Summary
Det erkänns nu att den tredimensionella miljön av celler kan spela en viktig roll i deras beteende, mognad och / eller differentiering. Detta protokoll beskriver en tredimensionell cellkulturmodell utformad för att studera effekten av fysisk inneslutning och mekaniska begränsningar på megakaryocyter.
Abstract
3D-miljön som leder till både inneslutning och mekaniska begränsningar erkänns alltmer som en viktig bestämningsfaktor för cellbeteende. 3D-kulturen har därför utvecklats för att bättre närma sig in vivo-situationen. Megakaryocyter skiljer sig från hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs) i benmärgen (BM). BM är en av kroppens mjukaste vävnader, instängd i benet. Benet är dåligt utökningsbart på cellskalan, megakaryocyter utsätts samtidigt för en svag styvhet och hög inneslutning. Detta protokoll presenterar en metod för återvinning av mus härstamning negativa (Lin-) HSPCs genom immuno-magnetisk sortering och deras differentiering i mogna megakaryocyter i ett 3D medium bestående av metylcellulosa. Metylcellulosa är icke-reaktiv mot megakaryocyter och dess styvhet kan justeras till den normala benmärgen eller ökas för att efterlikna en patologisk fibrotisk märg. Processen för att återställa megakaryocyterna för ytterligare cellanalyser beskrivs också i protokollet. Även om proplatelet förlängning förhindras inom 3D-miljön, beskrivs det nedan hur man återanvänder megakaryocyterna i flytande medium och kvantifiera deras förmåga att förlänga proplatelets. Megakaryocyter som odlas i 3D-hydrogel har en högre kapacitet att bilda proplatelets jämfört med de som odlas i en flytande miljö. Denna 3D-kultur tillåter i) att skilja stamceller mot megakaryocyter som når ett högre mognadstillstånd, ii) att rekapitulera fenotyper som kan observeras in vivo men gå obemärkt i klassiska flytande kulturer, och iii) att studera transduktionsvägar inducerade av de mekaniska ledtrådar som tillhandahålls av en 3D-miljö.
Introduction
Celler i kroppen upplever en komplex 3D-mikromiljö och utsätts för samspelet mellan kemiska och mekanofysiska signaler inklusive styvhet från vävnaden och inneslutning på grund av närliggande celler och omgivande matris 1,2,3. Vikten av stelhet och inneslutning för cellbeteende har bara erkänts under de senaste decennierna. År 2006 belyste det viktiga arbetet från Engler et al. 4 den mekaniska miljöns betydelse för celldifferentiering. Författarna visade att variation i cell substrat styvhet resulterade i orientering av stamceller mot olika differentiering härstamningar. Sedan dess har effekten av mekaniska signaler på cellens öde och beteende blivit alltmer erkänd och studerade. Trots att det är en av organismens mjukaste vävnader har benmärgen en 3D-strukturell organisation som är begränsad inuti benet. Märg styvhet, även om det är tekniskt svårt att mäta exakt, uppskattas ligga mellan 15 och 300 Pa 5,6. Inom stroman är cellerna tätt begränsade till varandra. Dessutom migrerar de flesta av dem mot sinusoidkärlen för att komma in i blodcirkulationen. Dessa villkor skapar ytterligare mekaniska begränsningar på angränsande celler, som måste anpassa sig till dessa krafter. Mekaniska ledtrådar representerar en viktig parameter vars konsekvenser på megakaryocyt differentiering och proplatelet bildandet nyligen har utforskats. Även om megakaryocyter kan skilja in vitro i traditionell flytande kultur, når de inte den mognadsgrad som observeras in vivo, delvis på grund av frånvaron av de mekaniska signalerna från 3D-miljön 7. Växande stamceller inbäddade i hydrogel ger 3D mekaniska signaler som saknas i flytande miljö.
Hydrogeler har använts i stor utsträckning i flera årtionden inom det hematologiska området, särskilt för att odla celler i kolonibildande analyser för att kvantifiera hematopoetiska stamceller. Sådana hydrogeler har dock sällan använts för att utforska den biologiska effekten av den 3D mekaniska miljön på mognad och differentiering av hematopoetiska celler. Under de senaste åren har vårt laboratorium utvecklat en 3D-odlingsmodell med en metylcellulosabaserad hydrogel 8. Denna icke-inaktiva fysiska gel är ett användbart verktyg för att efterlikna de fysiska begränsningarna i den inhemska megakaryocytmiljön. Det härleds från cellulosa genom att hydroxylrester (-OH) ersätts av metoxidgrupper (-OCH3). Både graden av metylersättning och metylcellulosakoncentrationen bestämmer hydrogelstelheten när den väl har gelé. Under utvecklingsstadiet av denna teknik visades det att en Youngs modulus i intervallet 30 till 60 Pa är den optimala gelstyvheten för megakaryocyttillväxt 9.
