Y-27632を用いた初原ヒト歯肉上皮細胞の単離と培養
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine,Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology,Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology,Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery,Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School,Hangzhou Medical College
Summary
ここでは、従来の方法にロック阻害剤Y-27632を添加することにより、ヒト歯肉上皮細胞の単離および培養のための改変方法を提示する。この方法は、より簡単で、時間のかかるおらず、幹細胞の特性を高め、実験室と臨床用途の両方で、より多くの高電位上皮細胞を産生します。
Abstract
歯肉組織は歯周組織を保護し、多くの口腔機能において意味のある役割を果たす最初の構造である。歯肉上皮は歯肉組織の重要な構造であり、特に歯周組織の修復および再生において重要である。歯肉上皮細胞の機能を研究することは、口腔欠損の修復や生体物質の適合性の検出など、科学的価値が重要です。ヒト歯肉上皮細胞は高度に分化された角化細胞であるため、その寿命は短く、通過が困難です。これまでのところ、歯肉上皮細胞を単離して培養する方法は2つしかなく、直接外植法と酵素法です。しかし、直接外植法を用いて上皮細胞を得るのに要する時間は長く、酵素法の細胞生存率は低くなる。臨床的には、歯肉組織の獲得は限られているため、安定、効率的、簡便 なインビトロ 分離および培養システムが必要です。我々は、上皮細胞の増殖を選択的に促進することができるRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤であるY-27632を添加することで、従来の酵素的方法を改善した。当社の改変酵素法は、従来の酵素法のステップを簡素化し、上皮細胞の培養効率を高め、直接外植法および酵素法に対して大きな利点を有する。
Introduction
ヒト歯肉は、歯周組織を保護する第1線防御構造であり、物理的および化学的障壁1であるだけでなく、免疫応答に関与し、免疫バリア2,3を構成する炎症性メディエーターの異なるクラスを分泌する。歯肉上皮は歯周組織の修復および再生に重要な役割を果たす。したがって、歯肉上皮の防御と免疫を研究することは、歯膜炎の発生、診断、および治療を理解する上で非常に重要である。ヒト歯肉組織からの歯肉上皮細胞の単離および培養は、歯肉上皮の研究に必要な第一歩である。このような手順は、組織工学のための種子細胞の生産、歯周関連疾患のインビトロモデル、および歯周欠損を修復するための材料などの基本的な操作を必要とします。
初代歯肉上皮細胞は、vitro4における低い分裂率によって特徴付けられるが、研究者たちは何十年もの間、最適な単離および培養法を探してきた。現在までに、2つの異なる技術、直接外植法および酵素的方法は、一般的に、インビトロ4、5で一次歯肉上皮細胞を得るために実験室で使用されている。この直接外植法は、より低い量の組織標本および単純な単離手順の要件などの利点を有するが、汚染5に対する培養時間および感受性が長いという欠点を有する。酵素法は必要な培養時間を短縮するが、効率は比較的低く、使用する酵素や培地によって異なる。Kedjaruneら 6は、サブカルチャー(2週間)前により多くの時間を要する直接外植法が、酵素法と比較して歯肉上皮細胞の培養に成功したように見えることを示した。しかし、これら2つの方法を比較すると、Klingbeilら7は、酵素法が経口上皮細胞の一次培養に最良の結果を有し、最短時間(11.9日対14.2日)以内に最適な細胞収量を得ることが可能であることを発見した。
したがって、口腔上皮細胞4の単離および培養に対して、より便利で効果的な方法を開発することが重要であった。我々は、以前、Y-27632、Rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)の阻害剤を添加すると、成人の皮膚組織8、9、10からのヒト初表皮細胞およびケラチノサイトの単離手順を簡素化することを報告した。我々は、表皮を皮膚細胞から自然に分離し、初発表皮細胞8,9,10の増殖と収率を支える新しい調整接種培地であるG培地を開発した。本研究では、G培地とY-27632を組み合わせることにより、歯肉上皮細胞の新しい無血清分離および培養技術を開発した。本質的に、我々の方法は従来の2段階の酵素法の単純化に基づいているので、我々は新しい方法を直接外植法と比較した。この修飾酵素法は、歯肉の上皮細胞を歯肉組織から分離するのに必要な時間を大幅に短縮し、歯肉上皮細胞の培養の効率を高める。
Protocol
このプロトコルで使用されるヒト組織は、本学の人間研究倫理委員会のガイドラインに従って、顎顔面外科の影響を受けた歯の抽出から廃棄された新鮮な成人の歯肉組織である(プロトコルNo.GR201711、日付:02-27-2017)。 1. 準備 10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mLチューブに新鮮な成人歯肉組織を採取し、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を3%補?…
Representative Results
図1 は、直接外植法及び改変酵素法の概略図を示す。直接の外植法は、全体のプロセス中に任意の消化酵素を必要としません。対照的に、伝統的な酵素法は通常、消化酵素の2組、ディスパスおよびコラゲアーゼを必要とし、下層の線維芽細胞層から上皮シートを分離し、次にトリプシンを使用して上皮細胞を懸濁液に放出する。我々の新しい方法は分離のステップを省?…
Discussion
歯肉組織は歯周の完全性と健康を維持する重要な構造です。歯肉上皮細胞は歯周組織の修復および再生に重要な役割を有し、経口生物学、薬理学、毒物学、および口腔粘膜欠乏症を含む科学的研究および臨床応用および関連分野で使用することができる18。したがって、経口上皮細胞19を収穫するために安定かつ効率的な方法を開発する必要がある。初代上…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、山東省自然科学財団(ZR2019ZD36)の主要プログラムと山東省の主要研究開発プログラム(2019GSF108107)からX.W.に支援されました。山東省の主要研究開発プログラム(2018GSF118240)からJ.G.へ山東省医療・健康科学技術開発プロジェクト(2018WS163)からZ.Xへ、山東省医療・健康科学技術開発プロジェクト(2019WS045)からJ.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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Cite This Article
Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q., Liu, C., Wen, J., Zhang, Q., Liu, P., Liu, G., Guo, J., Wu, X. Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632. J. Vis. Exp. (177), e62978, doi:10.3791/62978 (2021).