Summary
Der Artikel stellt das μTongue-Gerät (Microfluidics-on-a-Tongue) für die funktionelle Geschmackszellbildgebung in vivo vor, indem die Mikrofluidik in ein intravitalen Bildgebungsfenster auf der Zunge integriert wird.
Abstract
Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie ist ein Werkzeug, das häufig verwendet wird, um die mehrzellige Dynamik bei einem lebenden Tier zu untersuchen. Es wurde jedoch nicht erfolgreich im Geschmackssinnsorgan eingesetzt. Durch die Integration der Mikrofluidik in das intravitaale Zungenbildgebungsfenster liefert die μTongue zuverlässige funktionelle Bilder von Geschmackszellen in vivo unter kontrollierter Exposition gegenüber mehreren Tastantien. In diesem Artikel wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung des μTongue-Systems vorgestellt. Es gibt fünf Unterabschnitte: Vorbereitung von Lösungen, Aufbau eines mikrofluidischen Moduls, Probenmontage, Erfassung funktionaler Bilddaten und Datenanalyse. Einige Tipps und Techniken zur Lösung der praktischen Probleme, die bei der Verwendung der μTongue auftreten können, werden ebenfalls vorgestellt.
Introduction
Das intravitale Fluoreszenzmikroskop wird häufig verwendet, um die raumzeitliche Dynamik an lebenden Geweben zu untersuchen. Forscher entwickeln schnell genetisch kodierte Sensoren, die spezifische und empfindliche Umwandlungen der biologischen Prozesse in Fluoreszenzsignale liefern - die mit fluoreszierenden Mikroskopen, die weit verbreitet sind, leicht aufgezeichnet werden können1,2. Obwohl die meisten inneren Organe bei Nagetieren mit dem Mikroskop untersucht wurden, war seine erfolgreiche Anwendung auf der Zunge noch nicht erfolgreich3.
Frühere Studien zur Calciumbildgebung von Geschmackszellen wurden ex vivo durch Dünnschnitt eines Zungengewebes durchgeführt, um zirkumvallate Geschmacksknospen zu erhalten4,5,6 oder durch Abziehen des Geschmacksepithels, um fungiforme Geschmacksknospen zu erhalten7,8. Die Vorbereitung dieser Proben war zwangsläufig invasiv, so dass die natürlichen Mikroumgebungen wie Nerveninnervation, Permeabilitätsbarrieren und Durchblutung weitgehend gestört waren. Das erste intravitalen Zungenbildgebungsfenster wurde 2015 von Choi et al. berichtet, aber eine zuverlässige funktionelle Aufzeichnung war aufgrund der Bewegung und der optischen Artefakte, die durch fluidische Tastantreize verursacht wurden, nicht erreichbar9.
Vor kurzem wurde die Mikrofluidik-auf-einer-Zunge (μTongue)eingeführt 10. Dieses Gerät integriert ein mikrofluidisches System mit einem Bildgebungsfenster auf der Mauszunge. Durch das Erreichen eines quasi-stationären Flusses von Tastantreizen während des gesamten Bildgebungszeitraums konnten Artefakte aus fluidischen Bewegungen minimiert werden (Abbildung 1). Der Eingangsanschluss wird von einer Reihe von Mehrkanal-Druckreglern gespeist, während der Ausgangsanschluss an eine Spritzenpumpe angeschlossen ist, die 0,3 ml / min hält. Zusätzlich wurden optische Artefakte, die durch den Unterschied in den Brechungsindizes von Tastantlösungen verursacht wurden, durch ratiometrische Analyse minimiert, die einen calcium-unempfindlichen Indikator (tdTomato) sowie den Kalziumindikator (GCaMP6)11einführte. Dieses Design bot eine mikroskopische Stabilität der Geschmackszellen in vivo auch bei abruptem Umschalten zwischen fluidischen Kanälen. Folglich implementieren die μTongue ein zuverlässiges funktionelles Screening mehrerer Tastantien auf die Mausgeschmacksknospen in vivo.
