opstår bobler ved billedvinduet i μTongue, skal boblerne fjernes ved at skubbe dem gennem indgangen eller udgangen af μTongue ved hjælp af stærkt væsketryk.
5. Billedanalyse (Figur 3)
- Billedkonvertering
- Åbn de rå billedfiler ved hjælp af Fiji14 eller en lignende billedanalysesoftware.
- Konverter billedfilen til en RGB-stakfil for at bruge NPL Bud Analyzer-koden.
- Billede > farve > opdelte kanaler
- Billede > farve > flettekanaler og vælge billedet fra trin 5.2.1.
- Billede > farve > stak til RGB
- Billedregistrering
BEMÆRK: Brug den specialskrevne kode til dataanalyse. Der henvises til https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Kør koden med navnet Taste_GUI.m. et GUI-vindue med navnet NPL Bud Analyzer vises. Klik på knappen Ny analyse i øverste højre hjørne, og indlæs derefter det konverterede billede fra trin 5.1. Indstil billedhastigheden over det indlæste billede.
- Tegn interesseområdet over det indlæste billede til registrering. Dobbeltklik på det valgte investeringsafkast, og en automatisk beregnet registrering starter.
- Opnå de relative fluorescensintensitetsændringer (ΔF/F)
- Gå tilbage til vinduet NPL Bud Analyzer for automatisk at vise det registrerede billede fra trin 5.2. Hvis brugeren allerede har en reg-fil, skal du klikke på knappen Indlæs data og vælge _reg.tif-filen.
- Klik på CIRCLE- eller POLYGON-knappen, og placer smagscellens ROI over smagsløgsbilledet.
- Dette præsenterer den rå fluorescensintensitet og calciumsporet (ΔF/F)af den valgte smagscelle automatisk under smagsløgsbilledet.
- Klik på Gem Trace for at præsentere calciumsporet (ΔF/F) i højre side af GUI'en, mens ROI vises over smagsløgsbilledet. Gentag trin 5.3.2-5.3.4, indtil valget af investeringsafkast er afsluttet.
BEMÆRK: Klik på knappen Slet sporing, hvis investeringsafkast er forkert valgt for at fjerne det sidst valgte investeringsafkast og calciumspor. - Når valget af investeringsafkast er afsluttet, skal du skrive filnavnet i nederste højre hjørne og klikke på knappen Udfør for at eksportere ΔF/F calciumsporet som et .xls format og tase budbilledet med ROI'er i et .bmp format.
- Analyse af calciumsporet
- Analyser calciumsporet fra trin 5.3. Overvej, at smagsceller har reageret på smagsstoffer, når fluorescensintensiteten stiger mere end to standardafvigelser i basislinjen, efter at smagsstofferne er leveret4, og p-værdierne er mindre end 0,01 ved hjælp af parrede eller uparrede t-tests10.
- Overvej smagscellen som en respondercelle, hvis den reagerer på en bestemt smag mere end to gange ud af tre forsøg (~ 60%)15.
- Opnå de repræsentative calciumspor ved i gennemsnit individuelle calciumspor erhvervet fra trin 5.4.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pirt-GCaMP6f-tdTomato musen blev brugt til at opnå en smagsløg billede. Overfladen af musetungen var dækket af autofluorescent filiform papillae. Smagsløg spredes sparsomt over tungens overflade (Figur 4A). Billederne af smagsløget og dens struktur blev erhvervet ved hjælp af tre forskellige filterdetektorer. Ved hjælp af filtersættet på 607/70 nm blev tdTomato-signalet fra smagscellerne opnået til ratiometrisk analyse (Figur 4B). Ved hjælp af 525/50 nm filtersættet blev GCaMP-signalet fra de smagsceller og blodkar, der omgiver smagsløget, erhvervet (Figur 4B). Ved hjælp af 447/60 nm filtersættet blev kollagen bindevævet, som strukturelt understøtter smagsløget, erhvervet (Figur 4B).
