בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632
Summary
כאן אנו מציגים שיטה מותאמת לבידוד ולתרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים על ידי הוספת מעכב הסלע, Y-27632, לשיטה המסורתית. שיטה זו קלה יותר, גוזלת פחות זמן, משפרת את תכונות תאי הגזע ומייצרת מספר גדול יותר של תאי אפיתל בעלי פוטנציאל גבוה הן עבור המעבדה והן עבור יישומים קליניים.
Abstract
רקמת החניכיים היא המבנה הראשון המגן על רקמות חניכיים וממלא תפקידים משמעותיים בתפקודים אוראליים רבים. אפיתל חניכיים הוא מבנה חשוב של רקמת חניכיים, במיוחד בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לחקר הפונקציות של תאי אפיתל חניכיים יש ערך מדעי מכריע, כגון תיקון פגמים אוראליים וזיהוי התאימות של ביו-חומרים. מכיוון שתאי אפיתל חניכים אנושיים הם תאים קרטין מובחנים מאוד, תוחלת החיים שלהם קצרה, וקשה לעבור. עד כה, יש רק שתי דרכים לבודד לתרבות תאי אפיתל חניכיים, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית. עם זאת, הזמן הנדרש כדי להשיג תאי אפיתל באמצעות שיטת explant ישיר הוא ארוך יותר, ואת שיעור ההישרדות התא של השיטה אנזימטית נמוך יותר. מבחינה קלינית, רכישת רקמת חניך מוגבלת, ולכן יש צורך בבידוד ומערכת תרבות יציבה, יעילה ופשוטה. שיפרנו את השיטה האנזימטית המסורתית על ידי הוספת Y-27632, מעכב קינאז הקשור לרו (ROCK), אשר יכול לקדם באופן סלקטיבי את הצמיחה של תאי אפיתל. השיטה האנזימטית המותאמת שלנו מפשטת את צעדי השיטה האנזימטית המסורתית ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל פולחניים פולחניים, שיש לה יתרונות משמעותיים על פני שיטת ההסבר הישיר והשיטה האנזימטית.
Introduction
הגינגיבה האנושית, מבנה ההגנה הקו הראשון המגן על רקמת חניכיים, הוא לא רקמחסוםפיזי וכימי 1 , אלא גם מפריש סוגים שונים של מתווכים דלקתיים המשתתפים בתגובות חיסוניות ומהוויםמחסוםחיסוני 2,3. האפיתל חניכיים ממלא תפקיד חשוב בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לכן, לימוד ההגנה והחסינות של האפיתל חניכיים הוא בעל משמעות רבה להבנת התרחשות, אבחון וטיפול של חניכיים. הבידוד והתרבות של תאי אפיתל חניך מרקמת חניך אנושית הוא הצעד הראשון הנדרש לחקר האפיתל חניך. הליך כזה דורש פעולות בסיסיות כגון ייצור תאי זרעים להנדסת רקמות, מודלים במבחנה של מחלות חניכיים, וחומרים לתיקון פגמים חניכיים.
תאי אפיתל חניכים ראשוניים מאופיינים בשיעור חלוקה נמוך במבחנה4 , חוקרים מחפשים שיטת בידוד וטיפוח אופטימלית במשךעשרותשנים. עד כה, שתי טכניקות שונות, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית, משמשים בדרך כלל במעבדות כדי להשיג תאי אפיתל חניכיים ראשוניים במבחנה4,5. לשיטת explant ישיר יש יתרונות כגון הדרישה של כמות נמוכה יותר של דגימות רקמה והליך בידוד פשוט, אבל יש לו את החסרונות של זמן תרבות ארוך יותר ורגישות לזיהום5. למרות שהשיטה האנזימטית מקצרת את זמן התרבות הנדרש, היעילות נמוכה יחסית ומשתנה בהתאם לאנזימים ובינוני המשמש. Kedjarune ואח‘ 6 הראה כי שיטת explant ישיר, אשר דורש יותר זמן לפני תת תרבות (2 שבועות), נראה מוצלח יותר עבור כת תאי אפיתל חניכיים לעומת השיטה אנזימטית. עם זאת, בהשוואה לשתי שיטות אלה, Klingbeil ואח‘7 מצא כי השיטה אנזימטית היו התוצאות הטובות ביותר עבור תרביות ראשוניות של תאי אפיתל אוראלי, וניתן היה להשיג את תפוקת התא האופטימלי בתוך פרק הזמן הקצר ביותר (11.9 ימים לעומת 14.2 ימים).
לכן, היה חשוב לפתח שיטה נוחה ויעילה יותר לבידוד ותרבות של תאי אפיתל אוראלי4. דיווחנו בעבר כי הוספת Y-27632, מעכב של קינאז חלבון הקשורים Rho (ROCK), מפשט את הליך הבידוד של תאי אפידרמיס ראשוניים אנושיים וקרטינוציטים מרקמות עור בוגרות8,9,10. פיתחנו G-medium, מדיום חיסון מותנה חדש המפריד באופן ספונטני אפידרמיס מתאי עור ותומך בצמיחה ובתשואה של תאי אפידרמיס ראשוניים8,9,10. במחקר הנוכחי, פיתחנו טכניקת בידוד ותרבות חדשה ללא סרום לתאי אפיתל חניך על ידי שילוב G-medium עם Y-27632. בעיקרו של דבר, השיטה שלנו מבוססת על פישוט של השיטה אנזימטית דו-שלבה המסורתית, ולכן השווינו את השיטה החדשה שלנו עם שיטת explant ישיר. שיטה אנזימטית שונה זו מקצרת באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להפריד תאי אפיתל חניכים מרקמת חניך ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל חניך פולחני.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמת החניכיים היא מבנה מפתח השומר על שלמות ובריאות חניכיים. לתאי אפיתל חניכיים יש תפקידים משמעותיים בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים וניתן להשתמש בהם במחקר מדעי וביישומים קליניים ובתחומים קשורים, כולל ביולוגיה אוראלית, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, וליקויים ברירית הפה18. לכן, יש ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית המרכזית של הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2019ZD36) ותוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2019GSF108107) ל- X.W.; תוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2018GSF118240) לג’יי ג’י; פרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2018WS163) ל- Z.X., ופרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2019WS045) ל- J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