Följande protokoll beskriver en metod för att odla mus megakaryocytic stamceller i en 3D metylcellulosa hydrogel. Det har tidigare visats att jämfört med standard flytande kultur ökar denna hydrogelkultur graden av megakaryocytpolyloidisering, förbättrar mognaden och intracellulär organisation och ökar megakaryocyternas kapacitet att förlänga proplatelets när de har återsuspenderat i ett flytande medium 9. Detta manuskript beskriver i detalj protokollet för isolering av musben märg Lin− celler och deras inbäddning i en metylcellulosa hydrogel för 3D-kultur samt kvantifiering av deras förmåga att producera proplatelets och återvinning av cellerna för ytterligare analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök bör utföras i enlighet med institutionella riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. Alla protokoll som visas i videon utfördes i strikt överensstämmelse med eu ropeisk lag och rekommendationerna från granskningsnämnden för Etablissement Français du Sang (EFS). En första version av detta protokoll publicerades ursprungligen 2018 i Methods in Molecular Biology 8.
BILD 1 visar en schematisk vy över hela processen. Denna process omfattar 1) benmärgsdisektion, märghämtning och mekanisk isolering av märgceller, 2) magnetisk sortering av härstamningsnegativa (Lin-) celler, 3) sådd i flytande eller metylcellulosa hydrogel och 4) återupplivning av megakaryocyter odlade i 3D-gel för undersökning av proplateletbildning i flytande medium.
1. Bensamling från vuxna möss
OBS: I detta avsnitt är det viktigt att minimera mikrobiell förorening.
- Förbered ett 15 ml-rör för benuppsamling med Dulbeccos modifierade Eagle's Medium (DMEM) som innehåller 1% av den totala volymen av penicillin-streptomycin-glutamin (PSG) antibiotikablandning (penicillin 10000 U/ml, streptomycin 100000 μg/mL och L-glutamin 29,2 mg/ml).
OBS: Om alla möss som används har samma genotyp, slå alla ben i samma rör som innehåller 1 ml DMEM - PSG 1% per antal möss. Antibiotika är viktiga för att förhindra eventuell bakteriespridning under tiden för benprovtagning. - Fyll ett 50 ml-rör med etanol 70% för bendesinfektion och ett annat för sköljinstrument under proceduren. Använd steriliserade dissekeringsinstrument.
- Bedöva mössen med isofluraninandning (4%) och fortsätt snabbt till livmoderhalsförskjutning för att avliva mössen. Sänk snabbt ner kroppen i 70% etanol för att desinficera och undvika mikrobiell förorening.
- Dissekera snabbt skenben och lårben.
- Skär bort epifyserna i fotledssidans ände för skenbenet och höftsidans ände för lårbenet med hjälp av en skalpell.
- Sänk ner benen i en sekund i 70% etanol innan du nedsänker dem i DMEM-medium som innehåller 1% PSG.
2. Märg dissociation och Lin- cells isolering
OBS: Denna del av protokollet utförs under en laminär flödeshuv. För en kultur är alla brunnar en del av samma experiment och kan inte betraktas som oberoende biologiska replikat. Cellerna från alla möss slås samman för att säkerställa homogeniteten hos alla brunnar och för att kunna jämföra dem med varandra samtidigt som eventuella variationer mellan individer elimineras. För oberoende biologiska replikat måste kulturen upprepas.
- Placera benen i en Petri-skål och rise dem två gånger i steril Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) för att avlägsna potentiella föroreningar.
- Förbered DMEM - 1% PSG i ett 50 ml-rör.
OBS: Ge 2 ml DMEM - 1% PSG per möss som används för experimentet. - Fyll en 5 ml spruta utrustad med en 21-gauge nål med DMEM - 1% PSG.
- Håll benet med tång, introducera bara nålens avfasning vid knäsidans ände.
OBS: Knäsidans epifys ska förbli intakt från dissekeringen och lämna en liten hålighet i mitten genom vilken nålen ska sättas in. Den återstående epifysen kommer att bibehålla benet som är fäst vid nålen under spolning. Var försiktig så att du inte inför mer än avfasningen i benet eftersom det kan krossa och skada märgen. - Tryck snabbt på sprutakolven för att spola ut märgen i ett 50 ml-rör.
OBS: För att undvika stänk och underlätta märg flush och befrielse placera den fria änden av benet på rörväggen, nedsänkt i DMEM - 1% PSG. I praktiken är en volym mellan 500 μL och 1 ml i allmänhet tillräcklig för att driva ut märgen från benet. När märgen har blivit helt utvisad har benet blivit vitt. Om märgen inte helt har uteslutits från diafysen som bedöms av någon återstående röd färg, är det möjligt att upprepa spolningen med färskt medium. - Upprepa steg 2.4. och 2.5. för alla ben, fyll på 5 ml spruta med DMEM - 1% PSG om det behövs.