Efter at have erhvervet billederne af smagsløget og relative strukturer blev in vivo calcium imaging udført ved hjælp af protokollen. Pirt-GCaMP6f-tdTomato-musen blev brugt til at screene på smagsceller (Figur 5A)16. Smagsceller reagerede gentagne gange på deres respektive smagsstimuli (Figur 5B). Smagsceller blev anset for at have reageret på smagstasten, da de opfyldte betingelserne i protokol 5.1.4. I dette forsøg reagerede celle 2 på både søde og umamitastanter. Resultatet er i overensstemmelse med tidligere forskning observere cellulær aktivitet ved hjælp af elektrofysiologi17. Celle 3 reagerede på både 400 mM NaCl og 400 mM NaCl under amiloride. Det implicerer, at celle 3 har brugt en ENaC uafhængig vej til reaktion på salt smag. Smagsløget i dette eksperiment omfattede ikke en celle, der reagerede på sur smag. Screeningen af smagsceller blev udført under stabile billeddannelsesforhold, og hver smagscelle viste en repeterbar respons på en særskilt type smag.
Figur 1: μTongue, en mikrofluidics-baseret funktionel billeddannelsesplatform. (A) Tryk på flydende leveringssystem. i) Trykregulatoren for det fluidiske system er tilsluttet den eksterne luftkilde. Luftkildetrykket justeres mellem 30-50 psi, før trykregulatoren kommer ind. (ii) Lufttrykket fra regulatoren er ca. 0,4 psi. iii) Reservoirer, der indeholder kunstigt spyt og forskellige smagsløsninger, er forbundet med lufttryksregulatorens output. iv) Hvert reservoir konvergerer til en mangfoldighed, der er forbundet med indgangsporten i μTongue. v) En sprøjtepumpe er tilsluttet μTongues output og styrer flowet. (B) μTongue, en mikrofluidics-baseret funktionel billeddannelsesplatform. Navnet på hver del er angivet i figuren. (i) Mus forberedelse bord. (ii) Fluidic system setup bord. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sekventiel beskrivelse af museforberedelse. Vigtige trin i museforberedelsen vises. (A) Retro-orbital injektion af TRITC-dextran. (B) Processen med fastgørelse af en hovedfikser til musekraniet vises. Hovedet hud og periosteum er ryddet. Klæbelim og dental lim bruges til fastgørelse. (C) Hovedfikseren på musekraniet skrues på museforberedelseskortet. (D) Procedure for montering af en tunge på den nederste enhed af μTongue. Et øjeblikkeligt klæbemiddel bruges til tungefiksering. Tungen rengøres ved hjælp af en våd vatpind og dækkes med vådt papirvæv for at forhindre tørhed. (E) Buede skiver påføres begge ender af den nederste enhed af μTongue. (F) Et stykke snoet papirvæv anbringes i musens mundhule. (G) Museforberedelseskortet er monteret på mikroskopstadiet og skruet tæt for at sikre stabile billedforhold. (H) μTongue er placeret på tungen. En objektiv linse justeres over billedvinduet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Billedanalyse. (A) Et RGB-billede konverteres fra hvert enkeltfarvebillede. Skalastang, 10 μm. (B) Billedregistrering ved hjælp af en udført brugerdefineret kode. (C) GUI for den brugerdefinerede kode. (i) Inputplacering for billedhastigheden. Standardrammen er 0,16 s/ramme. (ii) Knapper til at tegne INVESTERINGSAFKAST. iii) Det område, hvor det indlæste billede vises. iv) Calciumsignalet for det valgte investeringsafkast vises som et grønt spor, mens det calciumufølsomme signal for det valgte investeringsafkast vises som et rødt spor. (v) Ratiometrisk analyse og ΔF/F beregnes automatisk. ΔF/F grafen er præsenteret i magenta. (vi) Knapper til indlæsning af billeder. Ny analyse er til indlæsning af et RGB konverteret billede. Indlæsningsdata er til indlæsning af et billede, der allerede har gennemgået registrering. (vii) Knappen Gem sporing er at holde ΔF/F grafen og ROI valgt på viii. Knappen Slet sporing er at fjerne ΔF/ F-grafen fra viii. viii) Der vises gemte kalkspor. (ix) Område, der skal udfyldes af filnavnet. Knappen Udfør er at udtrække data og gemme dem i den samme mappe i koden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Musetungens overflade og en smagsløg i fungiformen papillae. (A) Musetungens overflade fanges i et stort