Summary
Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor retinale ader occlusie met behulp van rose bengal en een lasergeleid retinaal beeldvormingscoopsysteem met aanbevelingen om de reproduceerbaarheid ervan in genetisch gemodificeerde stammen te maximaliseren.
Abstract
Muismodellen van retinale ader occlusie (RVO) worden vaak gebruikt in de oogheelkunde om hypoxisch-ischemisch letsel in het neurale netvlies te bestuderen. In dit rapport wordt een gedetailleerde methode gegeven die wijst op kritieke stappen met aanbevelingen voor optimalisatie om consistent succesvolle occlusiepercentages te bereiken bij verschillende genetisch gemodificeerde muizenstammen. Het RVO-muismodel bestaat voornamelijk uit de intraveneuze toediening van een fotosensitizerkleurstof gevolgd door laserfotocoagulatie met behulp van een retinale beeldvormingsmicroscoop die is bevestigd aan een oogheelkundige geleide laser. Drie variabelen werden geïdentificeerd als determinanten van occlusieconsistentie. Door de wachttijd na toediening van rose bengalen aan te passen en de baseline en experimentele laseroutput in evenwicht te brengen, kan de variabiliteit tussen experimenten worden beperkt en een hoger slagingspercentage van occlusies worden bereikt. Deze methode kan worden gebruikt om retinale ziekten te bestuderen die worden gekenmerkt door retinaal oedeem en hypoxisch-ischemisch letsel. Bovendien, omdat dit model vasculair letsel induceert, kan het ook worden toegepast om de neurovasculatuur, neuronale dood en ontsteking te bestuderen.
Introduction
Retinale ader occlusie (RVO) is een veel voorkomende retinale vaatziekte die in 2015 wereldwijd ongeveer 28 miljoen mensen trof1. RVO leidt tot achteruitgang en verlies van het gezichtsvermogen bij werkende volwassenen en ouderen, wat neerkomt op een voortdurende gezichtsbedreigende ziekte die naar schatting in de loop van het nabije decennium zal toenemen. Enkele van de verschillende pathologieën van RVO omvatten hypoxisch-ischemisch letsel, retinaal oedeem, ontsteking en neuronaal verlies2. Momenteel is de eerste behandelingslijn voor deze aandoening door de toediening van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) -remmers. Hoewel anti-VEGF-behandeling heeft geholpen bij het verbeteren van retinaal oedeem, worden veel patiënten nog steeds geconfronteerd met een achteruitgang van het gezichtsvermogen3. Om de pathofysiologie van deze ziekte verder te begrijpen en om potentiële nieuwe behandelingslijnen te testen, is het nodig om een functioneel en gedetailleerd RVO-muismodelprotocol voor verschillende muizenstammen samen te stellen.
Er zijn muismodellen ontwikkeld die hetzelfde laserapparaat implementeren dat wordt gebruikt bij menselijke patiënten, in combinatie met een beeldvormingssysteem dat is geschaald naar de juiste grootte voor een muis. Dit muismodel van RVO werd voor het eerst gerapporteerd in 20074 en verder vastgesteld door Ebneter en anderen 4,5. Uiteindelijk werd het model geoptimaliseerd door Fuma et al. om belangrijke klinische manifestaties van RVO te repliceren, zoals retinaal oedeem6. Sinds het model voor het eerst werd gerapporteerd, hebben veel studies het gebruikt met behulp van de toediening van een fotosensitizerkleurstof gevolgd door fotocoagulatie van belangrijke retinale aderen met een laser. De hoeveelheid en het type kleurstof die wordt toegediend, het laservermogen en de tijd van blootstelling variëren echter aanzienlijk tussen studies die deze methode hebben gebruikt. Deze verschillen kunnen vaak leiden tot een verhoogde variabiliteit in het model, waardoor het moeilijk te repliceren is. Tot op heden zijn er geen gepubliceerde studies met specifieke details over mogelijke wegen voor de optimalisatie ervan.
Dit rapport presenteert een gedetailleerde methodologie van het RVO-muismodel in de C57BL/6J-stam en een tamoxifen-induceerbare endotheel caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stam met een C57BL/6J achtergrond en van belang voor RVO pathologie als referentiestam voor een genetisch gemodificeerde muis. Een eerdere studie had aangetoond dat niet-apoptotische activering van endotheel caspase-9 retinaal oedeem aanwakkert en neuronale dood bevordert8. Ervaring met het gebruik van deze stam heeft geholpen bij het bepalen en inzichtelijk maken van mogelijke aanpassingen om het RVO-muismodel, dat toepasbaar kan zijn op andere genetisch gemodificeerde stammen, aan te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Knaagdierexperimenten werden goedgekeurd en gecontroleerd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Columbia University.
OPMERKING: Alle experimenten gebruikten twee maanden oude mannelijke muizen die ongeveer 20 g wogen.
