Summary
Makale, mikroakışkanları dildeki bir intravital görüntüleme penceresine entegre ederek fonksiyonel tat hücresi görüntüleme in vivo için μTongue (dil üzerinde mikroakışkanlar) cihazını tanıtmaktadır.
Abstract
İntravital floresan mikroskopi, canlı bir hayvanda çok hücreli dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Ancak tat duyusal organda başarıyla kullanılmamıştır. μTongue, mikroakışkanları intravital dil görüntüleme penceresine entegre ederek, birden fazla şok tabancasına kontrollü maruz kalma altında vivo tat hücrelerinin güvenilir fonksiyonel görüntülerini sağlar. Bu yazıda, μTongue sistemini kullanmak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sunulmuştur. Beş alt kategori vardır: lezzetli çözümlerin hazırlanması, mikroakışkan bir modülün kurulması, numune montajı, işlevsel görüntü verilerinin alınması ve veri analizi. μTongue kullanırken ortaya çıkabilecek pratik sorunları çözmek için bazı ipuçları ve teknikler de sunulmaktadır.
Introduction
Intravital floresan mikroskop, canlı dokular üzerindeki mekansal dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Araştırmacılar, biyolojik süreçlerin floresan sinyallerine belirli ve hassas dönüşümlerini sağlayan genetik olarak kodlanmış sensörler geliştiriyorlar - bu sensörler yaygın olarak bulunan floresan mikroskoplar kullanılarak kolayca kaydedilebilir1,2. Kemirgenlerdeki çoğu iç organ mikroskop kullanılarak araştırılmış olsa da, dile başarılı uygulaması henüz başarılı olmamıştır3.
Tat hücrelerinin kalsiyum görüntülemesi üzerine daha önceki çalışmalar, sirkülasyon tat tomurcukları 4,5,6elde etmek için bir dil dokusunu ince bölümlere ayırarak veya mantar formu tat tomurcukları elde etmek için tat epitelini soyarak ex vivo yapıldı7,8. Bu örneklerin hazırlanması kaçınılmaz olarak invazivdi, bu nedenle sinirlerin innervasyonu, geçirgenlik bariyerleri ve kan dolaşımı gibi doğal mikroçevreler büyük ölçüde pertüre edildi. İlk intravital dil görüntüleme penceresi 2015 yılında Choi ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir, ancak akışkan tastant uyaranların neden olduğu hareket ve optik eserler nedeniyle güvenilir fonksiyonel kayıt elde edilemedi9.
Son zamanlarda, mikroakışkanlar-on-a-language (μTongue)tanıtıldı 10. Bu cihaz, fare dilinde bir görüntüleme penceresi ile mikroakışkan bir sistemi entegre eder. Görüntüleme süresi boyunca sabit bir uyarıcı uyaran akışı elde edilerek, akışkan hareketten elde edilen eserler en aza indirilebilir (Şekil 1). Giriş porti bir dizi çok kanallı basınç kontrolörü tarafından beslenirken, çıkış bağlantı noktası 0,3 mL/ dk tutan bir şırınna pompasına bağlanır. Ek olarak, şok çözeltilerinin kırılma indekslerindeki farklılık nedeniyle oluşan optik eserler, kalsiyuma duyarsız bir gösterge (tdTomato) ve kalsiyum göstergesi (GCaMP6)11.'yitanıtan oranmetrik analiz ile en aza indirilmiştir. Bu tasarım, akışkan kanallar arasında ani geçişle bile tat hücrelerinin vivo mikroskobik stabilitesini sağladı. Sonuç olarak, μTongue, vivo fare tat tomurcuklarına birden fazla şok tabancasının güvenilir bir fonksiyonel taramasını uygular.
