Summary
ここでは、ローズベンガルとレーザー誘導網膜イメージング顕微鏡システムを使用した網膜静脈閉塞のための最適化されたプロトコルと、遺伝子組み換え株での再現性を最大化するための推奨事項について説明します。
Abstract
網膜静脈閉塞(RVO)のマウスモデルは、神経網膜の低酸素性虚血性損傷を研究するために眼科でよく使用されます。このレポートでは、重要なステップを指摘する詳細な方法と、さまざまな遺伝子組み換えマウス系統間で一貫して成功した閉塞率を達成するための最適化の推奨事項を提供します。RVOマウスモデルは、主に光増感色素の静脈内投与とそれに続く眼科誘導レーザーに取り付けられた網膜イメージング顕微鏡を使用したレーザー光凝固からなる。3つの変数が閉塞一貫性の決定要因として同定された。ローズベンガル投与後の待機時間を調整し、ベースラインと実験レーザー出力のバランスをとることにより、実験間のばらつきを制限し、より高い閉塞の成功率を達成することができます。この方法は、網膜浮腫および低酸素虚血性損傷を特徴とする網膜疾患の研究に使用することができる。さらに、このモデルは血管損傷を誘発するため、神経血管系、神経細胞死、および炎症の研究にも適用できます。
Introduction
網膜静脈閉塞症(RVO)は、2015年に世界中で約2,800万人が罹患した一般的な網膜血管疾患です1。RVOは、働く高齢者と高齢者の視力低下と喪失につながり、近所の10年間で増加すると推定される進行中の視力を脅かす病気を表しています。RVOの明確な病状には、低酸素虚血性損傷、網膜浮腫、炎症、およびニューロン喪失が含まれます2。現在、この障害の治療の第一線は、血管内皮増殖因子(VEGF)阻害剤の投与によるものです。抗VEGF治療は網膜浮腫の改善に役立っていますが、多くの患者は依然として視力低下に直面しています3。この疾患の病態生理学をさらに理解し、潜在的な新しい治療ラインをテストするには、さまざまなマウス系統に対して機能的で詳細なRVOマウスモデルプロトコルを構成する必要があります。
マウスモデルは、ヒト患者に使用されるのと同じレーザー装置を実装し、マウスに適したサイズにスケーリングされたイメージングシステムと組み合わせて開発されました。RVOのこのマウスモデルは、2007年に最初に報告され4、さらにEbneterらによって確立された4,5。最終的に、モデルはFumaらによって最適化され、網膜浮腫6などのRVOの主要な臨床症状を再現しました。このモデルが最初に報告されて以来、多くの研究では、光増感剤色素を投与した後、レーザーで主要な網膜静脈を光凝固させることを使用してモデルが採用されてきました。ただし、投与される色素の量と種類、レーザー出力、および曝露時間は、この方法を使用した研究間で大きく異なります。これらの違いにより、モデルのばらつきが大きくなり、複製が困難になることがよくあります。現在まで、その最適化のための潜在的な道についての具体的な詳細を含む発表された研究はありません。
本報告では、C57BL/6J系統のRVOマウスモデルと、C57BL/6Jをバックグラウンドとし、遺伝子改変マウスの基準株としてRVO病理に関連するタモキシフェン誘導性内皮カスパーゼ-9ノックアウト(iEC Casp9KO)株の詳細な方法論を提示する。以前の研究では、内皮カスパーゼ-9の非アポトーシス活性化が網膜浮腫を引き起こし、神経細胞死を促進することが示されていました8。この株を使用した経験は、他の遺伝子組み換え株に適用できるRVOマウスモデルを調整するための潜在的な改変を決定し、洞察を提供するのに役立ちました。
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Protocol
このプロトコルは、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科研究協会(ARVO)の声明に従います。げっ歯類の実験は、コロンビア大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認および監視されました。
注:すべての実験では、体重約20gの生後2か月のオスのマウスを使用しました。
1. フロックス遺伝子の誘導遺伝子切除のためのタモキシフェンの調製と投与
注:網膜血管の直径は、動物の体重の影響を受ける可能性があります。実験に使用するすべての動物の体重が同じであることを確認してください。
- コーン油中のタモキシフェンを20 mg / mLの濃度に希釈します。
注:タモキシフェンは毒物であり、光に敏感です。アルミホイルなどで光から保護してください。 - 溶液を数秒間ボルテックスします。
- 55°Cのオーブンに15分間放置します。
注意: タモキシフェンが完全に溶解していることを確認してください。追加のボルテックスが必要になる場合があります。 - 溶液を4°Cで最大1週間保存します。
- タモキシフェン注射には、26G針を装着した1mLシリンジを使用してください。.注射部位を70%エタノールで洗浄します。 2 mgのタモキシフェン(20 mg / mLの100 μL)を腹腔内(IP)に、特定の誘導性Creラインに従って確立された時間、1日1回投与します。.