1. Bereiding en toediening van tamoxifen voor induceerbare genetische ablatie van gevlokte genen
OPMERKING: De diameter van het netvliesvat kan worden beïnvloed door het gewicht van het dier. Zorg ervoor dat alle dieren die voor een experiment worden gebruikt, een vergelijkbaar gewicht hebben.
- Verdun tamoxifen in maïsolie tot een concentratie van 20 mg / ml.
OPMERKING: Tamoxifen is een giftig middel en is lichtgevoelig. Bescherm tegen licht, bijvoorbeeld met aluminiumfolie. - Vortex de oplossing voor een paar seconden.
- Laat 15 min in de oven op 55 °C staan.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de tamoxifen volledig is opgelost. Extra vortexing kan nodig zijn. - Bewaar de oplossing bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
- Gebruik een spuit van 1 ml met een naald van 26 G voor tamoxifeninjectie. Reinig het injectiegebied met 70% ethanol. Dien 2 mg tamoxifen (100 μL van 20 mg/ml) intraperitoneaal (IP) eenmaal daags toe gedurende de vastgestelde tijd volgens de specifieke induceerbare Cre-lijn.
- Zorg voor twee dagen rust voor de dieren voordat u met de experimenten begint.
2. Bereiding van reagentia voor laserfotocoagulatie
- Roos bengalen
LET OP: Rose bengal is lichtgevoelig. Bewaren in het donker tot gebruik en bereid vers voor op het beste resultaat.- Bereid rozenbeen door het te verdunnen tot 5 mg / ml in steriele zoutoplossing en filter het door een spuitfilter van 0,2 μm.
- Bereid een spuit van 1 ml met een naald van 26 G met roos.
- Ketamine/xylazine
- Verdun ketamine en xylazine in steriele zoutoplossing dienovereenkomstig voor de volgende concentraties: ketamine (80-100 mg / kg) en xylazine (5-10 mg / kg).
- Carprofen
- Verdun carprofen tot 1 mg/ml in steriele zoutoplossing.
- Bereid een spuit van 1 ml met een naald van 26 G met carprofen.
- Steriele zoutoplossing
- Bereid een spuit van 5 ml met een naald van 26 g met steriele zoutoplossing.
3. Laser instellen
- Behandel de glasvezelkabel voorzichtig en sluit deze aan op de laserbesturingskast en de laseradapter van de retinale beeldvormingsmicroscoop.
- Schakel de retinale microscooplamp aan.
- Schakel de computer in en open het beeldbewerkingsprogramma.
- Pas de witbalans aan door een stuk wit papier te gebruiken en dit voor het oogstuk van de muis te leggen en op Aanpassen te klikken in het beeldvormingsprogramma.
- Schakel de laserbesturingskast in door aan de sleutel te draaien en de instructies op het scherm van de laserbesturingskast te volgen.
OPMERKING: De laser die in dit experiment wordt gebruikt, is klasse 3B en kan oogbeschadiging veroorzaken. Draag een beschermende bril bij het bedienen van de laser. - Controleer het basislaservermogen.
- Gebruik een laservermogensmeter.
- Stel het scherm van de laserbesturingskast in op de volgende parameters: 50 mW en 2.000 ms.
- Schakel de laser in en plaats de vermogensmeter voor het oculair.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het microscooplicht is uitgeschakeld tijdens het testen van het basislaservermogen. - Druk op het voetschakelaarpedaal om de laser te activeren.
- Streef ernaar dat de uitlezing van het laservermogen 13-15 mW is.
OPMERKING: De uitlezing van het laservermogen bepaalt het slagingspercentage voor occlusies van retinale aderen. Als de uitlezing van het laservermogen te laag is, kunnen het vermogen en de tijd van de laserbelichting worden aangepast. Zie tabel 1 voor aanbevelingen.
- Pas het experimentele laservermogen aan door het scherm van de laserbesturingskast in te stellen voor de volgende parameters: 100 mW, 1.000 ms.
- Schakel de laser uit.
OPMERKING: Voor de veiligheid en om oververhitting te voorkomen, is het het beste om de laser tussen muizen uit te houden.
4. Muis staart ader injectie van rose bengal
- Giet 300 ml water in een bekerglas van 500 ml.
- Verwarm het bekerglas 1 min in een magnetron.
- Doe gaas in het warme water in het bekerglas.
- Plaats de muis in een fixator.
- Druk het gaasje zachtjes in de muizenstaart en zoek naar de verwijde aderen. Desinfecteer de injectieplaats met een alcoholdoekje na de verwijding van het warme water.
- Steek de naald in de injectieplaats en trek aan de spuit om er zeker van te zijn dat u zich in de ader bevindt. Injecteer vervolgens de staartader van de muis en dien de juiste hoeveelheid toe op basis van het gewicht van het dier (37,5 mg / kg). Oefen druk uit op de injectieplaats om hematoom of bloedingen te voorkomen. Wis de site.
- Laat de muis los van de fixator en breng hem terug naar de kooi.