In diesem Protokoll werden die experimentellen Verfahren zur Calciumbildgebung der Mauspilzformen Geschmacksknospen in vivo unter Verwendung von μTongue ausführlich erläutert. Zunächst wird die Herstellung von künstlichem Speichel und Geschmackslösungen beschrieben. Zweitens wird der Aufbau des mikrofluidischen Systems eingeführt, um den quasi-stationären Fluss zu erreichen. Drittens werden die Verfahren zur Montage der Mauszunge auf der μTongue zur Bildaufnahme umrennt. Schließlich wird jeder Schritt für die Bildanalyse, einschließlich der Korrektur von lateralen Bewegungsartefakten und der Ratiometrie, spezifiziert. Dieses Protokoll kann leicht an jedes Forschungslabor mit einer Mauseinrichtung und einem Zwei-Photonen-Mikroskop oder gleichwertigen Geräten angepasst werden.
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Protocol
Alle chirurgischen Eingriffe wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University und der Seoul National University genehmigt.
1. Herstellung von Lösungen: künstlicher Speichel und Geschmacksstoffe
- Künstlichen Speichel durch Auflösen von 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mMK2HPO4, 0,12 mM KH2PO4und 1,8 mM HCl in destilliertem Wasser (>1 L) vorbereiten und den pH-Wert der Lösung auf 7 einstellen (siehe Materialtabelle)12.
- Bereiten Sie Tastantien wie sauer vor: 10 mM Zitronensäure; salzig: 400 mM NaCl, optional mit 50 μM Amilorid; süß: 40 mM Acesulfam K; bitter: eine Mischung aus 5 mM Chinin, 5 mM Denatonium und 20 μM Cycloheximid, indem die Geschmackschemikalie im künstlichen Speichel, der in Schritt 1.1 hergestellt wird, gelöst wird.
2. Herstellung des mikrofluidischen Systems
HINWEIS: Tastants wurden mit einem unter Druck stehenden mehrkanaligen fluidischen Verabreichungssystem an die Mauszunge abgegeben (siehe Abbildung 1 und Materialtabelle).
- Füllen Sie die Reservoirs des unter Druck stehenden Durchflussperfusionssystems mit dem künstlichen Speichel und den Geschmacksstoffen.
- Schließen Sie die Druckluftleitung an den Reglereingang an und stellen Sie den Luftdruck im fluidischen Fördersystem zwischen 30 und 50 psi ein.
- Stellen Sie den Ausgangsdruck des Reglers auf 0,4 psi ein und prüfen Sie, ob unter diesem Druck Flüssigkeit aus dem Rohr kommt.
- Schließen Sie den Verteiler von den Reservoirs an den Eingangsport von μTongue an.
- Schließen Sie den Ausgangsanschluss von μTongue an eine Spritzenpumpe an und entnehmen Sie Flüssigkeit mit ~300 μL∙min-1, um den stationären Zustand herzustellen. Beobachten Sie das konstante Volumen eines hängenden Tröpfchens unter der μTongue. Passen Sie den Wert des Einstellparameters in Abhängigkeit von der Probenhöhe an.
- Trennen Sie die Druckluftleitung und stoppen Sie die Spritzenpumpe, bis Protokollschritt 3 abgeschlossen ist.
3. Vorbereitung der Maus auf die In-vivo-Bildgebung (Abbildung 2).
HINWEIS: Alle tierexperimentellen Vorbereitungen wurden tagsüber unter aseptischen Bedingungen auf einer Laborwerkbank durchgeführt.
- Mausanästhesie
- Bereiten Sie eine 7 Wochen alte oder ältere Maus beiderlei Geschlechts vor. Verwenden Sie eine genetisch veränderte Mauslinie, die kalziumempfindliche Fluoreszenzproteine in den Geschmackszellen exprimieren.
- Die Maus wird zur Anästhesie zurückgehalten. Eine Mischung aus 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin wird intraperitoneal in die Maus injiziert13.
- TRITC-Dextran (500 kDa) in 2,5% W/V Phosphatpuffersalzlösung wird intravenös über einen retroorbitalen Weg in die Maus eingelassen, um die Blutzirkulation während einer Bildgebungssitzung zu beobachten.
- Befestigen Sie einen Kopffixierer am Mausschädel, um Bewegungsartefakte zu minimieren.
- Der Mauskopf wird mit 70% ETOH besprüht, während die Maus in Rückenlage gebracht wird. Heben Sie die Kopfhaut leicht mit einer Zette an und schneiden Sie ca. 7 mm2 mit einer Schere ab.
- Reinigen Sie die Haare um die Kopfhaut, entfernen Sie das Periost unter der Haut, tragen Sie einen sofortigen Klebstoff auf den Schädel auf und befestigen Sie einen maßgeschneiderten Kopffixierer.