- 実験を開始する前に、動物に2日間の休息をとってください。
2. レーザー光凝固用試薬の調製
- ローズベンガル
注:ローズベンガルは光に敏感です。使用するまで暗所に保管し、最良の結果を得るために新鮮な準備をしてください。- ローズベンガルを滅菌生理食塩水で5 mg / mLに希釈して調製し、0.2 μmシリンジフィルターでろ過します。
- ローズベンガルを含む26G針を取り付けた1mLシリンジを準備します。
- ケタミン/キシラジン
- ケタミンとキシラジンを滅菌生理食塩水で次の濃度に希釈します:ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg)。.
- カルプロフェン
- カルプロフェンを滅菌生理食塩水で1 mg / mLに希釈します。.
- カルプロフェンを含む26 G針を取り付けた1 mLシリンジを準備します。
- 滅菌生理食塩水
- 滅菌生理食塩水を入れた26 G針を取り付けた5 mLシリンジを準備します。
3.レーザーのセットアップ
- 光ファイバーケーブルをそっと扱い、レーザーコントロールボックスと網膜イメージング顕微鏡のレーザーアダプターに接続します。
- 網膜イメージング顕微鏡ランプボックスをオンにします。
- コンピュータの電源を入れ、イメージングプログラムを開きます。
- ホワイトバランスを調整するには、白い紙を使用してマウスの接眼レンズの前に置き、イメージングプログラムで [調整 ]をクリックします。
- キーを回し、レーザーコントロールボックスの画面の指示に従って、レーザーコントロールボックスをオンにします。
注:この実験で使用されるレーザーはクラス3Bであり、目の損傷を引き起こす可能性があります。レーザーを操作するときは保護ゴーグルを着用してください。 - ベースラインのレーザー出力を確認します。
- レーザーパワーメーターを使用してください。
- レーザーコントロールボックスの画面を次のパラメータに調整します:50mWおよび2,000ms。
- レーザーをオンにして、パワーメーターを接眼レンズの前に置きます。
注意: ベースラインレーザー出力をテストするときは、顕微鏡のライトがオフになっていることを確認してください。 - フットスイッチペダルを押してレーザーをアクティブにします。
- レーザー出力の読み取り値を13〜15mWにします。
注意: レーザー出力の読み取りにより、網膜静脈閉塞の成功率が決まります。レーザー出力の読み取り値が低すぎる場合は、レーザー露光のパワーと時間を調整できます。推奨事項については 、表 1 を参照してください。
- レーザーコントロールボックスの画面を次のパラメータに設定して、実験的なレーザー出力を調整します:100 mW、1,000 ms。
- レーザーをオフにします。
注意: 安全のため、および過熱を防ぐために、マウス間でレーザーをオフに保つことをお勧めします。
4.ローズベンガルのマウス尾静脈注射
- 300mLのビーカーに500mLの水を注ぎます。
- ビーカーを電子レンジで1分間温めます。
- ビーカーの温水にガーゼを入れます。
- マウスを拘束具に入れます。
- ガーゼをマウスの尾にそっと押し込み、拡張した静脈を探します。温水拡張後にアルコールワイプを使用して注射部位を消毒します。
- 注射部位に針を挿入し、注射器を引っ張って静脈にいることを確認します。次に、マウスの尾静脈を注射し、動物の体重に応じて正しい量(37.5 mg / kg)を投与します。血腫や出血を避けるために注射部位に圧力をかけます。サイトをワイプします。
- マウスを拘束具から離し、ケージに戻します。
- 麻酔薬を注射する前に、ローズベンガルが循環するまで8分待ちます。
注意: これにより、ローズベンガル注射とレーザー照射の間に合計10分かかります。
