Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632
Summary
Aquí presentamos un método modificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas mediante la adición del inhibidor de Rock, Y-27632, al método tradicional. Este método es más fácil, consume menos tiempo, mejora las propiedades de las células madre y produce un mayor número de células epiteliales de alto potencial tanto para el laboratorio como para aplicaciones clínicas.
Abstract
El tejido gingival es la primera estructura que protege los tejidos periodontales y desempeña un papel significativo en muchas funciones orales. El epitelio gingival es una estructura importante del tejido gingival, especialmente en la reparación y regeneración del tejido periodontal. El estudio de las funciones de las células epiteliales gingivales tiene un valor científico crucial, como la reparación de defectos orales y la detección de la compatibilidad de los biomateriales. Como las células epiteliales gingivales humanas son células queratinizadas altamente diferenciadas, su vida útil es corta y son difíciles de pasar. Hasta ahora, solo hay dos formas de aislar y cultivar células epiteliales gingivales, un método de explante directo y un método enzimático. Sin embargo, el tiempo requerido para obtener células epiteliales utilizando el método de explante directo es más largo, y la tasa de supervivencia celular del método enzimático es menor. Clínicamente, la adquisición de tejido gingival es limitada, por lo que se necesita un sistema de aislamiento y cultivo in vitro estable, eficiente y simple. Mejoramos el método enzimático tradicional agregando Y-27632, un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK), que puede promover selectivamente el crecimiento de las células epiteliales. Nuestro método enzimático modificado simplifica los pasos del método enzimático tradicional y aumenta la eficiencia del cultivo de células epiteliales, lo que tiene ventajas significativas sobre el método de explante directo y el método enzimático.
Introduction
La encía humana, la estructura de defensa de primera línea que protege el tejido periodontal, no solo es una barrera física y química1,sino que también segrega diferentes clases de mediadores inflamatorios que participan en las respuestas inmunes y constituyen una barrera inmune2,3. El epitelio gingival juega un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal. Por lo tanto, estudiar la defensa y la inmunidad del epitelio gingival es de gran importancia para comprender la aparición, el diagnóstico y el tratamiento de la periodontitis. El aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales a partir de tejido gingival humano es el primer paso requerido para estudiar el epitelio gingival. Tal procedimiento requiere operaciones básicas como la producción de células de semillas para la ingeniería de tejidos, modelos in vitro de enfermedades periodontales asociadas y materiales para reparar defectos periodontales.
Las células epiteliales gingivales primarias se caracterizan por una baja tasa de división in vitro4,los investigadores han estado buscando un método óptimo de aislamiento y cultivo durante décadas. Hasta la fecha, dos técnicas diferentes, un método de explante directo y un método enzimático, se utilizan comúnmente en los laboratorios para obtener células primarias del epitelio gingival in vitro4,5. El método de explante directo tiene ventajas como el requisito de una menor cantidad de muestras de tejido y un procedimiento de aislamiento simple, pero tiene las desventajas de un mayor tiempo de cultivo y susceptibilidad a lacontaminación 5. Aunque el método enzimático acorta el tiempo de cultivo requerido, la eficiencia es relativamente baja y varía dependiendo de las enzimas y el medio utilizado. Kedjarune et al.6 mostraron que el método de explante directo, que requiere más tiempo antes del subcultivo (2 semanas), pareció ser más exitoso para el cultivo de células epiteliales gingivales en comparación con el método enzimático. Sin embargo, comparando estos dos métodos, Klingbeil et al.7 encontraron que el método enzimático tuvo los mejores resultados para los cultivos primarios de células epiteliales orales, y fue posible obtener el rendimiento celular óptimo en el período de tiempo más corto (11,9 días frente a 14,2 días).
Por lo tanto, era importante desarrollar un método más conveniente y efectivo para el aislamiento y cultivo de células epiteliales orales4. Anteriormente informamos que la adición de Y-27632, un inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK), simplifica el procedimiento de aislamiento de células epidérmicas primarias humanas y queratinocitos de tejidos de piel adultos8,9,10. Desarrollamos G-medium, un nuevo medio de inoculación condicionado que separa espontáneamente las células epidérmicas de las dérmicas y apoya el crecimiento y el rendimiento de las células epidérmicas primarias8,9,10. En el presente estudio, desarrollamos una nueva técnica de aislamiento y cultivo sin suero para células epiteliales gingivales mediante la combinación de G-medium con Y-27632. En esencia, nuestro método se basa en una simplificación del método enzimático tradicional de dos pasos, por lo que comparamos nuestro nuevo método con el método de explante directo. Este método enzimático modificado acorta significativamente el tiempo necesario para separar las células epiteliales gingivales del tejido gingival y aumenta la eficiencia del cultivo de las células epiteliales gingivales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El tejido gingival es una estructura clave que mantiene la integridad periodontal y la salud. Las células epiteliales gingivales tienen un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal y se pueden utilizar en la investigación científica y las aplicaciones clínicas y campos relacionados, incluida la biología oral, la farmacología, la toxicología y las deficiencias de la mucosa oral18. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método estable y eficiente para cosec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2019ZD36) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2019GSF108107) a X.W.; el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2018WS163) a Z.X., y el Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2019WS045) a J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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