- Laat de roos 8 minuten circuleren voordat de anesthetica worden geïnjecteerd.
OPMERKING: Dit levert in totaal 10 minuten op tussen de injectie van de roos en de laserbestraling.
5. Occlusie van belangrijke aderen
- Schakel het verwarmde muisplatform in.
- Voeg een druppel fenylefrine en tropicamide toe in elk oog.
- Injecteer 150 μL van de anesthetica, ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) IP.
OPMERKING: Tijdens deze procedure kreeg de muis twee IP-injecties. Vandaar dat de zijkanten werden afgewisseld. De IP-injectie voor de anesthesie werd toegediend in het kwadrant van de rechteronderbuik en de zoutoplossing werd geïnjecteerd in het kwadrant van de linker onderbuik. Het wordt aanbevolen om vóór het injecteren aan de spuit te trekken om ervoor te zorgen dat de naald zich in de buik bevindt en niet in organen. - Knijp het dier teen om de diepte van de anesthesie te bepalen en wacht tot het niet reageert.
- Voeg één druppel proparacaïnehydrochloride per oog toe (pijnstillend).
- Voeg gelzalf toe aan beide ogen.
- Injecteer 150 μL carprofen subcutaan tussen de oren.
- Plaats de muis op het platform.
- Pas het platform aan totdat het zicht op de retinale fundus duidelijk en gefocust is.
- Tel de retinale aderen en maak een foto van de fundus.
OPMERKING: Retinale aderen zijn donkerder en breder dan slagaders. Aderen en slagaders wisselen elkaar af; soms kan er echter een vertakte slagader dicht bij de oogzenuw zijn en daarom twee aangrenzende slagaders. - Schakel de laser in en richt op een retinale ader op ongeveer 375 μm van de optische schijf.
- Bestraal het vat door op de voetschakelaar te drukken en de laserstraal lichtjes te bewegen tot 100 μm. Herhaal deze stap drie keer en beweeg de laserstraal na elke puls zodat de bestraling niet op één plek wordt gericht.
- Herhaal bestraling op andere grote vaten om 2-3 occlusies te bereiken.
6. Vaststellen van het aantal aderen afgesloten op dag 0
- Zet de lamp uit na het bestralen van de vaten en wacht 10 minuten.
OPMERKING: Blootstelling aan licht kan schade aan het netvlies en ontsteking veroorzaken; schakel de lamp uit tijdens de wachttijd om de belichting te minimaliseren7. - Zet de lamp weer aan en tel het aantal afgesloten aderen.
- Maak een foto van de fundus.
7. Nazorg
- Injecteer 1 ml steriel zoutoplossing IP.
OPMERKING: Zie de details van de IP-injectie in rubriek 5, stap 3. - Voeg glijmiddel oogdruppels toe aan beide ogen.
- Voeg gelzalf toe aan beide ogen.
- Kijk naar de muis terwijl deze herstelt van de anesthesie en breng hem niet terug naar de kooi met de andere dieren totdat hij volledig is hersteld. Carprofen (5 mg/kg) kan dagelijks worden toegediend tot 2 dagen na de procedure. Indien toegepast op mensen, is pijn geen symptoom van RVO.
OPMERKING: Laat de dieren niet onbeheerd achter totdat ze volledig zijn hersteld van de anesthesie.
8. Beoordeling van retinaal oedeem door optische coherentietomografie (OCT)
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd op het tijdstip van interesse van de onderzoeker. De piek van retinaal oedeem voor een C57BL/6J muis is 1 dag na de RVO procedure. Dit tijdstip kan variëren, afhankelijk van de achtergrond van de muis.
- Schakel de retinale microscooplichtdoos, de OCT-machine en het verwarmde muisplatform in.
- Volg de dag na de occlusie stap 5.2 tot en met 5.7 om het dier voor te bereiden.
- Open de softwareprogramma's imaging en OCT.
- Stel in het OCT-programma de nudge in op 5.
- Neem OCT op 75 μm distal van de brandwond of 4 klikken.
- Maak OCT-beelden bij vier kwadranten van het netvlies.
- Analyseer de OCT-afbeeldingen met behulp van traceersoftware.
- Vergelijk de retinale dikte van voorbestraalde metingen met 1 dag na RVO of op het tijdstip van interesse.
OPMERKING: Houd bij het analyseren van de gegevens rekening met het aantal bestraalde aderen, omdat dit de ontwikkeling van retinaal oedeem kan beïnvloeden. Dieren worden vervolgens geëuthanaseerd door het toedienen van verdoving gevolgd door perfusie niet-overlevingsoperaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het RVO-muismodel heeft tot doel met succes occlusies in de retinale aderen te bereiken, wat leidt tot hypoxisch-ischemisch letsel, afbraak van de retinale bloedbarrière, neuronale dood en retinaal oedeem8. Figuur 1 toont een tijdlijn van stappen om reproduceerbaarheid te garanderen, een schema van het experimentele ontwerp en schetst stappen die verder kunnen worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de experimentele vragen. De drie belangrijkste stappen die kunnen worden gewijzigd, zijn de wachttijd na toediening van rose bengal, het basislaservermogen en de experimentele laseruitvoer. In dit rapport werden C57BL/6J-muizen, evenals WT- en KO-nestgenoten van een induceerbare endotheelcel caspase-9 knock-out muislijn (iEC Casp9), gebruikt om de optimale instellingen voor verschillende stammen te bepalen.