felt. En smagsløg keratiniseret filiform papillae, og kollagenstrukturen vises. Hver struktur er angivet ved hjælp af forskellige farver: magenta, gul og grøn, henholdsvis. Vægtstang, 100 μm. (B) En smagsløg fra (A) forstørres i og indfanges ved hjælp af tre forskellige emissionsfilterdetektorer. Filiformen papillae, i gul, er fanget ved hjælp af en 525/50 nm detektor. Denne struktur observeres fra selve overfladen af tungen op til ~ 25 μm i dybden. GCaMP-signaler i grønne og tdTomato-signaler med rødt repræsenterer smagscellerne. Disse signaler registreres af henholdsvis 525/50- og 607/70 nm-detektorer. Rhodamine dextran repræsenterer blodcirkulationen er fanget på både 525/50 og 607/70 nm detektorer. Kollagenstrukturen vist i cyanblå er erhvervet af 447/60 nm detektorer. Det sidste billede viser alle de tidligere billeder flettet. Skalalinje, 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Smagsscreening af en Pirt-GCaMP6f-tdTomato-mus in vivo. (A) En repræsentativ smagsløg af Pirt-GCaMP6f-tdTomato-musen. Billedet vises som en intensitetsbaseret pseudofarve. Stiplede linjer afgrænser hver smagscelle. Lysstyrken i hver smagscelle afhænger af udtrykket af det fluorescerende protein og dybden af smagscellens placering. Skalastang, 10 μm. (B) Calciumsporet af hver smagscelle for de fem grundlæggende smagsstimuli. Hvert gentaget forsøg vises med gråt på bagsiden, og det gennemsnitlige spor præsenteres over hvert forsøg. Farvede spor defineres som responsive, mens sorte spor defineres som ikke-responsive. Hver farve repræsenterer en anden smag. Salt(L) repræsenterer lav salt, med en blanding af 400 mM NaCl og 50 μM amiloride anvendes til smag stimulation. Salt(H) repræsenterer høj salt, med 400 mM NaCl anvendes til stimulering. Smagsstimulering vises som en grå boks på bagsiden af hvert calciumspor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en detaljeret protokol til at anvende μTongue til undersøgelse af funktionelle aktiviteter af smagsceller in vivo. I denne protokol udføres den funktionelle billeddannelse på smagscellerne ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer. Ud over brugen af transgene mus kan den elektroforeretiske belastning af calciumfarvestoffer (eller spændingsfølsomfarvestoffer) på smagscellerne være en alternativ mulighed.
Alle smagsløsninger mindre end 1.336 af brydningsindeks blev brugt i dette eksperiment. Selvom μTongue giver en stabil fluidic levering og ratiometrisk analyse forbedre billeddannelse artefakter, vil det være udfordrende for forskerne at bruge en højere koncentration af smagsstoffer (f.eks >100 mM saccharose med brydningsindeks i 1.338). Den store forskel i brydningsindekset mellem kunstig spyt og smagsopløsning flytter billedets fokusplan mere end kompensationsområdet efter billedprocessen. Empirisk opnås et vist udvalg af brydningsindeks for smagsopløsning (mindre end 1.336), der tillader stabil cellulær billeddannelse i realtid.
For forskere med erfaring inden for fluorescensbilleddannelse og dyrehåndtering kan denne protokol læres let over gentagen praksis. Den indeholder dog kritiske trin, som ofte hindrer vellykket dataindsamling. For det første skal tungen, når den er eksternaliseret fra den mundtlige høflighed, holdes fugtig med kunstig spyt for at bevare det naturlige slimhindeklimamiljø. For det andet, blodcirkulationen omkring smagsløget bør være intakt, for at opretholde en fysiologisk forsyning af ilt, næringsstoffer, og blodbårne faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer konkurrerende finansielle interesser: J. Han og M. Choi er opfindere af den patenterede μTongue teknologi, der er beskrevet i denne artikel, og μTongue systemet er kommercielt tilgængeligt via SciTech Korea.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (MSIT) (nr. 2019M3A9E2061789) og af National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (MSIT) (nr. 2019M3E5D2A01058329). Vi er taknemmelige for Eunsoo Kim og Eugene Lee for deres tekniske bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
