عزل وثقافة الخلايا الظهارية البشرية الأولية باستخدام Y-27632
Summary
هنا نقدم طريقة معدلة لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجيفال الإنسان عن طريق إضافة مثبط الصخرة، Y-27632، إلى الطريقة التقليدية. هذه الطريقة أسهل وأقل استهلاكا للوقت ، وتعزز خصائص الخلايا الجذعية ، وتنتج أعدادا أكبر من الخلايا الظهارية عالية الإمكانات لكل من المختبر والتطبيقات السريرية.
Abstract
النسيج اللثة هو الهيكل الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ويلعب أدوارا ذات مغزى في العديد من الوظائف عن طريق الفم. الظهارة اللثة هي بنية مهمة من الأنسجة اللثة ، وخاصة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة. دراسة وظائف الخلايا الظهارية الغنجيفال له قيمة علمية حاسمة، مثل إصلاح العيوب الفموية والكشف عن توافق المواد الحيوية. كما الخلايا الظهارية الغنجية البشرية هي خلايا الكيراتينية متباينة للغاية، وعمرها قصير، وأنها من الصعب المرور. حتى الآن، هناك طريقتان فقط لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الغنجيفال، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية. ومع ذلك، فإن الوقت اللازم للحصول على الخلايا الظهارية باستخدام طريقة الزرع المباشر أطول، ومعدل بقاء الخلية من الطريقة الأنزيمية أقل. سريريا، الحصول على النسيج الغنجيفال محدودة، لذلك هناك حاجة إلى عزل مستقرة وفعالة وبسيطة في المختبر ونظام الثقافة. قمنا بتحسين الطريقة الأنزيمية التقليدية بإضافة Y-27632 ، وهو مثبط كيناز (ROCK) مرتبط ب Rho ، والذي يمكن أن يعزز بشكل انتقائي نمو الخلايا الظهارية. لدينا طريقة انزيمية معدلة يبسط خطوات الطريقة الأنزيمية التقليدية ويزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية، والتي لديها مزايا كبيرة على طريقة explant المباشرة وطريقة الأنزيمية.
Introduction
اللثة البشرية ، وهي بنية الدفاع الخط الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ، ليس فقط حاجزا ماديا وكيميائية1، ولكن أيضا يفرز فئات مختلفة من الوسطاء الالتهابيين الذين يشاركون في الاستجابات المناعية ويشكلون حاجزا مناعيا2،3. تلعب ظهارة اللثة دورا مهما في إصلاح وتجديد أنسجة اللثة. لذلك ، فإن دراسة الدفاع والمناعة من ظهارة اللثة ذات أهمية كبيرة لفهم حدوث التهاب اللثة وتشخيصه وعلاجه. عزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجية من الأنسجة الغنجية البشرية هي الخطوة الأولى المطلوبة لدراسة ظهارة الغنجيفال. يتطلب هذا الإجراء عمليات أساسية مثل إنتاج خلايا البذور لهندسة الأنسجة ، والنماذج المختبرية للأمراض المرتبطة باللثة ، ومواد لإصلاح عيوب اللثة.
تتميز الخلايا الظهارية الغنجية الأولية بانخفاض معدل الانقسام في المختبر4، وقد بحث الباحثون عن طريقة عزل وزراعة مثالية لعقود. حتى الآن، اثنين من تقنيات مختلفة، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية، وتستخدم عادة في المختبرات للحصول على خلايا الظهارة gingival الأولية في المختبر4،5. طريقة explant المباشر له مزايا مثل شرط وجود كمية أقل من عينات الأنسجة وإجراءات العزل البسيطة ، ولكن لديها مساوئ وقت أطول للثقافة والتعرض للتلوث5. على الرغم من أن الأسلوب الأنزيمي يقصر وقت الثقافة المطلوب ، إلا أن الكفاءة منخفضة نسبيا وتختلف اعتمادا على الإنزيمات والمتوسطة المستخدمة. وأظهر Kedjarune وآخرون6 أن طريقة الزرع المباشر، التي تتطلب المزيد من الوقت قبل الثقافة الفرعية (أسبوعين)، تبدو أكثر نجاحا لزراعة الخلايا الظهارية الغنجية مقارنة بصورة الأنزيمية. ومع ذلك، وبمقارنة هاتين الطريقتين، وجد كلينغبيل وآخرون 7 أن الطريقة الأنزيمية كان لها أفضل النتائج للثقافات الأولية للخلايا الظهارية الفموية، وكان من الممكنالحصول على الغلة المثالية للخلايا في أقصر فترة زمنية (11.9 يوما مقابل 14.2 يوما).
لذلك ، كان من المهم تطوير طريقة أكثر ملاءمة وفعالية لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الفموية4. كنا قد ذكرت سابقا أن إضافة Y-27632, مثبط كيناز البروتين المرتبطة رو (روك), يبسط إجراء العزل من خلايا البشرة الأولية الإنسان وخلايا القرنية منأنسجةالجلد الكبار 8,9,10. طورنا G-المتوسطة، وسيلة تلقيح مشروطة جديدة أن يفصل تلقائيا البشرة من الخلايا الجلدية ويدعم نمو وغلة الخلايا البشرةالأولية 8،9،10. في هذه الدراسة، طورنا تقنية جديدة للعزل والثقافة الخالية من المصل للخلايا الظهارية الغنجية من خلال الجمع بين G-medium وY-27632. في جوهرها ، ويستند أسلوبنا على تبسيط الطريقة الأنزيمية التقليدية من خطوتين ، لذلك قارنا طريقتنا الجديدة مع طريقة الزرع المباشر. هذه الطريقة الأنزيمية المعدلة تقصر بشكل كبير الوقت اللازم لفصل الخلايا الظهارية الغنجية عن الأنسجة الغنجيفالية وتزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية الغنجيفالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
النسيج gingival هو هيكل رئيسي يحافظ على سلامة اللثة والصحة. الخلايا الظهارية Gingival لها أدوار هامة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة ويمكن استخدامها في البحث العلمي والتطبيقات السريرية والمجالات ذات الصلة، بما في ذلك بيولوجيا الفم، وعلم الصيدلة، وعلم السموم، ونقص الغشاء المخاطي عن طريق الفم<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل البرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة شاندونغ (ZR2019ZD36) والبرنامج الرئيسي للبحث والتطوير في مقاطعة شاندونغ (2019GSF108107) إلى X.W. برنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة شاندونغ (2018GSF118240) إلى J.G. مشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2018WS163) إلى Z.X. ومشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2019WS045) إلى J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