5.主要静脈の閉塞
- 加熱されたマウスプラットフォームの電源を入れます。
- 各目にフェニレフリンとトロピカミドを1滴加えます。
- 150 μLの麻酔薬、ケタミン(80-100 mg / kg)およびキシラジン(5-10 mg / kg)IPを注入します。
注:この手順の間、マウスには2回のIPインジェクションが与えられました。したがって、側面は交互になりました。麻酔のためのIP注入は右下腹部象限に投与され、生理食塩水は左下腹部象限に注入されました。注射する前に注射器を引っ張って、針が腹部にあり、臓器ではないことを確認することをお勧めします。 - 動物をつまんで麻酔の深さを決定し、反応しなくなるまで待ちます。
- 眼あたり塩酸プロパラカインを1滴加える(鎮痛剤)。
- 両目にゲル軟膏を追加します。
- 150μLのカルプロフェンを耳の間に皮下注射します。
- プラットフォームにマウスを合わせます。
- 網膜眼底の視野が明確で焦点が合うまでプラットフォームを調整します。
- 網膜静脈を数え、眼底の画像を撮ります。
注:網膜静脈は動脈よりも暗くて広いです。静脈と動脈が交互になります。しかしながら、時には視神経の近くに分岐動脈があり得、したがって2つの隣接する動脈があり得る。 - レーザーをオンにして、視神経乳頭から約375μmの網膜静脈に向けます。
- フットスイッチを押し、レーザービームを100μmまでわずかに動かして血管に照射します。この手順を3回繰り返し、照射が1つのスポットに集中しないように、各パルスの後にレーザービームを移動します。
- 他の主要な血管への照射を繰り返して、2〜3回の閉塞を達成します。
6.0日目に閉塞した静脈の数を確立する
- 血管に照射した後、ランプを消し、10分間待ちます。
注意: 光にさらされると、網膜の損傷や炎症を引き起こす可能性があります。ランプをオフにしますamp 露出を最小限に抑えるために、待機時間中は7。 - ランプをオンに戻し、閉塞した静脈の数を数えます。
- 眼底の画像を撮ります。
7.アフターケア
- 1 mLの滅菌生理食塩水IPを注入します。
注: IP インジェクションの詳細については、セクション 5、ステップ 3 を参照してください。 - 両目に潤滑剤点眼薬を追加します。
- 両目にゲル軟膏を追加します。
- マウスが麻酔から回復するのを観察し、完全に回復するまで他の動物と一緒にケージに戻さないでください。カルプロフェン(5 mg / kg)は、手順後2日まで毎日投与できます。.人間に適用した場合、痛みはRVOの症状ではありません。
注意: 麻酔から完全に回復するまで、動物を放置しないでください。
8.光干渉断層撮影(OCT)による網膜浮腫の評価
注:このステップは、調査員の関心のある時点で実行できます。C57BL/6Jマウスの網膜浮腫のピークは、RVO手術の1日後です。この時点は、マウスの背景によって異なる場合があります。
- 網膜イメージング顕微鏡ライトボックス、OCTマシン、および加熱マウスプラットフォームの電源を入れます。
- 閉塞の翌日、手順5.2〜5.7に従って動物を準備します。
- イメージングおよびOCTソフトウェアプログラムを開きます。
- OCT プログラムで、微調整を 5 に調整します。
- 火傷から75μm離れた場所でOCTを服用するか、4クリックします。
- 網膜の4象限でOCT画像を撮影します。
- トレース ソフトウェアを使用して OCT 画像を解析します。
- 照射前の測定値の網膜の厚さをRVOの1日後または関心のある時点で比較します。
注:データを分析するときは、網膜浮腫の発症に影響を与える可能性があるため、照射された静脈の数を考慮してください。その後、動物は麻酔薬を投与し、続いて灌流非生存手術を行うことによって安楽死させる。