Bu protokolde, μTongue kullanılarak in vivo fare mantar formu tat tomurcuklarının kalsiyum görüntülemesi için deneysel prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İlk olarak, yapay tükürük ve lezzetli çözeltilerin hazırlanması açıklanmaktadır. İkinci olarak, yarı sabit durum akışını sağlamak için mikroakışkan sistemin kurulmasına geçilir. Üçüncü olarak, görüntü alımına izin vermek için fare dilini μTongue'a monte etmek için kullanılan prosedürler tanımlanmıştır. Son olarak, yanal hareket yapıtlarının ve oranmetrisinin düzeltilmesi de dahil olmak üzere görüntü analizi için her adım belirtilir. Bu protokol, bir fare tesisi ve iki foton mikroskobu veya eşdeğer bir ekipman ile herhangi bir araştırma laboratuvarına kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm cerrahi prosedürler Sungkyunkwan Üniversitesi ve Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Çözümlerin hazırlanması: yapay tükürük ve şok tabancaları
- 2 mM NaCl, 5 mM KCl çözünerek yapay tükürük hazırlayın, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4, damıtılmış suda 0,12 mM KH2PO4ve 1,8 mM HCl (>1 L) ve çözeltinin pH'ını 7 olarak ayarlayın(bkz. Malzeme Tablosu )12.
- Ekşi: 10 mM sitrik asit gibi uyarıcılar hazırlayın; tuzlu: 400 mM NaCl, isteğe bağlı olarak 50 μM amilorid ile; tatlı: 40 mM asasulfame K; acı: 1.1 adımında hazırlanan yapay tükürükteki tatma kimyasalını eriterek 5 mM kinin, 5 mM denatonyum ve 20 μM sikloeximid karışımı.
2. Mikroakışkan sistemin hazırlanması
NOT: Şok tabancaları basınçlı çok kanallı akışkan bir dağıtım sistemi kullanılarak fare diline teslim edilmiştir (şekil 1 ve malzeme tablosunabakın).
- Basınçlı akış perfüzyon sisteminin rezervuarlarını yapay tükürük ve şok tabancaları ile doldurun.
- Basınçlı hava hattını regülatör girişine bağlayın ve akışkan teslimat sisteminde hava basıncını 30 ila 50 psi arasında ayarlayın.
- Regülatörün çıkış basıncını 0,4 psi olarak ayarlayın ve bu basınç altında tüpten sıvı çıkıp çıkmamasını kontrol edin.
- Manifoldu rezervuarlardan μTongue giriş limanına bağlayın.
- μTongue çıkış portu bir şırıng pompasına bağlayın ve sabit durum durumunu belirlemek için sıvıyı ~300 μL⭐min-1 ile çekin. μTongue altında asılı bir damlacık sabit hacmini gözlemleyin. Örnek yüksekliğe bağlı olarak ayar parametresinin değerini ayarlayın.
- Basınçlı hava hattını çıkarın ve protokol 3 tamamlanana kadar şırınna pompasını durdurun.
3. In vivo görüntüleme için fare hazırlığı(Şekil 2).
NOT: Tüm hayvan preparatları gündüzleri bir laboratuvar tezgahında aseptik koşullar altında gerçekleştirildi.
- Fare anestezisi
- Her iki cinsiyette de 7 haftalık veya daha yaşlı bir fare hazırlayın. Tat hücrelerinde kalsiyum algılayan floresan proteinleri ifade eden genetiği değiştirilmiş bir fare hattı kullanın.
- Fare anestezi için kısıtlanmıştır. Fareye intraperitoneally olarak 100 mg/ kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin karışımı enjekte edilir13.
- %2,5 W/V fosfat tampon salinindeki TRITC-dektran (500 kDa), görüntüleme seansı sırasında kan dolaşımını gözlemlemek için retro yörüngeli bir rota üzerinden fareye intravenöz olarak iletilir.
- Hareket yapıtlarını en aza indirmek için fare kafatasına bir kafa düzeltici takın.
- Fare başı% 70 ETOH ile püskürtülürken, fare bir destek konumuna yerleştirilir. Kafa derisini sertps ile hafifçe kaldırın ve makasla yaklaşık 7 mm2 kesin.
- Saç derisinin etrafındaki saçları temizleyin, cildin altındaki periosteumu çıkarın, kafatasına anında bir yapıştırıcı uygulayın ve özelleştirilmiş bir kafa düzeltici takın.
