Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü
Summary
Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.
Abstract
Diş eti dokusu periodontal dokuları koruyan ve birçok oral fonksiyonda anlamlı roller oynayan ilk yapıdır. Diş eti epitel, özellikle periodontal dokunun onarımı ve yenilenmesinde diş eti dokusunun önemli bir yapısıdır. Diş eti epitel hücrelerinin işlevlerini incelemek, oral kusurları onarmak ve biyomalzemelerin uyumluluğunu tespit etmek gibi çok önemli bilimsel değere sahiptir. İnsan dişeti epitel hücreleri son derece farklılaştırılmış keratinize hücreler olduğundan, ömürleri kısadır ve geçişleri zordur. Şimdiye kadar, diş eti epitel hücrelerini izole etmenin ve kültürlemenin sadece iki yolu vardır, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem. Bununla birlikte, doğrudan eksplant yöntemini kullanarak epitel hücreleri elde etmek için gereken süre daha uzundur ve enzymatic yöntemin hücre sağkalım oranı daha düşüktür. Klinik olarak, diş eti dokusunun kazanımı sınırlıdır, bu nedenle istikrarlı, verimli ve basit bir in vitro izolasyon ve kültür sistemine ihtiyaç vardır. Epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik edebilecek Rho ile ilişkili bir kinaz (ROCK) inhibitörü olan Y-27632’yi ekleyerek geleneksel enzimmatik yöntemi geliştirdik. Modifiye enzymatic yöntemimiz, geleneksel enzymatic yöntemin adımlarını basitleştirir ve doğrudan eksplant yöntemine ve enzymatic yönteme göre önemli avantajlara sahip olan epitel hücrelerinin kült verimliliğini arttırır.
Introduction
Periodontal dokuyu koruyan ilk hat savunma yapısı olan insan dişeti, sadece fiziksel ve kimyasal bir bariyer1değil, aynı zamanda bağışıklık yanıtlarına katılan ve bağışıklık bariyeri oluşturan farklı inflamatuar mediatör sınıflarını salgılar2,3. Diş eti epitel, periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, diş eti epitelinin savunmasını ve bağışıklığını incelemek periodontitin oluşumunu, tanısını ve tedavisini anlamak için büyük öneme sahiptir. Diş eti epitel hücrelerinin insan dişeti dokusundan izolasyonu ve kültürü, diş eti epitelinin incelenmesi için gerekli ilk adımdır. Böyle bir prosedür, doku mühendisliği için tohum hücreleri üretmek, periodontal ilişkili hastalıkların in vitro modelleri ve periodontal kusurları onarmak için malzemeler gibi temel operasyonları gerektirir.
Primer diş eti epitel hücreleri düşük bölünme oranı in vitro4ile karakterizedir Araştırmacılar on yıllardır optimal bir izolasyon ve yetiştirme yöntemi aramaktadır. Bugüne kadar laboratuvarlarda primer diş eti epitel hücrelerini in vitro4,5elde etmek için iki farklı teknik, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Doğrudan eksplant yöntemi, daha az miktarda doku örneğinin gerekliliği ve basit izolasyon prosedürü gibi avantajlara sahiptir, ancak daha uzun kültür süresi ve kontaminasyona yatkınlık dezavantajlarına sahiptir5. Enzimmatik yöntem gereken kültür süresini kısaltsa da, verimlilik nispeten düşüktür ve kullanılan enzimlere ve ortama bağlı olarak değişir. Kedjarune ve ark.6, alt kültürden önce (2 hafta) daha fazla zaman gerektiren doğrudan eksplant yönteminin, enzimatik yönteme kıyasla diş eti epitel hücrelerini kültlemede daha başarılı göründüğünü göstermiştir. Bununla birlikte, bu iki yöntemi karşılaştıran Klingbeil ve ark.7, enzmatik yöntemin oral epitel hücrelerinin birincil kültürleri için en iyi sonuçlara sahip olduğunu ve en kısa süre içinde (11.9 gün ile 14.2 gün) optimal hücre verimini elde etmenin mümkün olduğunu buldu.
Bu nedenle, oral epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için daha uygun ve etkili bir yöntem geliştirmek önemliydi4. Daha önce Rho ile ilişkili protein kinazının (ROCK) bir inhibitörü olan Y-27632’nin eklenmesinin, insan primer epidermal hücrelerinin ve keratinositlerin yetişkin cilt dokularından izolasyon prosedürünü basitleştirdiğini bildirdik8,9,10. Epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen ve epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen yeni bir şartlandırılmış aşılama ortamı olan G-medium’u geliştirdik8,9,10. Bu çalışmada G-medium ile Y-27632’yi birleştirerek diş eti epitel hücreleri için yeni bir serumsuz izolasyon ve kültür tekniği geliştirdik. Özünde, yöntemimiz geleneksel iki adımlı enzymatic yöntemin basitleştirilmesine dayanmaktadır, bu nedenle yeni yöntemimizi doğrudan explant yöntemiyle karşılaştırdık. Bu modifiye enzimatik yöntem, diş eti epitel hücrelerini diş eti dokusundan ayırmak için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltır ve diş eti epitel hücrelerinin kültleme verimliliğini arttırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diş eti dokusu periodontal bütünlüğü ve sağlığı koruyan anahtar bir yapıdır. Dişeti epitel hücreleri periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli rollere sahiptir ve oral biyoloji, farmakoloji, toksikoloji ve oral mukoza eksiklikleri de dahil olmak üzere bilimsel araştırma ve klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda kullanılabilir18. Bu nedenle, oral epitel hücrelerini hasat etmek için istikrarlı ve verimli bir yöntem geliştirmek gerekir19</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2019ZD36) Anahtar Programı ve Shandong Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2019GSF108107) tarafından X.W.’ye desteklenmiştir; Shandong Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2018GSF118240) J.G.’ye; Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2018WS163) Z.X.’ye ve Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2019WS045) J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