- Använd samma 5 ml-spruta med 21-gauge nålen för att överföra den totala volymen medium som innehåller spolad märg till runda botten 10 ml-rör.
OBS: Det är inte absolut nödvändigt att byta till ett rundbottnat 10 ml-rör, men det gör det lättare att gå vidare till följande dissociationssteg. Tveka inte att byta spruta och/eller nål om risken för kontaminering misstänks. - Fortsätt till cell dissociation genom att aspirera och utvisa medium- och märgcellerna successivt två gånger genom en 21-gauge nål, tre gånger genom en 23-gauge och en gång genom en 25-gauge nål.
OBS: Undvik luftbubblor eftersom det kan vara skadligt för cellerna. - Överför suspensionen till 15 ml-rör.
- Mät cellnummer och kontrollera livskraften med hjälp av en automatiserad cellräknare eller en cellkammare för manuell räkning i närvaro av trypan blå för att utesluta döda celler.
- Centrifugera 15 ml-rören i 7 min vid 300 x g. Använd en 1 mL överföringspipett, pipetten försiktigt och kassera supernatanten.
- Isolera stam- och stamceller genom negativ immunomagnetisk sortering med hjälp av en mus hematopoetisk cellisolering kit.
OBS: Syftet med denna cellsortering är att hämta de celler som är negativa för alla urvalsantikroppar (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) och därmed eliminera de celler som redan är engagerade i en differentieringslinje än megakaryocytisk. - Enligt satsens instruktioner återanvänder du cellpelleten i nyberedd M-medium (PBS med 2% av den slutliga volymen av fetalt bovinserum (FBS), EDTA 1 mM) till en koncentration av 1 × 108 celler/ml och fördela suspensionen i runda botten 5 ml polystyrenrör till en maximal volym på 2 ml.
- Lägg till polystyrenrören: normalt råttserum vid en koncentration av 50 μL/ml samt den biotinylerade antikroppsblandningen (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) vid en koncentration av 50 μL blandning per ml och homogenisera genom att försiktigt snärta rören.
OBS: Dessa antikroppar kommer att binda till celler som redan är engagerade i en differentieringsväg utom den megakaryocytiska vägen. - Inkubera rören på is i 15 min.
- Tillsätt streptavidinbelagda magnetiska pärlor i en koncentration av 75 μL/ml och homogenisera genom att försiktigt snärta rören.
- Inkubera igen på is i 10 min.
- Justera vid behov till en slutlig volym på 2,5 ml per rör med M-medium.
- Homogenisera fjädringen genom att försiktigt snärta röret precis innan du placerar dem, utan sina kepsar, inuti en magnet och vänta i tre minuter.
OBS: Cellerna som redan är engagerade i en differentieringsväg och belagda med magnetiska pärlor kommer att behållas på rörets vägg inuti magneten. - Invertera magnet och rör för att överföra rörinnehållet till ett nytt rundbottnat 5 mL polystyrenrör.
OBS: Ta inte ut röret ur magneten för överföringen; det görs genom att invertera magneten med röret fortfarande i. Använd en stadig rörelse och skaka inte röret. - Kassera det ursprungliga röret som innehåller oönskade magnetiska märkta celler och placera det nya, utan lock, i magneten i ytterligare tre minuter.
- Fortsätt som i steg 2.20, överför de isolerade Lin− cellerna till ett nytt 15 ml rör.
OBS: Om flera 5 mL polystyrenrör har använts för föregående steg, slå samman alla celler i samma 15 ml-rör. Cellerna som återvinns efter cellsortering är hematopoetiska stamceller och stamceller. Förekomsten av trombopoietin (TPO), den stora fysiologiska regulatorn av megakaryopoiesis 10, kommer att rikta celldifferentiering mot den megakaryocytiska cellinjen. - Mät lincellsnumret och livskraften enligt steg 2.10.
- Beräkna den erforderliga volymen av cellfjädring för att centrifugera för att ha 1 x 106 livskraftiga celler x Brunnsnummer, Well Number är antalet brunnar till frö per tillstånd.
- Förbered ett rör per tillstånd med lämplig volym cellfjädring och centrifug vid 300 x g i 7 min.
- För flytande kulturer, kassera supernatanten och återanvända cellpelleten i fullständigt odlingsmedium (DMEM, PSG 1% av den slutliga volymen, FBS 10% av den slutliga volymen, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL) för att uppnå den slutliga koncentrationen av 2 × 106 livskraftiga celler/ml (lika med 1 × 106 celler per 50 μL brunn). Inkubera cellerna vid 37 °C under 5% CO2. (= kulturdag 0)
OBS: Se nästa stycke för metylcellulosakulturer Som exempel, för att förbereda hela odlingsmediet för en brunn, använd 435 μL DMEM, 50 μL 100% FBS för 10% slutlig, 5 μL 100% PSG för 1% slutlig, 5 μL av 10 000 U/mL för 100 U/mL final och 5 μL av 5 μl av 5 μg/mL final. 4-brunns- eller 24-brunnskulturplattor används vanligtvis eftersom deras brunnsdiameter passar bra för de 500 μL som behövs per brunn.