- Anında yapıştırıcı sertleştikten sonra, baş düzelticinin etrafına diş yapıştırıcısı uygulayın ve diş tutkalını katılaştırmak için mavi bir ışıkla aydınlatın.
- Fare dilini μTongue'un alt birimine yerleştirin.
- Farenin alt dudağını anında yapıştırıcı ile μTongue'un alt ünitesine takın.
- Fareyi tahtaya yerleştirin (Şekil 1B'dekifare hazırlama tahtası) ve μTongue'un alt birimini direklere yerleştirin (Şekil 1B'deμTongue tutma direği). Alt ünitenin kenarındaki deliklerin direğe hizalı olduğundan emin olun.
- Fare kafası düzelticisini tahtadaki kafa düzeltici tutucusuna sıkın. Ardından, fare kafası ile cihaz arasındaki mesafeyi ayarlayın. Kafa sabitleyici tutucuyu kullanarak fare kafasını yaklaşık 45° düzgün bir şekilde döndürün. Bu işlem mikroskop hedefi ile fare burnunun fiziksel temasını önler.
- Fare dilini plastik cımbız kullanarak hafifçe çizin ve dilin ventral tarafını μTongue'un alt ünitesinin üst tarafına takın. Ardından, fare dilinin yüzeyini ıslak bir pamuklu çubukla silin.
- Bir kağıt parçasını yapay tükürükte bekletin ve ıslak bir durumu korumak için fare dilinin açık yüzeyine yerleştirin.
- Kavisli pulları μTongue'un alt kısmının her iki ucunun her iki ucunun da yer tutan direklere yerleştirin.
- Fare hazırlığını mikroskop aşamasına yerleştirin. Açıkta kalan fare dilini mikroskop nesnel alanının yaklaşık merkezinin altına yerleştirin. Sahnenin dinamik aralığından sapmamaya dikkat edin. Ardından, sahnedeki fare tahtasını vidalarla sıkın.
- Isıtma yastığını fare gövdesinin altına yerleştirin ve sıcaklığı 36,5 °C-37,5 °C'de koruyun. Fare gövdesi sıcaklığını bir sıcaklık sensörü ile izleyin ve sıcaklık sensöründen gelen geri bildirim sinyalini kullanarak ısıtma yastığının sıcaklığını kontrol edin.
- İnce bir kağıt parçasını çevirin ve sıvının fare nefes borusuna girmesini önlemek için farenin ağzına yerleştirin.
- Islak dokuyu fare dilinden çıkarın ve hazırlanan μTongue'u fare diline yerleştirin. Dilin üzerine mikroakışkan bir kanal yerleştirin ve görüntüleme penceresinden dilin yüzeyini gözlemleyecek şekilde konumunu ayarlayın.
- μTongue'yi her iki ucu da minimum basınç basıncıyla hafifçe vidalayarak sabitleyin.
4. Görüntüleme kazanımı
- 920 nm iki foton lazeri ve mikroskobu kullanımdan önce açın.
- Suya daldırma hedefini (16x, NA 0.80 veya 25x, NA 1.1) mikroskop üzerine monte edin. Damıtılmış suyu μTongue'un görüntüleme penceresine bırakın ve hedefi daldırın.
- Kamera modunda, cıva lambasını kullanarak ışığı açın ve dilin yüzeyini aydınlatın.
- Z eksenini ayarlayarak, yaklaşık odak düzlemini bulmak için filiform papilladan gelen otofluoresan sinyali arayın. Ardından, X ve Y ayar düğmesini kullanarak bir tat alma tomurcuk bulun.
- Çokoton moduna geçin. Görüntü alma koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: heyecan dalga boyu: 920 nm; emisyon filtre seti: 447/60 nm, 525/50 nm ve 607/70 nm; çift yönlü raster tarama modu, çerçeve boyutu: 512 x 512.
- Tat alma tomurcuklarını görüntü penceresinin ortasına yerleştirmek için X ve Y konumlarını ayarlayın.
