Isolement et culture de cellules épithéliales gingivales humaines primaires à l’aide de Y-27632
Summary
Nous présentons ici une méthode modifiée pour l’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales humaines en ajoutant l’inhibiteur de Rock, Y-27632, à la méthode traditionnelle. Cette méthode est plus facile, prend moins de temps, améliore les propriétés des cellules souches et produit un plus grand nombre de cellules épithéliales à fort potentiel à la fois pour le laboratoire et pour les applications cliniques.
Abstract
Le tissu gingival est la première structure qui protège les tissus parodontaux et joue un rôle significatif dans de nombreuses fonctions buccales. L’épithélium gingival est une structure importante du tissu gingival, en particulier dans la réparation et la régénération du tissu parodontal. L’étude des fonctions des cellules épithéliales gingivales a une valeur scientifique cruciale, comme la réparation des défauts buccaux et la détection de la compatibilité des biomatériaux. Comme les cellules épithéliales gingivales humaines sont des cellules kératinisées hautement différenciées, leur durée de vie est courte et elles sont difficiles à passer. Jusqu’à présent, il n’existe que deux façons d’isoler et de mettre en culture des cellules épithéliales gingivales, une méthode d’explantation directe et une méthode enzymatique. Cependant, le temps nécessaire pour obtenir des cellules épithéliales en utilisant la méthode d’explantation directe est plus long et le taux de survie cellulaire de la méthode enzymatique est plus faible. Cliniquement, l’acquisition de tissu gingival est limitée, de sorte qu’un système d’isolement et de culture in vitro stable, efficace et simple est nécessaire. Nous avons amélioré la méthode enzymatique traditionnelle en ajoutant Y-27632, un inhibiteur de la kinase rho-associée (ROCK), qui peut favoriser sélectivement la croissance des cellules épithéliales. Notre méthode enzymatique modifiée simplifie les étapes de la méthode enzymatique traditionnelle et augmente l’efficacité de la culture des cellules épithéliales, ce qui présente des avantages significatifs par rapport à la méthode d’explantation directe et à la méthode enzymatique.
Introduction
La gencive humaine, la structure de défense de première ligne qui protège le tissu parodontal, n’est pas seulement une barrière physique et chimique1,mais sécrète également différentes classes de médiateurs inflammatoires qui participent aux réponses immunitaires et constituent une barrière immunitaire2,3. L’épithélium gingival joue un rôle important dans la réparation et la régénération du tissu parodontal. Par conséquent, l’étude de la défense et de l’immunité de l’épithélium gingival est d’une grande importance pour comprendre l’apparition, le diagnostic et le traitement de la parodontite. L’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales à partir de tissu gingival humain est la première étape nécessaire à l’étude de l’épithélium gingival. Une telle procédure nécessite des opérations de base telles que la production de cellules de semence pour l’ingénierie tissulaire, des modèles in vitro de maladies associées parodontales et des matériaux pour réparer les défauts parodontaux.
Les cellules épithéliales gingivales primaires sont caractérisées par un faible taux de division in vitro4,les chercheurs recherchent depuis des décennies une méthode optimale d’isolement et de culture. À ce jour, deux techniques différentes, une méthode d’explantation directe et une méthode enzymatique, sont couramment utilisées en laboratoire pour obtenir des cellules primaires de l’épithélium gingival in vitro4,5. La méthode d’explantation directe présente des avantages tels que l’exigence d’une quantité plus faible d’échantillons de tissus et d’une procédure d’isolement simple, mais elle présente les inconvénients d’un temps de culture plus long et d’une susceptibilité à la contamination5. Bien que la méthode enzymatique raccourcisse le temps de culture requis, l’efficacité est relativement faible et varie en fonction des enzymes et du milieu utilisés. Kedjarune et al.6 ont montré que la méthode de l’explantation directe, qui nécessite plus de temps avant la sous-culture (2 semaines), semblait être plus efficace pour la culture des cellules épithéliales gingivales que la méthode enzymatique. Cependant, en comparant ces deux méthodes, Klingbeil et al.7 ont constaté que la méthode enzymatique avait les meilleurs résultats pour les cultures primaires de cellules épithéliales orales, et qu’il était possible d’obtenir le rendement cellulaire optimal dans les plus brefs délais (11,9 jours contre 14,2 jours).
Par conséquent, il était important de développer une méthode plus pratique et efficace pour l’isolement et la culture des cellules épithéliales orales4. Nous avons précédemment rapporté que l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK), simplifie la procédure d’isolement des cellules épidermiques primaires humaines et des kératinocytes des tissus cutanés adultes8,9,10. Nous avons développé le milieu G, un nouveau milieu d’inoculation conditionné qui sépare spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques et soutient la croissance et le rendement des cellules épidermiques primaires8,9,10. Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle technique d’isolement et de culture sans sérum pour les cellules épithéliales gingivales en combinant le milieu G avec Y-27632. En substance, notre méthode est basée sur une simplification de la méthode enzymatique traditionnelle en deux étapes, nous avons donc comparé notre nouvelle méthode avec la méthode d’explantation directe. Cette méthode enzymatique modifiée raccourcit considérablement le temps nécessaire pour séparer les cellules épithéliales gingivales du tissu gingival et augmente l’efficacité de la culture des cellules épithéliales gingivales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tissu gingival est une structure clé qui maintient l’intégrité parodontale et la santé. Les cellules épithéliales gingivales ont un rôle important dans la réparation et la régénération du tissu parodontal et peuvent être utilisées dans la recherche scientifique et les applications cliniques et dans des domaines connexes, y compris la biologie buccale, la pharmacologie, la toxicologie et les déficiences buccales de la muqueuse18. Par conséquent, il est nécessaire de développer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2019ZD36) et le programme clé de recherche et développement de la province du Shandong (2019GSF108107) à X.W.; le programme clé de recherche et développement de la province du Shandong (2018GSF118240) à J.G.; Projet de développement des sciences et technologies médicales et de la santé de la province du Shandong (2018WS163) à Z.X., et projet de développement des sciences et technologies médicales et de la santé de la province du Shandong (2019WS045) à J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