- Nachdem der Sofortkleber ausgehärtet ist, tragen Sie Zahnkleber um den Kopffixierer auf und beleuchten Sie mit einem blauen Licht, um den Zahnkleber zu verfestigen.
- Legen Sie die Mauszunge auf die untere Einheit von μTongue.
- Befestigen Sie die Unterlippe der Maus mit einem Sofortkleber an der Unteren Einheit von μTongue.
- Setzen Sie die Maus auf die Platine (Mausvorbereitungsplatine in Abbildung 1B)und setzen Sie die untere Einheit der μTongue an die Pfosten (μTongue Hold-Pfosten in Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Löcher am Rand der Bodeneinheit am Pfosten ausgerichtet sind.
- Ziehen Sie den Mauskopffixierer an der Kopffixiererhalterung am Board fest. Passen Sie dann den Abstand zwischen dem Mauskopf und dem Gerät an. Drehen Sie den Mauskopf mit dem Kopffixiererhalter sanft um ca. 45°. Dieser Prozess verhindert den physischen Kontakt der Mausnase mit Mikroskopobjektiv.
- Ziehen Sie die Mauszunge vorsichtig mit einer Kunststoffpinzette und befestigen Sie die bauchige Seite der Zunge an der Oberseite der unteren Einheit der μTongue. Wischen Sie dann die Oberfläche der Mauszunge mit einem nassen Wattestäbchen ab.
- Tränken Sie ein Stück Papier in den künstlichen Speichel und legen Sie es auf die freiliegende Oberfläche der Mauszunge, um einen nassen Zustand zu erhalten.
- Legen Sie die gekrümmten Unterlegscheiben auf die Pfosten, die beide Enden des unteren Teils von μTongue halten.
- Legen Sie das Mauspräparat auf den Mikroskopstand. Positionieren Sie die freiliegende Mauszunge unter der ungefähren Mitte des Objektivbereichs des Mikroskops. Achten Sie darauf, nicht vom Dynamikumfang der Bühne abzuweichen. Dann ziehen Sie das Mausbrett auf der Bühne mit Schrauben fest.
- Legen Sie das Heizkissen unter den Mauskörper und halten Sie die Temperatur bei 36,5 °C-37,5 °C. Überwachen Sie die Körpertemperatur der Maus mit einem Temperatursensor und steuern Sie die Temperatur des Heizkissens über ein Feedback-Signal des Temperatursensors.
- Drehen Sie ein dünnes Stück Papier und legen Sie es in den Mund der Maus, um zu verhindern, dass Flüssigkeit in die Luftröhre der Maus gelangt.
- Entfernen Sie das nasse Gewebe von der Mauszunge und legen Sie die vorbereitete μTongue auf die Mauszunge. Legen Sie einen mikrofluidischen Kanal auf die Zunge und passen Sie ihre Position an, um die Oberfläche der Zunge durch das Bildfenster zu beobachten.
- Befestigen Sie die μTongue, indem Sie beide Enden mit minimalem Druck vorsichtig anschrauben.
4. Bilderfassung
- Schalten Sie den 920 nm Zwei-Photonen-Laser und das Mikroskop vor dem Gebrauch ein.
- Montieren Sie das Wasserimmersionsobjektiv (16x, NA 0,80 oder 25x, NA 1.1) am Mikroskop. Lassen Sie das destillierte Wasser auf das Bildfenster der μTongue fallen und tauchen Sie das Objektiv ein.
- Schalten Sie im Kameramodus das Licht mit quecksilberfarbener Lampe ein und beleuchten Sie die Oberfläche der Zunge.
- Durch Einstellen der Z-Achse durchsuchen Sie das autofluoreszierende Signal der filiformen Papillen, um die ungefähre Fokusebene zu finden. Suchen Sie dann mit dem X- und Y-Einstellknopf eine Geschmacksknospen.
- Wechseln Sie in den Multiphotonen-Modus. Stellen Sie die Bildaufnahmebedingungen wie folgt ein: Anregungswellenlänge: 920 nm; Emissionsfiltersatz: 447/60 nm, 525/50 nm und 607/70 nm; bidirektionaler Raster-Scan-Modus, Rahmengröße: 512 x 512.