- Tat alma tomurcukunun yaklaşık üçte iki yüksekliğinde tat tomurcukunu çevreleyen kan damarlarını arayın. Protokol adım 3.2'den TRITC-dektran (500 kDa) enjeksiyonu ile kan dolaşımını görselleştirin. Kan akışı tıkanırsa, kan akışını sağlamak için sabitleme vidalarını hafifçe gevşetin.
- Z eksenini ayarlayın ve yeterli sayıda tat hücresi içeren tat tomurcuklarının Z düzlemini bulun.
- 80 s için 2-6 Hz ile kalsiyum görüntülemeye devam edin. Görüntüleme başladıktan sonra akışkan sistemin rezervuarını açarak 20 s'lik bir tat çözeltisi sağlayın. 20 s tat stimülasyonundan sonra rezervuarı tekrar yapay tükürük sınayın.
- Sıralı görüntüleme bittikten sonra, bir sonraki görüntüleme seansına kadar yaklaşık 3-4 dakika bekleyin. Yapay tükürüğün fare diline akmasını ve önceki görüntüleme seansındaki gergin remanent'i temizlemesini tutun. Denemenin tasarımına bağlı olarak, oturumu gerektiği gibi tekrarlayın.
- In vivo kalsiyum görüntüleme tamamlandığında, fareyi IACUC prosedürüne göre ötenazi edin. Anestezi altındaki fare CO2 odasında feda edilir.
NOT: Bir parmak sıkışma refleksi kullanarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Bir görüntüleme seansı sırasında, rezervuarlardan yapay tükürük sürekli olarak sağlanmalıdır. Kabarcıklar μTongue görüntüleme penceresinde görünürse, kabarcıkları güçlü sıvı basıncı kullanarak μTongue'un girişine veya çıkışına iterek çıkarın.
5. Görüntü analizi (Şekil 3)
- Resim dönüştürme
- Fiji14 veya benzer bir görüntü analiz yazılımı kullanarak ham görüntü dosyalarını açın.
- NPL Bud Analyzer kodunu kullanmak için görüntü dosyasını RGB yığın dosyasına dönüştürün.
- Görüntü > Renk > Bölünmüş Kanallar
- Görüntü > Renk > Kanalları Birleştirin ve 5.2.1 adımından görüntüyü seçin.
- Görüntü > Renk > Yığını RGB'ye
- Resim kaydı
NOT: Veri analizi için özel yazılmış kodu kullanın. Lütfen https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer bakın.- Taste_GUI.madlı kodu çalıştırın; NPL Bud Analyzer adlı bir GUI penceresi açılır. Sağ üst köşedeki Yeni Analiz düğmesine tıklayın, ardından dönüştürülen görüntüyü adım 5.1'den yükleyin. Kare hızını yüklenen görüntünün üzerine ayarlayın.
- Kayıt için yüklenen görüntünün üzerine ilgi çekici bölgeyi (YG) çizin. Seçilen yatırım getirisini çift tıklayıp otomatik olarak hesaplanan bir kayıt başlayacaktır.
- Göreli floresan yoğunluğu değişikliklerini elde edin (ΔF/F)
- 5.2 adımındaki kayıtlı görüntüyü otomatik olarak göstermek için NPL Tomurcuk Çözümleyicisi penceresine geri dönün. Kullanıcının zaten bir reg dosyası varsa, Veri Yükle düğmesini tıklatın ve _reg.tif dosyasını seçin.
- CIRCLE veya POLYGON düğmesine tıklayın ve tat hücresinin yatırım getirisini tat alma tomurcuk görüntüsünün üzerine getirin.
- Bu, seçilen tat hücresinin ham floresan yoğunluğunu ve kalsiyum izini (ΔF/F)tat alma tomurcuk görüntüsünün altında otomatik olarak sunar.
- GUI'nin sağ tarafındaki kalsiyum izini (ΔF/F)sunmak için İzlemeyi Kaydet'e tıklayın, ancak yatırım getirisi tat alma tomurcuk görüntüsü üzerinde gösterilir. Yatırım getirisi seçimi tamamlanana kadar 5.3.2-5.3.4 adımlarını yineleyin.