3. Cellinbäddning i metylcellulosahydrogel
OBS: Observera att följande protokoll beskriver metoden för att erhålla en enda brunn av hydrogelcellskultur, anpassa sig till antalet brunnar som behövs.
- Tina 1 ml alikvoter med 3% metylcellulosabuljonglösning vid rumstemperatur. Förbered en separat extra alikvot av metylcellulosa för sprutbeläggning.
OBS: Vid en koncentration av 3% förblir metylcellulosa flytande vid rumstemperatur (20-25 °C). - Täck en 1 mL Luer låsspruta utrustad med en 18-gauge nål med metylcellulosa genom att dra 1 ml metylcellulosa från den extra alikvoten. Helt utvisa metylcellulosa.
OBS: Detta beläggningssteg säkerställer att volymen metylcellulosa som samlas in i steg 3.3 är exakt. - Med samma spruta och nål men med hjälp av en ny metylcellulosa alikvot, rita lämplig volym metylcellulosa(figur 2A).
OBS: För att uppnå en slutlig koncentration på 2% metylcellulosa i en slutlig volym på 500 μL per brunn krävs 333 μL 3% metylcellulosa. - Ta försiktigt bort nålen. Med steriliserade tångar, skruva fast en luerlåskontakt på sprutans ände(figur 2B-C).
- Fäst en andra, icke-belagd, 1 mL Luer låsspruta på Luer-låskontakten för att ansluta de två sprutorna tillsammans(figur 2D).
OBS: Det finns inget behov av att belägga denna andra spruta. - Fördela också metylcellulosavolymen mellan de två sprutorna(figur 2E) och lägg dem åt sidan till steg 3.11.
- Förbered det koncentrerade DMEM-odlingsmediet för att i den slutliga metylcellulosavolymen (steg 3.11) erhålla en koncentration som är identisk med den i det flytande odlingsmediet för varje förening (PSG 1% av den slutliga volymen, FBS 10% av den slutliga volymen, hirudin 100 U/ml, TPO 50 ng/mL).
- Förbered 167 μL koncentrerat odlingsmedium per slutlig brunn på 1 × 106 celler. Denna volym av medium beräknas för att erhålla en slutlig metylcellulosakoncentration på 2%. Den totala volymen i brunnen kommer att vara 500 μL (167 μL cellfjädring i koncentrerat odlingsmedium + 333 μL metylcellulosa) och alla komponenter kommer att ha en koncentration som är identisk med den i flytande brunnar.
- Som ett exempel, för att förbereda hela odlingsmediet för en brunn, använd 102 μL DMEM, 50 μL 100% FBS för 10% slutlig, 5 μL 100% PSG för 1% slutlig, 5 μL av 10 000 U / mL för 100 U / mL final och 5 μL av 5 μg / mL TPO för 5 μg / mL TPO för 5 000 U / mL final. Det ger en volym på 167 μL som används för att återanvända cellerna och med tillsats av 333 μL metylcellulosa blir den slutliga volymen 500 μL.
- Efter avslutad centrifugering steg 2.26, kassera supernatanten och återanvända cellpelleten i det koncentrerade odlingsmediet i ett förhållande av 1 × 106 celler per 167 μL.
- Ta tillbaka sprutorna och koppla bort en av dem från kontakten.
- Pipett 167 μL av cellupphängningen.
- Tillsätt cellupphängningen direkt i sprutkontakten (figur 2F), se till att inte införa luftbubblor.
OBS: När du lägger till cellupphängningen drar du långsamt sprutan kolv samtidigt för att frigöra lite utrymme för cellupphängningen. - Anslut försiktigt de två sprutorna(figur 2G) utan att förlora någon suspension i skruvgängan.
OBS: Innan du återansluter, dra kolven för att lämna kontakten halvtom och låt tillräckligt med utrymme för den andra sprutan anslutas utan att suspensionen svämmar över. - Homogenisera långsamt metylcellulosamediet med cellfjädringen med tio fram och tillbaka kolvrörelser mellan de två sprutorna (figur 2H).
- Dra den totala volymen i en spruta och koppla bort de två sprutorna och lämna kontakten på den tomma.
- Töm sprutans innehåll i en brunn på en 4-brunnsplatta (figur 2I).
- Inkubera cellerna vid 37 °C under 5% CO2 (= dag 0 av kulturen).