- Passen Sie die X- und Y-Positionen an, um die Geschmacksknospen in der Mitte des Bildfensters zu platzieren.
- Durchsuchen Sie die Blutgefäße, die die Geschmacksknospen umgeben, in etwa zwei Dritteln Höhe der Geschmacksknospen. Visualisieren Sie die Durchblutung durch TRITC-Dextran (500 kDa) Injektion aus Protokollschritt 3.2. Wenn der Blutfluss verstopft, lösen Sie die Befestigungsschrauben leicht, um den Blutfluss zu ermöglichen.
- Stellen Sie die Z-Achse ein und finden Sie die Z-Ebene der Geschmacksknospen, die eine ausreichende Anzahl von Geschmackszellen enthält.
- Fahren Sie mit der Calcium-Bildgebung mit 2-6 Hz für 80 s fort. Bieten Sie eine Geschmackslösung von 20 s, indem Sie das Reservoir des fluidischen Systems nach Beginn der Bildgebung einschalten. Nach 20 s Geschmacksstimulation schalten Sie das Reservoir wieder auf künstlichen Speichel um.
- Nachdem die sequenzielle Bildgebung abgeschlossen ist, warten Sie ca. 3-4 Minuten bis zur nächsten Bildgebungssitzung. Lassen Sie den künstlichen Speichel zur Mauszunge fließen, um das Tastant-Remanent aus der vorherigen Bildgebungssitzung wegzuwaschen. Je nach Design des Experiments wiederholen Sie die Sitzung nach Bedarf.
- Wenn die In-vivo-Kalziumbildgebung abgeschlossen ist, euthanasieren Sie die Maus nach dem IACUC-Verfahren. Die Maus unter Betäubung wird in der CO2-Kammer geopfert.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zehenquetschreflex. Während einer bildgebungsgebenden Sitzung sollte konsequent künstlicher Speichel aus den Reservoirs bereitgestellt werden. Wenn Blasen am Abbildungsfenster der μTongue auftreten, entfernen Sie die Blasen, indem Sie sie mit starkem Flüssigkeitsdruck durch den Eingang oder den Ausgang der μTongue drücken.
5. Bildanalyse (Abbildung 3)
- Bildkonvertierung
- Öffnen Sie die Rohbilddateien mit Fiji14 oder einer ähnlichen Bildanalysesoftware.
- Konvertieren Sie die Bilddatei in eine RGB-Stack-Datei, um den NPL Bud Analyzer-Code zu verwenden.
- Bild > Farb- > Geteilte Kanäle
- Bild > Farb- > Kanäle zusammenführen und wählen Sie das Bild aus Schritt 5.2.1 aus.
- Bild > Farb->-Stack zu RGB
- Bildregistrierung
HINWEIS: Verwenden Sie den benutzerdefinierten Code für die Datenanalyse. Bitte beachten Sie https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Führen Sie den Codenamen Taste_GUI.maus. Ein GUI-Fenster mit dem Namen NPL Bud Analyzer wird angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Analyse in der oberen rechten Ecke und laden Sie dann das konvertierte Bild aus Schritt 5.1. Stellen Sie die Bildrate über dem geladenen Bild ein.
- Zeichnen Sie den Interessenbereich (ROI) über das geladene Bild zur Registrierung. Doppelklicken Sie auf den ausgewählten ROI und eine automatisch berechnete Registrierung beginnt.
- Erhalten Sie die relativen Änderungen der Fluoreszenzintensität (ΔF/F)
- Gehen Sie zurück zum NPL Bud Analyzer-Fenster, um das registrierte Bild aus Schritt 5.2 automatisch anzuzeigen. Wenn der Benutzer bereits über eine Reg-Datei verfügt, klicken Sie auf die Schaltfläche Daten laden und wählen Sie die _reg.tif Datei aus.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche CIRCLE oder POLYGON und positionieren Sie den ROI der Geschmackszelle über dem Geschmacksknospenbild.
- Diese stellt die rohe Fluoreszenzintensität unddie Calciumspur (ΔF/F)der ausgewählten Geschmackszelle automatisch unter dem Geschmacksknospenbild dar.
- Klicken Sie auf Save Trace, um die Calciumspur (ΔF/F) auf der rechten Seite der GUI anzuzeigen, während der ROI über dem Geschmacksknospenbild angezeigt wird. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2-5.3.4, bis die ROI-Auswahl abgeschlossen ist.