NOT: Son seçilen yatırım getirisi ve kalsiyum izlemesini ortadan kaldırmak için yatırım getirisi yanlış seçilmişse İzlemeyi Sil düğmesine tıklayın. - Yatırım getirisi seçimi tamamlandıktan sonra, sağ alt köşeye dosya adını yazın ve ΔF/F kalsiyum izini .xls bir biçim olarak dışa ve PPI'lı şok tomurcuk görüntüsünü .bmp bir biçimde dışa aktarmak için Son düğmesine tıklayın.
- Kalsiyum izinin analizi
- Adım 5.3'ten elde edilen kalsiyum izini analiz edin. Tat hücrelerinin, floresan 4 teslim edildikten sonra floresan yoğunluğu taban çizgisinin ikiden fazla standart sapması arttığında p -değerlerinineşleştirilmişveya eşleşmemiş t-testleri10 kullanılarak 0,01'den az olduğunda şok tabancasına tepki verdiğini düşünün.
- Tat hücresini bir yanıtlayıcı hücre olarak düşünün, eğer üç denemeden iki kereden fazla bir tastant yanıt veriyorsa (~%60)15.
- Adım 5.4.1'den elde edilen bireysel kalsiyum izlerini ortalama alarak temsili kalsiyum izlerini elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresi tat alma tokası görüntüsü elde etmek için kullanıldı. Fare dilinin yüzeyi otofluoresan filiform papilla ile kaplıydı. Tat tomurcukları dilin yüzeyine seyrek olarak yayılır (Şekil 4A). Tat alma tomurcukunun ve yapısının görüntüleri üç farklı filtre dedektörü kullanılarak elde edildi. 607/70 nm filtre seti kullanılarak, oranmetrik analiz için tat hücrelerinden tdTomato sinyali elde edildi (Şekil 4B). 525/50 nm filtre seti kullanılarak, tat alma tomurcuklarını çevreleyen tat hücrelerinden ve kan damarlarından GCaMP sinyali elde edilmiştir (Şekil 4B). 447/60 nm filtre seti kullanılarak, tat tomurcuklarını yapısal olarak destekleyen kollajen bağ dokusu elde edildi (Şekil 4B).
Tat alma tomurcuklarının ve bağıl yapıların görüntülerini aldıktan sonra, protokol kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme yapıldı. Pirt-GCaMP6f-tdTomato fare tat hücrelerini taramak için kullanıldı (Şekil 5A)16. Tat hücreleri kendi tat uyaranlarına tekrar tekrar yanıt verdi (Şekil 5B). Tat hücrelerinin protokol 5.1.4'te sunulan koşulları yerine getirmekte olan şok tabancasına tepki verdikleri kabul edildi. Bu denemede, hücre 2 hem tatlı hem de umami tastantlarına yanıt verdi. Sonuç, elektrofizyoloji kullanarak hücresel aktiviteyi gözlemleyen önceki araştırmalarlatutarlıdır 17. Hücre 3, amilorür altında hem 400 mM NaCl hem de 400 mM NaCl'ye yanıt verdi. Hücre 3'ün tuzlu tada yanıt için ENaC bağımsız bir yol kullandığını ima eder. Bu deneydeki tat alma toynak ekşi tatlara cevap veren bir hücre içermede değildi. Tat hücrelerinin taranma işlemi istikrarlı görüntüleme koşulları altında gerçekleştirildi ve her tat hücresi farklı bir tat türüne tekrarlanabilir bir yanıt gösterdi.