De wachttijd van rose bengal injectie tot laserbestraling kan het succes van fotocoagulatie in de aderen veranderen. Een te korte wachttijd kan resulteren in een lage concentratie van rozenbengaals in de aderen, terwijl een te lange wachttijd ertoe kan leiden dat rose bengal uit de retinale circulatie wordt verwijderd. Beide situaties kunnen leiden tot slechte fotocoagulatie en mislukte occlusies. Bij het testen van het aantal occlusies dat onmiddellijk na laserbestraling werd verkregen, bleek uit vergelijking van dieren die 10 en 20 minuten na toediening van rose bengal werden gelaserd dat er geen verschillen waren in het aantal bereikte occlusies (figuur 2B). Het aantal occlusies dat tot 1 dag na RVO aanhield, nam echter significant af bij dieren die 20 minuten na toediening van rose bengalen werden gelaserd, onafhankelijk van het genotype. Dit resultaat suggereert dat bij het bestuderen van acuut RVO-geïnduceerd letsel, de wachttijd na toediening van roos Bengalen de occlusiestabiliteit kan beïnvloeden. Vroege reperfusie van aderen (vóór 24 uur na letsel) kan de ontwikkeling van retinaal oedeem beïnvloeden en moet daarom worden gecontroleerd door de juiste wachttijd te bepalen van toediening van rozenbengaal tot laserbestraling.
In principe wordt succesvolle fotocoagulatie die leidt tot occlusie aangedreven door laservermogen. Hoewel dit zo'n belangrijk onderdeel van het proces is, is het ook een van de grootste bronnen van variabiliteit in het model en moet het worden geoptimaliseerd voor consistentie. Om dit te bereiken, wordt aanbevolen om de laseruitvoer tijdens de installatie te meten voordat de muizen worden geïnjecteerd met rose bengal. De aanbevolen output voor het basislaservermogen ligt tussen 13,0 en 15,0 mW. Een laag basislaservermogen, zoals 11,5 mW, zonder het experimentele vermogen (100 mW) te wijzigen, resulteerde in geen occlusies, zoals weergegeven in figuur 3. Daarentegen resulteerde een basislaservermogen van 13,5 mW met een experimenteel vermogen van 100 mW in succesvolle occlusies. In gevallen waar de laseroutput lager was dan 13,0 mW, werd het experimentele vermogen verhoogd tot 110 mW om dezelfde succesvolle occlusies te bereiken als bij een hogere baseline laseroutput. Doorgaans is 100 mW het standaard experimentele vermogen; Als de laseruitgang echter lager is dan 13,0 mW, kan dit worden gecompenseerd door het experimentele vermogen aan te passen met de aanbevolen bereiken in tabel 1.
Er zijn vier hoofdtypen occlusies waargenomen die optreden na laserfotocoagulatie van de aderen. Deze soorten occlusies zijn samengevat in figuur 4A en zijn geclassificeerd op basis van de hoeveelheid bloedstroom; volledig afgesloten bloedvaten (geen bloedstroom), gedeeltelijk afgesloten bloedvaten (meestal geblokkeerd met incidentele stroom), gedeeltelijk gereperfuseerd (ononderbroken gestage bloedstroom met belemmering) en volledig gereperfuseerde bloedvaten (geen enkele duidelijke obstructie). Om te onderzoeken of de soorten occlusies veranderen volgens het genotype en de tijd te bepalen die per occlusietoestand wordt doorgebracht, werden video's van 10 minuten na laserbestraling geëvalueerd. Deze beoordeling hielp bepalen dat de bestraalde vasculatuur van iEC Casp9-muizen meer tijd doorbrengen in gedeeltelijk gereperfuseerde en gedeeltelijk afgesloten toestanden dan C57BL6 / J, die meer tijd doorbrengen in volledig afgesloten toestanden (figuur 4B).
Figuur 5 laat zien hoe de occlusietoestand van de vaten snel verandert binnen de eerste 10 minuten na laserfotocoagulatie. Zodra deze eerste 10 minuten zijn verstreken, stabiliseren de occlusies en worden ze gehandhaafd tot een tijdspunt van 24 uur. Om het nauwkeurige initiële aantal occlusies per oog te beoordelen, wordt het dus aanbevolen om 10 minuten na bestraling te wachten. Een eerdere beoordeling van dit model stelde vast dat de meeste occlusies 8 dagen na bestraling reperfuseren8; de snelheid van occlusies die per dag reperfuseren kan echter per stam verschillen en moet in elk experimenteel model worden bepaald. Het hier gepresenteerde model is van acuut letsel en bedoeld om te worden gebruikt om paden te begrijpen die leiden tot oedeem, dat zich binnen 24 uur na occlusies ontwikkelt. Een ander kenmerk van RVO zijn vlamvormige bloedingen, die kunnen worden waargenomen op 24 uur na het letsel, zoals weergegeven in figuur 5.