HINWEIS: Klicken Sie auf die Schaltfläche Trace löschen, wenn der ROI falsch ausgewählt ist, um den zuletzt ausgewählten ROI und Den Calcium-Trace zu eliminieren. - Nachdem die ROI-Auswahl abgeschlossen ist, schreiben Sie den Dateinamen in die rechte untere Ecke und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen, um die ΔF/F Calcium-Spur als .xls Format und das Tase-Bud-Bild mit ROIs in einem .bmp Format zu exportieren.
- Analyse der Calciumspur
- Analysieren Sie die aus Schritt 5.3 erhaltene Kalziumspur. Bedenken Sie, dass Geschmackszellen auf Tastant reagiert haben, wenn die Fluoreszenzintensität um mehr als zwei Standardabweichungen der Baseline ansteigt, nachdem das Tastant4abgegeben wurde, und p-Wertekleiner als 0,01 sind, wobei gepaarte oder ungepaarte t-Tests10verwendet werden.
- Betrachten Sie die Geschmackszelle als Responderzelle, wenn sie mehr als zweimal von drei Versuchen (~ 60%) auf ein bestimmtes Tastant reagiert15.
- Erhalten Sie die repräsentativen Calciumspuren durch Mittelung einzelner Calciumspuren, die aus Schritt 5.4.1 gewonnen wurden.
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Representative Results
Die Pirt-GCaMP6f-tdTomato Maus wurde verwendet, um ein Geschmacksknospenbild zu erhalten. Die Oberfläche der Mauszunge war mit autofluoreszierenden filiformen Papillen bedeckt. Geschmacksknospen sind spärlich über die Oberfläche der Zunge verteilt (Abbildung 4A). Die Bilder der Geschmacksknospen und ihrer Struktur wurden mit drei verschiedenen Filterdetektoren aufgenommen. Mit dem 607/70 nm Filterset wurde das tdTomato-Signal aus den Geschmackszellen für die ratiometrische Analyse erhalten (Abbildung 4B). Mit dem 525/50 nm Filterset wurde das GCaMP-Signal von den Geschmackszellen und Blutgefäßen, die die Geschmacksknospen umgeben, erfasst (Abbildung 4B). Mit dem 447/60 nm Filterset wurde das Kollagen-Bindegewebe, das die Geschmacksknospen strukturell unterstützt, erfasst (Abbildung 4B).
Nach der Aufnahme der Bilder der Geschmacksknospen und relativen Strukturen wurde eine in vivo Kalziumbildgebung unter Verwendung des Protokolls durchgeführt. Die Pirt-GCaMP6f-tdTomato Maus wurde verwendet, um Geschmackszellen zu screenen (Abbildung 5A)16. Geschmackszellen reagierten wiederholt auf ihre jeweiligen Geschmacksreize (Abbildung 5B). Es wurde angenommen, dass Geschmackszellen auf das Tastant reagiert haben, wenn sie die in Protokoll 5.1.4 dargelegten Bedingungen erfüllten. In dieser Studie reagierte Zelle 2 sowohl auf süße als auch auf Umami-Tastants. Das Ergebnis stimmt mit früheren Forschungen überein, die die Zellaktivität mit Elektrophysiologiebeobachteten 17. Zelle 3 reagierte sowohl auf 400 mM NaCl als auch auf 400 mM NaCl unter Amilorid. Es impliziert, dass Zelle 3 einen ENaC-unabhängigen Weg für die Reaktion auf salzigen Geschmack verwendet hat. Die Geschmacksknospen in diesem Experiment enthielten keine Zelle, die auf saure Geschmäcker reagierte. Das Screening von Geschmackszellen wurde unter stabilen bildgebungsfähigen Bedingungen durchgeführt, und jede Geschmackszelle zeigte eine wiederholbare Reaktion auf eine bestimmte Art von Geschmack.