Şekil 1: Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu μTongue. (A) Basınçlı akışkan iletim sistemi. (i) Akışkan sistemin basınç regülatörü harici hava kaynağına bağlanır. Basınç regülatörüne girmeden önce hava kaynağının basıncı 30-50 psi arasında ayarlanır. (ii) Regülatörden gelen hava basıncı yaklaşık 0,4 psi'dir. (iii) Yapay tükürük ve farklı tat çözeltileri içeren rezervuarlar hava basıncı regülatörü çıkışına bağlanır. (iv) Her rezervuar, μTongue'un giriş bağlantı noktasına bağlı bir manifolda yakınsar. (v) Bir şırıng pompası μTongue çıkışına bağlanır ve akışı kontrol edilir. (B) μTongue, mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu. Her parçanın adı şekilde belirtilir. (i) Fare hazırlama tahtası. (ii) Akışkan sistem kurulum kartı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare hazırlığının sıralı açıklaması. Fare hazırlamada önemli adımlar gösterilir. (A) TRITC-dektran retro-orbital enjeksiyonu. (B) Bir kafa düzelticinin fare kafatasına bağlanma işlemi gösterilir. Baş derisi ve periosteum temizlenir. Yapıştırıcı yapıştırıcı ve diş yapıştırıcısı bağlanma için kullanılır. (C) Fare kafatasındaki kafa düzeltici, fare hazırlama tahtasına vidalanır. (D) μTongue'un alt ünitesine dil monte etme prosedürü. Dil fiksasyonu için anında yapıştırıcı kullanılır. Dil ıslak pamuklu çubuk kullanılarak temizlenir ve kuruluğu önlemek için ıslak kağıt mendillerle kaplanır. (E) Kavisli pullar μTongue'un alt ünitesinin her iki ucuna da uygulanır. (F) Fare ağız boşluğuna bükülmüş bir kağıt mendil parçası yerleştirilir. (G) Fare hazırlama tahtası mikroskop aşamasına monte edilir ve sabit görüntüleme koşulları sağlamak için sıkıca vidalanır. (H) μTongue dilin üzerine yerleştirilir. Objektif bir lens görüntüleme penceresi üzerinden ayarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntü analizi. (A) Her tek renkli görüntüden bir RGB görüntü dönüştürülür. Ölçek çubuğu, 10 μm. (B) Yürütülen özel bir kod kullanılarak görüntü kaydı. (C) Özel kodun GUI'si. (i) Kare hızı için giriş konumu. Varsayılan kare hızı 0,16 s/karedir. (ii) ROI çizmek için düğmeler. (iii) Yüklenen görüntünün gösterildiği alan. (iv) Seçilen yatırım getirisinin kalsiyum sinyali yeşil iz olarak gösterilirken, seçilen yatırım getirisinin kalsiyuma duyarsız sinyali kırmızı bir iz olarak gösterilir. (v) Oransal analiz ve ΔF/Fotomatik olarak hesaplanır. ΔF/F grafiği macenta olarak sunulur. (vi) Görüntü yükleme düğmeleri. Yeni Analiz, RGB dönüştürülmüş bir görüntüyü yüklemek içindir. Veri Yükle, zaten kayıttan geçmiş bir görüntüyü yüklemek içindir. (vii) İzlemeyi Kaydet düğmesi, ΔF/F grafiğini ve yatırım getirisini viii'de seçmektir. İzlemeyi Sil düğmesi viii'den ΔF/F grafiğini kaldırmaktır. (viii) Kaydedilen kalsiyum izleri gösterilir. (ix) Dosya adını dolduracak alan. Son düğmesi, verileri ayıklamak ve kodun aynı dizinine kaydetmektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fare dilinin yüzeyi ve mantar biçimi papillasındaki bir tat tosluğu. (A) Fare dilinin yüzeyi geniş bir alanda yakalanır. Bir tat tomurcuk keratinize filiform papilla ve kollajen yapısı gösterilir. Her yapı farklı renkler kullanılarak belirtilir: sırasıyla macenta, sarı ve yeşil. Ölçek çubuğu, 100 μm. (B)(A) gelen bir tat alma tomurcukları üç farklı emisyon filtresi dedektörü kullanılarak büyütülür ve yakalanır. Sarılı filiform papilla, 525/50 nm dedektör kullanılarak yakalanır. Bu yapı dilin yüzeyinden ~ 25 μm derinliğe kadar gözlenir. Yeşildeki GCaMP sinyalleri ve kırmızıdaki tdTomato sinyalleri