OBS: Det är möjligt att förbereda två metylcellulosabrunnar med ett par sprutor. Öka volymen metylcellulosa med två och volymen av cell suspension för att ha 2 x106 celler. Efter avslutad steg 3.13. fördela volymen jämnt mellan de två sprutorna för att ha 500 μL i var och en av dem. Koppla bort dem och töm den utan kontakten i en kulturbrunn. Återanslut sprutorna för att överföra volymen från den som höll kontakten till den andra. Koppla bort sprutorna, den med 500 μL ska inte ha kontakten fäst och frö cellerna i en andra kulturbrunn. 3% metylcellulosa köps som en lagerlösning i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) medan koncentrerade celler suspenderas i DMEM. Jämförande tester har ursprungligen gjorts för att se till att detta blandade medium inte hade någon inverkan på resultatet av experimentet, särskilt jämfört med vätskekulturen i 100% DMEM.
4. Cell Resuspension för proplateletanalys
OBS: Analys av förmågan att bilda proplatelets måste utföras under jämförbara förhållanden mellan flytande och metylcellulosa odlade megakaryocyter. De fysiska begränsningar som utövas av metylcellulosahydrogel hämmar proplatelet förlängning. Därför återanvänds metylcellulosaodlade celler i färskt flytande medium på dag 3 av kulturen så att de kan förlänga proplatelets. Metylcellulosahydrogel är en fysisk hydrogel som lätt späds ut vid flytande medium tillsats. Viktigt, för att undvika artefakter från återupplivning och centrifugering, måste celler i kontroll flytande medium tillstånd behandlas samtidigt på samma sätt som metylcellulosa-odlade celler. Se experimentets schematiska representation (figur 1).
- Förbered 10 ml DMEM - 1% PSG förvärmd vid 37 °C i ett 15 ml-rör för varje brunn att återanvända.
- Försiktigt återanvända cellerna från varje brunn i 10 ml DMEM - 1% PSG.
OBS: Gör försiktigt flera upp- och nedrörelser för att späda ut metylcellulosa helt. För de flytande brunnarna se till att samla alla celler deponerade längst ner i brunnen. - Centrifugera rören 5 min vid 300 × g.
- Förbered under tiden komplett odlingsmedium (DMEM, PSG 1% av den slutliga volymen, FBS 10% av den slutliga volymen, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
OBS: Vid detta steg hämtas varje brunn för att spädas ut med hälften, förbered därför 1 ml komplett odlingsmedium per brunn. - Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 1 ml odlingsmedium för varje rör.
- Återförsluten 500 μL cellfjädring per brunn i en 4- eller 24-brunnsplatta och inkubera vid 37 °C under 5% CO2.
OBS: Från en första brunn, få 2 brunnar för proplatelet visualisering i duplikat. Observera att eftersom dessa dubbletter kommer från samma exempel kan de inte betraktas som oberoende replikat. - 24 timmar efter återförslutning, på dag 4 av kulturen, slumpmässigt förvärva 10 bilder per brunn med hjälp av ljus fältmikroskopi och 20× målet.
OBS: Cellerna tenderar att grupperas i mitten av brunnen, se till att inte ha för många celler på fältet eftersom det kan göra proplatelet visualisering och kvantifiering svårt. Se till att fånga minst 5 megakaryocyter per fält. - Räkna det totala antalet megakaryocyter och megakaryocyter som förlänger proplatelets i varje bild och beräkna andelen megakaryocyter som förlänger proplatelets.
OBS: Kvantifieringen är inte automatiserad; utföra cellräkning manuellt. Räkning kan underlättas genom användning av cellräknare plugin av ImageJ att klicka på cellerna för att markera dem som de räknas. 10 fält förvärvade per brunn och brunnar i duplikat representerar cirka 150-300 megakaryocyter per tillstånd.
5. Cellfixering och hämtning för framtida analyser
VARNING: Detta protokoll använder fixativ som måste hanteras under en rökhuv, med skyddsutrustning.
OBS: Syftet är att behålla de gelbegränsningar som tillämpas på cellerna intakta tills de är helt fixerade. Därför, och oavsett det fixativa som används, måste det tillsättas i brunnen ovanpå metylcellulosa, utan att störa gelén. Samma protokoll tillämpas på flytande kulturer.
- Tillsätt en mängd fixativ lösning som motsvarar den sådda volymen (500 μL i detta protokoll), ovanpå metylcellulosa utan att störa gelén. Vänta på lämplig tid enligt det fixativa som används (minst 10 min).
OBS: Den fixativa diffusionen i hela gelén bör vara mycket snabb, vilket framgår av en snabb förändring av gelfärgen (från rosa till en gul-orange nyans). Paraformaldehyd (8% i DPBS, 500 μL per brunn) används vanligtvis för immunmärkning, medan glutaraldhehyd (5% i cacodylatebuffert, 500 μL per brunn) används för elektronmikroskopianalys. - Använd en P1000 pipetter försiktigt gör flera upp-och-ner pipetter med fixativet och gelén för att homogent späda metylcellulosa.