Abbildung 1: Die μTongue, eine auf Mikrofluidik basierende funktionelle Bildgebungsplattform. (A) Druckbeaufdruckte fluidische Abgabesystem. (i) Der Druckregler des fluidischen Systems ist mit der externen Luftquelle verbunden. Der Druck der Luftquelle wird vor dem Eintritt in den Druckregler zwischen 30-50 psi eingestellt. (ii) Der Luftdruck vom Regler beträgt etwa 0,4 psi. iii) Reservoirs, die künstlichen Speichel und verschiedene Geschmackslösungen enthalten, sind mit dem Ausgang des Luftdruckreglers verbunden. (iv) Jedes Reservoir konvergiert zu einer Mannigfaltigkeit, die mit dem Eingangsport der μTongue verbunden ist. v) Eine Spritzenpumpe ist an den Ausgang der μTongue angeschlossen und steuert den Durchfluss. (B) Die μTongue, eine auf Mikrofluidik basierende funktionelle Bildgebungsplattform. Der Name jedes Teils ist in der Abbildung angegeben. (i) Maus-Vorbereitungstafel. (ii) Fluidic System Setup Board. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Sequenzielle Beschreibung der Mausvorbereitung. Wichtige Schritte in der Mausvorbereitung werden gezeigt. (A) Retroorbitale Injektion von TRITC-Dextran. (B) Der Prozess der Befestigung eines Kopffixierers am Mausschädel wird gezeigt. Die Kopfhaut und das Periost werden gereinigt. Zur Befestigung werden Klebekleber und Dentalkleber verwendet. (C) Der Kopffixierer am Mausschädel wird auf die Mausvorbereitungsplatte geschraubt. (D) Verfahren zur Montage einer Zunge an der unteren Einheit der μTongue. Zur Zungenfixierung wird ein Sofortkleber verwendet. Die Zunge wird mit einem nassen Wattestäbchen gereinigt und mit nassen Papiertaschentüchern bedeckt, um Trockenheit zu vermeiden. (E) Gekrümmte Unterlegscheiben werden an beiden Enden der unteren Einheit der μTongue angebracht. (F) Ein Stück verdrehtes Papiertaschentuch wird in die Mundhöhle der Maus gelegt. (G) Die Mausvorbereitungsplatine wird auf dem Mikroskopstand montiert und fest verschraubt, um stabile Bildgebungsbedingungen zu gewährleisten. (H) Die μTongue wird auf die Zunge gelegt. Ein Objektiv wird über das Bildfenster eingestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bildanalyse. (A) Aus jedem einfarbigen Bild wird ein RGB-Bild konvertiert. Maßstabsleiste, 10 μm. (B) Bildregistrierung mit einem durchgeführten benutzerdefinierten Code. (C) GUI des benutzerdefinierten Codes. (i) Eingabeort für die Bildrate. Die Standardbildrate beträgt 0,16 s/Bild. (ii) Schaltflächen zum Zeichnen von ROIs. (iii) Der Bereich, in dem das geladene Bild angezeigt wird. (iv) Das Calciumsignal des ausgewählten ROI wird als grüne Spur angezeigt, während das calcium-unempfindliche Signal des ausgewählten ROI als rote Spur dargestellt wird. (v) Ratiometrische Analyse und ΔF/F werden automatisch berechnet. Der ΔF/F-Graph wird in Magenta dargestellt. (vi) Schaltflächen zum Laden von Bildern. Die neue Analyse dient zum Laden eines RGB-konvertierten Bildes. Load Data dient zum Laden eines Bildes, das bereits registriert wurde. (vii) Die Schaltfläche Trace speichern besteht darin, das ΔF/F-Diagramm und den ROI bei viii zu halten. Die Schaltfläche Trace löschen dient dazu, das ΔF/F-Diagramm aus viii zu entfernen. (viii) Gespeicherte Calciumspuren werden gezeigt. (ix) Bereich zum Ausfüllen des Dateinamens. Die Schaltfläche Fertig stellen besteht darin, Daten zu extrahieren und im selben Verzeichnis des Codes zu speichern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Oberfläche der Mauszunge und eine Geschmacksknospen in den fungiformen Papillen. (A) Die Oberfläche der Mauszunge wird in einem großen Feld erfasst. Eine Geschmacksknospen keratinisierte filiforme Papillen und die Kollagenstruktur werden gezeigt. Jede Struktur wird mit verschiedenen Farben angezeigt: Magenta, Gelb und Grün. Maßstabsleiste, 100 μm. (B) Eine Geschmacksknospen aus (A) wird vergrößert und mit drei verschiedenen Emissionsfilterdetektoren erfasst. Die filiformen Papillen in Gelb werden mit einem 525/50 nm Detektor erfasst. Diese Struktur wird von der Oberfläche der Zunge bis zu ~25 μm Tiefe beobachtet. GCaMP-Signale in Grün und tdTomato-Signale in Rot stellen die