tat hücrelerini temsil eder. Bu sinyaller sırasıyla 525/50 ve 607/70 nm dedektörler tarafından algılanır. Kan dolaşımını temsil eden rhodamin dektran hem 525/50 hem de 607/70 nm dedektörlerinde yakalanır. Siyan mavisi ile gösterilen kolajen yapısı 447/60 nm dedektörler tarafından elde edilir. Son resim, birleştirilen önceki tüm görüntüleri gösterir. Ölçek çubuğu, 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresinin tadı in vivo. (A) Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresinin temsili bir tat tokası. Görüntü, yoğunluk tabanlı sahte renk olarak gösterilir. Kesik çizgiler her tat hücresini ayırır. Her tat hücresinin parlaklığı floresan proteinin ifadesine ve tat hücresi konumunun derinliğine bağlıdır. Ölçek çubuğu, 10 μm. (B) Beş temel tat uyaranları için her tat hücresinin kalsiyum izi. Tekrarlanan her deneme, arkada gri renkte gösterilir ve ortalama iz her denemenin üzerinde sunulur. Renkli izlemeler duyarlı olarak tanımlanırken, siyah izlemeler yanıt vermeyen olarak tanımlanır. Her renk farklı bir tadı temsil eder. Tuzlu(L), tat stimülasyonu için kullanılan 400 mM NaCl ve 50 μM amilorür karışımı ile düşük tuzlu temsil eder. Tuzlu(H), stimülasyon için kullanılan 400 mM NaCl ile yüksek tuzlu temsil eder. Tat stimülasyonu, her kalsiyum izinin arkasında gri bir kutu olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan, vivo tat hücrelerinin fonksiyonel faaliyetlerinin araştırılmasına μTongue uygulamak için ayrıntılı bir protokoldür. Bu protokolde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak tat hücreleri üzerinde fonksiyonel görüntüleme yapılmaktadır. Transgenik farelerin kullanımına ek olarak, kalsiyum boyalarının (veya voltaj algılama boyalarının) tat hücrelerine elektroforetik olarak yüklenmesi alternatif bir seçenek olabilir.
Bu deneyde kırılma indisinin 1.336'sından daha az tüm tat çözümleri kullanılmıştır. μTongue kararlı bir akışkan iletim sağlamasına ve oranmetrik analiz görüntüleme yapıtlarını iyileştirmesine rağmen, araştırmacıların daha yüksek bir tastant konsantrasyonu kullanması zor olacaktır (örneğin, 1.338'de kırılma indeksine sahip >100 mM sakkaroz). Yapay tükürük ve tat çözeltisi arasındaki kırılma indekslerindeki büyük fark, görüntü odak düzlemini görüntü sonrası işlemle telafi aralığından daha fazla kaydırır. Ampirik olarak, gerçek zamanlı olarak stabil hücresel görüntülemeye izin veren belirli bir kırılma indisi (1.336'dan az) elde edilir.
Floresan görüntüleme ve hayvan işleme konusunda deneyimli araştırmacılar için, bu protokol tekrarlanan uygulama üzerinden kolayca öğrenilebilir. Ancak, genellikle başarılı veri alımını engelleyen kritik adımlar içerir. İlk olarak, oral medenilikten dışsallaştıktan sonra, doğal mukozal mikroçevrimi korumak için dil yapay tükürük ile nemli tutulmalıdır. İkincisi, oksijen, besin ve kan kaynaklı faktörlerin fizyolojik kaynağını korumak için tat tokasının etrafındaki kan dolaşımı bozulmamış olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları beyan ediyor: J. Han ve M. Choi, bu makalede açıklanan patentli μTongue teknolojisinin mucitleridir ve μTongue sistemi SciTech Kore aracılığıyla ticari olarak mevcuttur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi olan Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R015-D1) tarafından desteklenmiştir (Hayır. 2019M3A9E2061789) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi (No. 2019M3E5D2A01058329). Eunsoo Kim ve Eugene Lee'ye teknik yardımları için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