- Använd samma pipett och spets och överför all volym från brunnen till ett 15 ml-rör som innehåller 10 ml DPBS och homogeniserar.
- Centrifugera blandningen vid 300 × g i 7 min.
OBS: Ett andra tvättsteg kan behövas för att eliminera all metylcellulosa - Kassera supernatanten och återanvänd megakaryocytpelletsen i lämpligt medium enligt önskad analys (immunolabeling, flödescytometri9, elektronmikroskopi ...) (för elektronmikroskopi se också pappersmetoden "In situ utforskning av de viktigaste stegen i megakaryopoiesis med hjälp av transmissionselektronmikroskopi" i detta JoVE-nummer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data som erhållits med hjälp av detta protokoll publicerades ursprungligen i Blood 20169.
Enligt protokollet såddes cellerna i antingen flytande eller metylcellulosa hydrogel medium. Celler i flytande medium har alla sedimenterat i botten av brunnen, i kontakt med den styva plastytan och någon gång med andra celler. Däremot fördelas celler inbäddade i metylcellulosahydrogel homogent i gelén och isoleras från närliggande celler (figur 3A). Metylcellulosagel vid en slutlig koncentration på 2% ökar den genomsnittliga megakaryocytdiametern något jämfört med vätskekulturen (figur 3B), i enlighet med den högre rapporterade ploidy9. Däremot försämrar den ökande metylcellulosakoncentrationen med 0,5 % megakaryocytdifferentiering, vilket framgår av en mindre medeldiameter (figur 3B).
En märkbar skillnad i megakaryocyt ultrastructure observeras mellan megakaryocyter differentierade i flytande kultur och de differentierade in vivo inom benmärgen. Ett karakteristiskt drag hos mogna megakaryocyter är ett komplext intracytoplasmiskt membrannätverk, DMS (Avgränsning membransystem) som fungerar som en reservoar för membranet i de framtida trombocyterna. I mogna megakaryocyter organiserar DMS för att bilda sammanflätade membranark som upptar det mesta av cytoplasman. Genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) verkar de vara nära apposed och avgränsa cytoplasmiska territorier(figur 3C övre panel) (för TEM-förfarandet, se pappersmetoden "In situ utforskning av de viktigaste stegen i megakaryopoiesis med hjälp av överföring elektronmikroskopi" i samma JOVE-nummer). I flytande kultur har DMS-membran mestadels utseendet av små runda, ovala eller långsträckta blåsor utan avgränsning av cytoplasmiska territorier (figur 3C mittpanel). Däremot främjar 2% metylcellulosakultur organisationen av DMS i en majoritet av megakaryocyter, med membran som är nära apposed och avgränsar cytoplasmiska territorier, som liknar den in situ (Figur 3C nedre panelen). Detta resultat indikerar att 2% metylcellulosa hydrogel odling möjliggör bättre megakaryocyt differentiering på grund av de mekaniska begränsningarna i miljömediet.
Efter cellöverföring till flytande medium på dag 3 börjar megakaryocyter förlänga proplatelets efter 4 h 9. Figur 4 visar kvantifieringen av andelen megakaryocyter som har förlängda proplatelets 24 h efter återupplivning i flytande miljö. Tio bilder förvärvades slumpmässigt per brunn, med hjälp av ljusfältmikroskopi och målet på 20 × (figur 4A). Kvantifieringen utfördes blint och manuellt med hjälp av cellräknarens plugin på Fiji (ImageJ) (figur 4B). Eftersom dessa är primära cellkulturer finns det en variabilitet mellan experiment, men protokollet förblir robust och erbjuder en bra reproducerbarhet. I det flytande förkulturella tillståndet bör proplateletandelen vara mellan 10% och 20% medan denna andel fördubblas för hydrogelförkulturen.