Follow-up op 24 uur na RVO kan andere oogheelkundige pathologieën aan het licht brengen die kunnen optreden als gevolg van de RVO-methode. Sommige omvatten, maar zijn niet beperkt tot subretinale bloeding (gekenmerkt door continue bloedpleister), netvliesloslating, volledig ischemisch netvlies (geen bloedstroom in aderen en slagaders) en cataract. Figuur 6 toont fundusbeelden met overeenkomstige OCT als voorbeelden hiervan, behalve in ogen waar cataract ontstaat (figuur 6F), omdat OCT niet kan worden uitgevoerd in aanwezigheid van cataract. Figuur 6A toont voorbeelden van hoe een fundusbeeld en OCT van een ongewond oog er ter referentie uitzien.
De belangrijkste morfologische pathologie van RVO in dit model is retinaal oedeem. Om het niveau van netvliesoedeem te beoordelen, wordt aanbevolen om OCT-beelden te maken vóór de dag van de RVO-procedure voor een basismeting en op het tijdstip van interesse. Figuur 7 toont oct-kwantificering van retinaal oedeem in gewonde ogen. Een andere maatregel die wordt gebruikt om de toestand van neuronale lagen te bepalen, is om de desorganisatie van retinale binnenste lagen (DRIL) te beoordelen. Dit is een maat die in de klinische setting wordt gebruikt en die capillaire nonperfusie vertegenwoordigt, een ander kenmerk van RVO 5,9,10. Een voorbeeld van deze beoordeling is te vinden in figuur 7B. Figuur 7C toont een voorbeeld van een OCT-afbeelding met de bijbehorende labels voor elke retinale laag.
Figuur 1: Tijdlijn en schema van het RVO-muismodel. (A) Tijdlijn van gebeurtenissen van toediening van rozenbengaals tot de beeldvorming van afgesloten aderen. (B) Samengevatte weergave van de methode om succesvolle retinale aderfotocoagulatie te bereiken. Rode vakjes vertegenwoordigen belangrijke stappen in het proces die zeer variabel zijn en die per muismodel en interessante vraag kunnen worden geoptimaliseerd. (C) Retinale hoofdaders (V) zijn breder en donkerder in vergelijking met slagaders (A). Elke hoofdader wordt bestraald met een geleide laser van 532 nm, spotgrootte 50 μm, vermogen 100 mW, duur 1 s, totale energie 0,3 J en stralingsblootstelling 15278,87 J/cm2, op een gemiddelde afstand van 375 μm van de oogzenuw. (D) Lasertoepassing veroorzaakt een verdampingsbel zichtbaar op fundusbeeldvorming van ongeveer 150 μm en beslaat <4% van het totale retinale gebied. Getallen vertegenwoordigen de voorgestelde locatie en bewegingsrichting (pijlen) van de laserstraal bij het bestralen van vaten. Afkortingen: A = slagader; V = ader; AAN = oogzenuw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De tijd van foto-occlusie ten opzichte van de toediening van rozen bengalen is van cruciaal belang voor een succesvolle fotocoagulatie. (A) Fundus retinale beelden van iEC Casp9 WT en iEC Casp9 KO foto-occluded 10 en 20 min na rose bengal toediening. Witte cirkels vertegenwoordigen aderen die succesvolle occlusies hadden. (B) Aantal occlusies onmiddellijk na bestraling (0 h) en 1 dag na de bestraling gedurende 10 min en 20 min post rose bengal injectie van gecombineerde genotypen. Welch's t-test, foutbalken geven SEM aan. (C) Aantal occlusies gescheiden door genotype. Tweeweg ANOVA en Fisher's LSD-test; foutbalken geven SEM aan. Afkortingen: WT = wild-type; KO = knock-out; SEM = standaardfout van het gemiddelde; ANOVA = variantieanalyse; LSD = minst significante verschil; ns = niet significant; P-RVO = post retinale ader occlusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het meten van de basislijn en experimentele laseruitvoer zijn kritieke stappen voor een succesvolle fotocoagulatie. Fundus retinale beelden van iEC Casp9 WT en iEC Casp9 KO 10 min na fotocoagulatie; foto-occluded met verschillende baseline en experimentele laser output niveaus. Lage basislijnlaseruitgang kan worden gecompenseerd met experimentele laseruitgang (12,8 mW, 110 mW). Witte cirkels vertegenwoordigen aderen die succesvolle occlusies hadden. Afkortingen: WT = wild-type; KO = knock-out. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De RVO-methode resulteert in verschillende soorten occlusies. (A) Fundus retinale beelden van C57BL/6J, iEC Casp9 WT en iEC Casp9 KO 10 min na fotocoagulatie met verschillende soorten occlusies: volledig afgesloten, gedeeltelijk afgesloten, gedeeltelijk gereperfuseerd en volledig gereperfuseerd. Inzetstukken tonen een gerichte weergave van een ader die resulteerde in een specifiek type occlusie na fotocoagulatie. (B) Kwantificering van het percentage aderen dat in de verschillende occlusietoestanden voor elk genotype is afgesloten tijdens de eerste 10 minuten na de bestraling. Video's van tien minuten werden geëvalueerd door twee onderzoekers, blind voor genotypen, die nummers toewezen aan de verschillende occlusietoestanden (volledig afgesloten (-2), gedeeltelijk afgesloten (-1), volledig gereperfuseerd (2) en gedeeltelijk gereperfuseerd (1)) per duur. Afkortingen: RVO = retinale ader occlusie; WT = wild-type; KO = knock-out. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Tijdlijn van occlusies na RVO. Fundus retinale beelden van C57BL/6J, iEC Casp9 WT en iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min en 24 h na laserbestraling. De eerste 10 minuten zijn van cruciaal belang voor de toestand van de occlusies en kunnen snel veranderen. Na de eerste 10 min zijn occlusies stabiel tot ten minste 24 uur. Witte cirkels vertegenwoordigen aderen die succesvolle occlusies hadden en gele pijlpunten tonen vlamvormige bloedingen. Afkortingen: RVO = retinale ader occlusie; WT = wild-type; KO = knock-out. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Verschillende oogheelkundige pathologieën kunnen optreden na RVO. (A-E) toont fundus retinale beelden en bijbehorende OCT. (A) Een voorbeeld van een niet-gewond oog dat het RVO-proces niet heeft ondergaan. (B) Subretinale bloeding die bloed uit de bloedvaten in de fundusafbeelding laat lekken. (C) Netvliesloslating gezien door de wazige vouw in de fundus en het opheffen van het netvlies in de OCT. (D) Overmatig oedeem weergegeven door een grote hoeveelheid zwelling in de OCT. (E) Een volledig ischemisch oog met een volledig verminderde bloedstroom resulterend in een wit netvlies. (F) Twee verschillende voorbeelden van een staaroog waarbij geen duidelijk fundusbeeld en OCT konden worden verkregen. OCT schaalbalken: 100 μm. Afkortingen: RVO = retinale ader occlusie; OCT = optische coherentietomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Kwantificering van OCT-beelden. (A) Het onderzoeken van de laagdikte en de DRIL in niet-geverifieerde controleogen en ogen die de RVO-procedure hebben doorlopen. GCL, IPL, INL, OPL, ONL, Outer segment en Whole Retina metingen. Statistieken, Mann-Whitney test p-waarden: GCL: 0.0070, IPL: 0.0205, INL: <0.0001, OPL: 0.0014, ONL: 0.5582, Outer Segment: 0.44852, Whole Retina:0.0019. Foutbalken tonen SEM. (B) DRIL-kwantificering gemeten aan de hand van de OCT-beelden van niet-geverifieerde controles en RVO WT- en KO iEC Casp9-muizen, evenals c57 / BL6J-muizen met RVO. Foutbalken tonen SEM. (C) Voorbeeld OCT met de labels van elke retinale laag. Afkortingen: DRIL = Desorganisatie van de binnenste retinale lagen; RVO = retinale ader occlusie; WT = wild-type; KO = knock-out; GCL = Ganglion Cellaag; IPL = Binnenste Plexiforme Laag; INL = Binnenste nucleaire laag; OPL = Buitenste Plexiforme Laag; ONL = Buitenste nucleaire laag; SEM = standaardfout van het gemiddelde; OCT = optische coherentietomografie; ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Baseline laseruitgang (mW) | Aanbevolen experimentele laseruitgang (mW) | Aanbevolen tijdsblootstelling (ms) |
| <11,0 of >15,0 | Schakel de laser uit en pas de vezel aan het uiteinde aan dat is aangesloten op de laserbesturingskast. Schroef het los en beweeg het iets naar rechts of links. Meet de uitkomst opnieuw, totdat deze een hogere of lagere waarde bereikt. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tabel 1: Lage baseline laseroutput kan worden gecompenseerd met een hogere experimentele laseroutput. Variaties in baseline laser output en aanbevolen experimentele laser output en belichtingstijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het muis RVO-model biedt een manier om RVO-pathologie verder te begrijpen en potentiële therapieën te testen. Hoewel het muis RVO-model veel wordt gebruikt in het veld, is er behoefte aan een actueel gedetailleerd protocol van het model dat de variabiliteit aanpakt en de optimalisatie van het model beschrijft. Hier bieden we een gids met voorbeelden uit ervaring over wat kan worden gewijzigd om de meest consistente resultaten te krijgen voor een cohort van proefdieren en betrouwbare gegevens te verstrekken.