Geschmackszellen dar. Diese Signale werden von 525/50 bzw. 607/70 nm Detektoren detektiert. Rhodamindextrat, das die Durchblutung darstellt, wird sowohl an 525/50- als auch an 607/70-nm-Detektoren erfasst. Die in Cyanblau gezeigte Kollagenstruktur wird von 447/60 nm Detektoren erfasst. Das letzte Bild zeigt alle vorherigen Bilder zusammengeführt. Maßstabsleiste, 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Geschmacksscreening einer Pirt-GCaMP6f-tdTomato-Maus in vivo. (A) Eine repräsentative Geschmacksknospen der Pirt-GCaMP6f-tdTomato-Maus. Das Bild wird als intensitätsbasierte Pseudofarbe dargestellt. Gestrichelte Linien grenzen jede Geschmackszelle ab. Die Helligkeit jeder Geschmackszelle hängt von der Expression des fluoreszierenden Proteins und der Tiefe der Geschmackszellposition ab. Skalenstab, 10 μm. (B) Die Kalziumspur jeder Geschmackszelle für die fünf grundlegenden Geschmacksreize. Jede wiederholte Studie ist auf der Rückseite grau dargestellt und die gemittelte Spur wird über jeder Studie dargestellt. Farbige Ablaufverfolgungen werden als reaktionsfähig definiert, während schwarze Ablaufverfolgungen als nicht reagierend definiert sind. Jede Farbe repräsentiert einen anderen Geschmack. Salty(L) steht für wenig salzig, mit einer Mischung aus 400 mM NaCl und 50 μM Amilorid, die zur Geschmacksstimulation verwendet werden. Salty(H) steht für hochsalzig, wobei 400 mM NaCl zur Stimulation verwendet wird. Die Geschmacksstimulation wird als graue Box auf der Rückseite jeder Kalziumspur angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Anwendung von μTongue auf die Untersuchung funktioneller Aktivitäten von Geschmackszellen in vivo beschrieben. In diesem Protokoll wird die funktionelle Bildgebung an den Geschmackszellen mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren durchgeführt. Neben der Verwendung transgener Mäuse kann die elektrophoretische Belastung von Calciumfarbstoffen (oder Spannungsmessfarbstoffen) auf die Geschmackszellen eine alternative Option sein.
Alle Geschmackslösungen mit einem Brechungsindex von weniger als 1,336 wurden in diesem Experiment verwendet. Obwohl μTongue eine stabile fluidische Abgabe bietet und die ratiometrische Analyse bildgebende Artefakte verbessert, wird es für die Forscher schwierig sein, eine höhere Konzentration von Tastant zu verwenden (z. B. >100 mM Saccharose mit Brechungsindex in 1,338). Der große Unterschied im Brechungsindex zwischen künstlichem Speichel und Geschmackslösung verschiebt die Bildfokusebene stärker als den Kompensationsbereich durch den Post-Image-Prozess. Empirisch wird ein bestimmter Brechungsindex der Geschmackslösung (weniger als 1,336) erhalten, der eine stabile zelluläre Bildgebung in Echtzeit ermöglicht.
Für Forscher, die Erfahrung in der Fluoreszenzbildgebung und im Umgang mit Tieren haben, kann dieses Protokoll leicht durch wiederholtes Üben erlernt werden. Es enthält jedoch kritische Schritte, die eine erfolgreiche Datenerfassung oft behindern. Erstens, sobald sie aus der oralen Höflichkeit externalisiert wurde, sollte die Zunge mit künstlichem Speichel feucht gehalten werden, um die natürliche Mikroumgebung der Schleimhaut zu erhalten. Zweitens sollte die Blutzirkulation um die Geschmacksknospen intakt sein, um eine physiologische Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und durch Blut übertragenen Faktoren aufrechtzuerhalten.
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Disclosures
Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen: J. Han und M. Choi sind Erfinder der in diesem Artikel beschriebenen patentierten μTongue-Technologie, und das μTongue-System ist über SciTech Korea kommerziell erhältlich.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), dem von der koreanischen Regierung finanzierten Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) (NRIT) (Nr. 2019M3A9E2061789) und von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wird (Nr. 2019M3E5D2A01058329). Wir danken Eunsoo Kim und Eugene Lee für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
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