Bild 1. Schematisk representation av hela processen. Ben dissekeras ut, märg spolas ut och celler dissocieras mekaniskt. Stam- och stamceller av intresse (Linceller) isoleras av en immunomagnetisk negativ sorteringsprocedur och sås i antingen flytande eller hydrogelmedium (dag 0). På dag 3 av kulturen (som totalt representerar en varaktighet på 4 dagar) återanvänds båda villkoren i separat färsk flytande kulturmiljö. Detta andra odlingssteg utförs från dag 3 till dag 4 av kultur. Andelen MKs som utökar proplatelets mäts på dag 4 av kulturen. För visuell klarhet schemaiseras en cell per brunn. Den blå cirkeln visar en enda cell med sin kärna i lila. I det sista steget representeras båda MK:erna med proplatelet. Andelen MKs som bildar proplatelets varierar beroende på flytande eller metylcellulosa förkultur. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2. Cellinbäddning i metylcellulosahydrogel. Efter förbeläggning av sprutväggen,a) dra lämplig volym metylcellulosa; (B, C) koppla bort nålen och skruva fast en kontakt på sprutan; d)tryck metylcellulosa halvvägs genom kontakten och fäst en andra spruta. e)fördela metylcellulosa mellan de två sprutorna lika mycket och koppla bort dem. (F)tillsätt cellupphängningen till sprutan som bär kontakten; g)återansluta de två sprutorna; h)homogenisera genom att skjuta hela volymen från en spruta till en annan några gånger; i)så ut cellerna genom att utvisa hela volymen till en odlingsskål. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3. Megakaryocyte egenskaper enligt kultur villkor. ( A) Representativa bilder av megakaryocyter på dag 3 av odling i flytande (vänster panel) eller 2% metylcellulosa hydrogelmedium (höger panel). Skalstång = 50 μm (B) Medeldiameter för megakaryocyter som odlas i flytande medium, eller i 2% eller 2,5% metylcellulosahydrogel. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SD i 3 oberoende kulturer, med totalt minst 100 megakaryocyter undersökta. *, P<0,05, ***P < 0,0001, med hjälp av 1-vägsanalys av varians (ANOVA) med Bonferronis multijämförelsetest. (graf anpassad från Aguilar et al. 2016) C) Schematisk vy (vänster) och representativa elektroniska mikroskopibilder (mitten) av murin megakaryocyter. höger paneler, närbilder från de vita rutorna (skalstång = 5 μm för de mellersta elektroniska mikroskopibilderna och 2 μm för närbilder). Övre paneler är in situ megakaryocyter, mitten representerar megakaryocyter odlade in vitro i flytande kultur och lägre paneler är megakaryocyter odlade i 3D metylcellulosa hydrogel. Dessa data publicerades ursprungligen i Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4. Representativa resultat av proplateletkvantifiering. ( A) representativa bilder av megakaryocyter på kulturdag 4. Cellerna inkuberades tre dagar i vätska(vänster) eller 2% metylcellulosa hydrogel medium(höger) följt av en dag av resuspension i flytande medium. Svarta pilar indikerar megakaryocyter som förlänger proplatelets. (Skalstång = 50 μm). b)Representativa kvantifieringsdata för proplateletbildning. Proplatelet bildas kvantifieras på dag 4 för megakaryocyter tidigare förkulturerade från dag 0 till dag 3 i flytande eller 2% metylcellulosa hydrogel medium. Resultaten uttrycks som% av megakaryocyter som förlänger proplatelets (medelvärde ± SD) och är från 3 oberoende experiment, med ett totalt antal megakaryocyter undersökta per tillstånd >750 (t-test, p = 0,0023). Den genomsnittliga andelen megakaryocyter som förlänger proplatelets är 16% i flytande skick och 39% för metylcellulosahydrogelförkulturen. Detta resultat motsvarar den tidigare demonstrerade och publicerade effekten av hydrogelförkultur som ökar proplateletbildning jämfört med flytande tillstånd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under det senaste decenniet har mekanobiologi ökat allt mer intresse inom många biologiområden. Det är nu allmänt erkänt att den mekaniska miljön som omger cellerna spelar en roll i deras beteende, betonar vikten av att studera hur megakaryocyter känner och svarar på extracellulära mekaniska signaler. Det är utmanande att noggrant mäta stelheten hos benmärgsvävnaden in situ11, särskilt om vi betraktar den hematopoetiska röda märgen eftersom den ligger inuti trabekulära ben hos stora däggdjur medan den mer lättillgängliga märgen från diafysen huvudsakligen består av adipocyter (gul märg)12. När det gäller en isolerad märg från möss, där diafys innehåller i huvudsak röd märg, är en annan fråga att vävnaden inte förblir sammanhängande när den extraheras från benet. Shin och kollaboratörer lyckades dock mäta musdiaphysis märgstelhet med hjälp av atomkraftmikroskopi och fann ett värde av Emärg = 0,3 ± 0,1 kPa, vilket placerar märgen bland de mjukaste vävnaderna6.
Intresset för det förfarande som beskrivs här är att jämföra megakaryocytbeteende i flytande medium med det i hydrogelen. I flytande miljö har cellerna alla sedimenterat i botten av brunnen, i kontakt med den styva plastytan och någon gång med andra celler. Däremot fördelas celler inbäddade i metylcellulosahydrogel homogent i gelén och är helt isolerade från de andra cellerna (figur 3A). Därför underkastas de huvudsakligen mekaniska signaler från inneslutningen, med undantag av juxtakrinkommunikation. Parakrina stimulering kan inte helt uteslutas. Ändå är cellerna inbäddade i metylcellulosahydrogelen avlägsna från varandra i motsats till situationen i benmärgen och vi kan därför anta att om utsöndrade ämnen når närliggande celler kan de vara mycket utspädda.