De twee meest essentiële elementen van het RVO-muismodel zijn de laseruitvoer en succesvolle intraveneuze injectie van de kleurstof van de fotosensitizer. Om het vermogen te produceren dat nodig is om coagulatie te induceren wanneer de laser op een bepaalde ader is gericht, moet de laseruitvoer goed worden afgesteld. Hoewel dit kan worden bereikt met behulp van de technieken die in de methode worden voorgesteld, is het belangrijk om rekening te houden met de verschillen in de systeemopstelling van elk laboratorium. Variaties van de glasvezelkabel en hoe deze is ondergebracht in relatie tot de apparatuur en kamertemperatuur zijn enkele van de variabelen die een lage laseruitvoer kunnen verklaren. Onafhankelijke afstemmingen op de systeemopstelling worden aanbevolen om de laseruitvoer te verhogen.
Deze inspanning is echter onbruikbaar zonder een geschikte staartadertechniek om de fotosensitizerkleurstof af te leveren. Staartaderinjecties kunnen moeilijk te bereiken zijn en het is een vaardigheid die tijd kost om te ontwikkelen. Slechte injecties kunnen resulteren in geen occlusies; in dit geval kan rose bengal worden toegediend via IP. Rose bengal toediening via IP is gebruikt om RVO te modelleren, maar met een langere laserbestralingstijd (3 s) en hogere rose bengal concentratie (40 mg / ml)11. Om langdurige laserbestraling te beperken en specifiek op de vasculatuur te richten, is staartadervorming de voorkeurswijze van toediening.
Dit model kan ook worden bereikt met behulp van andere fotoactivatable kleurstoffen zoals Y eosin en natriumfluoresceïne12,13,14, hoewel rose bengal de meest gebruikte fotoactivatable kleurstof is 4,5,6,8. Van alle kleurstoffen is aangetoond dat ze vroege kenmerken van klinische ziekten produceren, zoals retinale bloeding en retinaal oedeem15. Van fotoactiveerbare kleurstoffen is aangetoond dat ze geen nadelige effecten hebben op de dieren, waardoor een onbeduidende systeemtoxiciteitwordt aangetoond 15,16. Er moet ook worden opgemerkt dat de gekozen kleurstof een absorptiemaximum moet hebben dat compatibel is met de golflengte van de laser die wordt gebruikt. Rose Bengal heeft een excitatie bij 525 nm17, natriumfluoresceïne bij 475-490 nm18 en Y eosine bij 490 nm19.
De belangrijkste bronnen van variabiliteit in dit model zijn de tijd van foto-occlusie ten opzichte van de toediening van rozen en bengalen en de baseline en experimentele laseroutput. Terwijl figuur 2 10- en 20-min tijdspunten voor foto-occlusie toont, werden ook een klein aantal 5- en 15-min experimenten uitgevoerd (gegevens niet getoond), wat occlusies opleverde die niet zo consistent waren als het 10-min tijdspunt. Daarom werd 10 minuten gekozen als de optimale wachttijd tussen toediening van rozen en foto-occlusie voor deze methode. Studies hebben echter gemeld dat RVO ook al 3 minuten na de toediening van rose bengal5 kan worden geïnduceerd. Een andere manier om de muisstamspecifieke optimale wachttijd van roos-bengalen tot foto-occlusie te bepalen, is door de relatieve rose bengal-concentratie te controleren met behulp van de fluorescentiebeeldvormingsmodus met een tetramethylrhodamine (TRITC) -filter. Het hier beschreven protocol kan echter worden uitgevoerd met behulp van retinale beeldvormingsmicroscopen die geen TRITC-filter hebben.
De andere bron van hoge variabiliteit in dit model is de baseline laser output. Omdat de dagelijkse niveaus van baseline laseroutput enorm kunnen verschillen, is het belangrijk om de niveaus vóór elk experiment te beoordelen. Het standaardiseren van de baseline laseroutput over studies heen kan helpen het gebruik van het RVO-muismodel te versterken en uit te breiden. Het aanpassen van de glasvezelkabel kan voldoende zijn om de basislijnniveaus te wijzigen; Als een meting van 13,0 mW echter niet kan worden bereikt, biedt tabel 1 een leidraad voor compensatie met behulp van het experimentele vermogen. Het is belangrijk op te merken dat omdat het netvlies een gesloten systeem is, het bepalen van de fractie van afgesloten aderen (het aantal aderen dat wordt afgesloten gedeeld door het aantal bestraalde aderen) essentieel is voor het begrijpen, beheersen en voorspellen van de ernst van de schade in het RVO-model. Eerdere analyse van beschadigde uitlezingen (DRIL en retinale dikte) correleerde met de fractie van aderen die werd afgesloten en voorspelde retinale atrofie 8 dagen na RVO8. Daarom moet de fractie van aderen die wordt afgesloten, worden overwogen en geëvalueerd. Het is nog steeds onduidelijk hoe andere intermediaire occlusietoestanden, zoals gedeeltelijk gereperfuseerd, gedeeltelijk afgesloten of aderen die ooit werden afgesloten en gereperfuseerd door 10 minuten, bijdragen aan de ontwikkeling van retinaal oedeem en atrofie.
Verdere studies van de ogen met dit soort occlusies kunnen helpen onderzoeken of een aanhoudende occlusie noodzakelijk is voor aanzienlijke schade of dat zelfs voorbijgaande occlusies belangrijk zijn in dit model. Afhankelijk van de experimentele vraag die wordt gesteld, zullen verschillende occlusiepercentages optimaal zijn. Een occlusiepercentage van 40-50% is in de meeste gevallen ideaal, wat betekent dat er twee of drie occlusies zijn in een oog met zes aderen. Dit zorgt voor aanzienlijke schade, maar het netvlies is intact en kan worden ontleed voor immunohistochemische en biochemische analyses.
Om dit te bepalen is het onderscheid tussen de pathologische visie op een succesvolle en representatieve occlusie van de RVO-handtekening relevant. De door RVO gepresenteerde natuurlijke occlusie omvat vlamvormige bloedingen20 (niet te verwarren met subretinale bloeding), die in dit model 24 uur na letsel kan worden waargenomen. Het RVO-model kan ook leiden tot ongewenste retinale verwondingen (niet onderscheidend van RVO-pathologie) zoals die in figuur 6B-F, als de parameters niet voorzichtig worden gecontroleerd. Een benadering die kan worden gekozen om deze te vermijden, naast het reguleren van de concentratie van rozenbengaal en het experimentele laservermogen, is om te stoppen met het bestralen van de vaten die een duidelijke vorming van een trombus hebben na de eerste of tweede bestraling.
Andere factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van dit model en bij het beslissen welke aderen moeten worden afgesloten, zijn de muizenstam en de diameter van het vat. Sommige muizenstammen, zoals BALB/c, beter bekend als albino, zijn gevoelig voor lichte schade21. Bovendien hebben ze retinale ontwikkelingsstoornissen die leiden tot defecten in de decussatie bij het optische chiasme en de gezichtsscherpte22,23. Het wordt aanbevolen om de basale retinale en vasculaire integriteit van niet-gewonde controles volledig te evalueren voor de muizenstam die is gekozen voor RVO-onderzoeken. Studies hebben aangetoond dat aderbreedte kan interfereren met de ontwikkeling van retinaal oedeem en ziektepathologie24. Daarom moeten dieren met een vergelijkbaar gewicht worden gebruikt om verdere variabiliteit te voorkomen. De uitsluitingsfactoren van welke ogen te gebruiken in een studie zullen ook afhangen van de experimentele vraag. Het kan verstandig zijn om elk oog op te nemen dat ooit is afgesloten, zelfs als het wordt gereperfuseerd op het follow-uptijdstip voor signalering. Als stabiele occlusies echter gewenst zijn, zouden deze ogen worden uitgesloten. Figuur 6 toont voorbeelden van mogelijke uitsluitingscriteria of ogen die kunnen worden gebruikt voor pathologische analyse.
Om aan te tonen dat deze laserinstellingen geen schade veroorzaakten en de waargenomen effecten echt werden aangedreven door de occlusies zelf, werden in eerdere studiesschijncontroles uitgevoerd 8. De schijnmuizen kregen nog steeds een staartaderinjectie van rose bengal, maar werden bestraald in de parenchymale ruimte tussen de grote vaten in plaats van te worden bestraald op de ader. Dit was een belangrijke stap om ervoor te zorgen dat het model RVO-verwondingen repliceerde die bij patiënten werden gezien in plaats van eenvoudig weefsel te verwonden met een laser. Deze schijnvertoningen tonen geen activering van caspase-9 of -7 of een van de oedeem waargenomen bij de muizen die normale laserbestraling naar de bloedvaten kregen, wat aangeeft dat de laser geen nadelige effecten had. Het hebben van deze bedieningselementen is essentieel, vooral als hogere laserinstellingen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het letsel dat wordt gemodelleerd een nauwkeurige weergave is van de gewenste schade8.
Het RVO-muismodel kan worden toegepast om andere ziekten te bestuderen die het gevolg zijn van hypoxisch-ischemische verwondingen in het netvlies en de hersenen, zoals diabetische retinopathie, retinopathie van prematuriteit en beroerte. Bovendien kan het dienen als een model om signaalroutes te bestuderen die relevant zijn voor de ontwikkeling van vasculair letsel en potentiële behandelingen te testen die neurodegeneratie in het centrale zenuwstelsel verbeteren. De optimalisatie op maat van dit rapport kan de variabiliteit in het muis RVO-model beperken en licht werpen op de pathofysiologie van RVO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
- Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
- Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
- Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
- Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
- Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W.
- Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
- Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
- Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
- Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
- MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
- Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
- Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J.
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