Metoden är lätt att installera och kräver inga specifika färdigheter. Metylcellulosa är en fysisk gel vars polymerkedjor bildar icke-kovalenta korskopplingar. Att vara flytande vid låg temperatur, det jellifies när du ökar temperaturen (se artikeln från Aguilar et al. 20169 för mer information om karakteriseringen av geléns mekaniska egenskaper). Detta geltillstånd kan lätt vändas efter utspädning i vattenlösning, vilket möjliggör en enkel återhämtning av cellerna, oavsett om de är fixerade i gel eller som levande celler.
En kritisk faktor här är hydrogelens styvhet. Lämplig metylcellulosavolym bör mycket exakt doseras eftersom även en liten förändring av hydrogelkoncentrationen kan ha en viktig inverkan på miljöns styvhet och därmed på megakaryocytmognad. Till exempel visade det sig tidigare att öka metylcellulosakoncentrationen från 2 till 2,5% ökad gelstelhet (Youngs modulus) med 10 gånger. En möjlig fallgrop är att det inte finns någon enkel kvalitetskontroll för att verifiera exakta reologiska egenskaper hos metylcellulosa i varje försöksbrunn när den har såtts med celler. Ett viktigt kriterium som kommer att lugna en korrekt gelkoncentration är dock en korrekt mognad av megakaryocyterna i hydrogelen, vilket återspeglas av deras stora storlek ungefär som i flytande medium. En minskning av deras medeldiameter kan återspegla en defekt differentiering som liknar vad som uppstår när styvheten ökar med 2,5% metylcellulosa (figur 3B).
En annan begränsning av metoden är att cellåtervinning från hydrogelen tar mer tid än i den klassiska kulturen eftersom det är nödvändigt att först späda gelén före centrifugering. Om metylcellulosa helt måste avlägsnas, till exempel för att erhålla celllylyna för ytterligare western blot eller RNA-isoleringsförfarande, kan ett ytterligare tvättsteg krävas, under vilken tid modifieringar kan förekomma i proteiner eller RNA (proteindefosforylering, RNA-nedbrytning ...).
En kritisk punkt att tänka på i proceduren är antalet celler som måste vara lika under varje villkor. Detta är inte så trivialt eftersom celler i vätskekulturen tenderar att sedimentera i botten av brunnen och några av dem klibbar på plastytan, vilket inte är fallet för celler i suspension i hydrogel. En fallgrop är en ofullständig samling av cellerna i flytande tillstånd, vilket resulterar i en annan cellhalt mellan "flytande" och "hydrogel" tillstånd efter suspension i flytande medium på dag 3. En sådan skillnad kan leda till avvikelser i de slutliga uppgifterna. Som en kontrollpunkt kan en cellnumrering göras i det här skedet innan cellerna återförsluts. Det är att föredra att göra det manuellt med en Nageotte hemocytometer eftersom det är särskilt lämpligt för större celler som megakaryocyter.
När det gäller alla primära cellkulturer finns det en möjlig risk för kontaminering. Kontaminering är den mest sannolika förklaringen till en ovanligt låg proplatelet andel i metylcellulosa prekulturellt tillstånd, eftersom en liten förorening verkar svårare att upptäcka än i flytande medium. Därför kan det gå obemärkt fram till proplatelet kvantifiering, vilket leder till vilseledande resultat. God laboratoriepraxis måste följas strikt, särskilt under inkapsling av metylcellulosaceller som kräver många och exakta manipuleringar av sprutor och kontakter. Megakaryocytens livskraft bör också kontrolleras med Trypan blå med hjälp av en Nageotte cellkammare för manuell räkning innan den återförs på dag 3.
Sammantaget beskriver protokollet här en in vitro-modell för jämförelse mellan klassisk flytande kultur och en 3D-kultur med metylcellulosahydrogel. Observera att detta kulturprotokoll beskrivs för musens primära Lin- celler och har ännu inte anpassats till mänskliga celler. Denna 3D-modell är ett användbart verktyg för att undersöka den mekaniska miljöns inverkan på megakaryocytbeteende och mognad9. Det är också möjligt att lägga till föreningar i kulturen (även på gelén) för att studera drogernas påverkan på megakaryocytbeteende/ mognad och proplateletbildning. Slutligen, genom att reproducera de mekaniska begränsningar som celler kan stöta på i benmärgen, tillåter detta kultursystem undersökning av onormala fenotyper som inte kunde observeras i klassiska flytande kulturer som tidigare visats för Myh9 knockout megakaryocyter9,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Fabien Pertuy och Alicia Aguilar som ursprungligen utvecklade denna teknik i labbet, liksom Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg) som kännetecknade metykoelastiska egenskaper hos metylcellulosahydrogelen. Detta arbete stöddes av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) och av ett ARN-bidrag (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher är mottagare från Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-bidragsnummer FDT202012010422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K.
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R.
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