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Representative Results
RVOマウスモデルは、網膜静脈の閉塞を成功裏に達成し、低酸素虚血性損傷、血液網膜関門の破壊、神経細胞死、および網膜浮腫を引き起こすことを目指しています8。図1は、再現性を確保するためのステップのタイムライン、実験計画の概略 図 を示し、実験の質問に応じてさらに最適化できるステップの概要を示しています。変更できる3つの主要なステップは、ローズベンガル投与後の待機時間、ベースラインレーザー出力、および実験的レーザー出力です。この報告では、C57BL / 6Jマウス、ならびに誘導性内皮細胞カスパーゼ-9ノックアウトマウスライン(iEC Casp9)からのWTおよびKO同腹仔を使用して、異なる系統間の最適な設定を決定しました。
ローズベンガル注射からレーザー照射までの待ち時間は、静脈での光凝固の成功を変える可能性があります。待ち時間が短すぎると、静脈内のローズベンガル濃度が低くなる可能性がありますが、待機時間が長すぎると、ローズベンガルが網膜循環から除去される可能性があります。どちらの状況も、光凝固不良と閉塞の失敗につながる可能性があります。レーザー照射直後に得られた閉塞の数を試験したところ、ローズベンガル投与の10分後と20分後にレーザー照射された動物を比較すると、達成された閉塞の数に差はないことが明らかになりました(図2B)。しかし、RVO後1日まで持続する閉塞の数は、遺伝子型とは無関係にローズベンガル投与の20分後にレーザー照射された動物で有意に減少した。この結果は、急性RVO誘発傷害を研究する場合、ローズベンガル投与後の待機時間が閉塞安定性に影響を与える可能性があることを示唆しています。静脈の早期再灌流(損傷後24時間前)は網膜浮腫の発症に影響を与える可能性があるため、ローズベンガル投与からレーザー照射までの正しい待機時間を決定することによって制御する必要があります。.
原理的には、閉塞につながる光凝固の成功はレーザー出力によって駆動されます。これはプロセスの非常に重要な部分ですが、モデルの変動の最大の原因の1つでもあり、一貫性のために最適化する必要があります。これを達成するには、マウスにローズベンガルを注射する前に、セットアップ中にレーザー出力を測定することをお勧めします。ベースラインレーザー出力の推奨出力は13.0〜15.0mWです。実験パワー(100 mW)を変更せずに11.5 mWなどの低いベースラインレーザーパワーは、 図3に示すようにオクルージョンが発生しませんでした。対照的に、13.5 mWのベースラインレーザー出力と100 mWの実験出力は、オクルージョンに成功しました。レーザー出力が13.0 mW未満の場合、実験パワーを110 mWに増やして、より高いベースラインレーザー出力と同じ成功したオクルージョンを達成しました。通常、100mWが標準的な実験電力です。ただし、レーザー出力が13.0mW未満の場合は、 表1の推奨範囲で実験電力を変更することで補償できます。
閉塞の4つの主要なタイプは、静脈のレーザー光凝固の後に起こることが注目されています。これらのタイプの閉塞は 図4A に要約されており、血流量に従って分類されています。完全に閉塞した血管(血流なし)、部分的に閉塞した血管(ほとんどが時折の流れで塞がれている)、部分的に再灌流されている(障害のある途切れのない安定した血流)、および完全に再灌流された血管(明らかな閉塞はまったくない)。遺伝子型によって閉塞の種類が変化するかどうかを調べ、閉塞状態あたりの所要時間を決定するために、レーザー照射後10分間のビデオを評価しました。この評価は、iEC Casp9マウスの照射血管系が、完全に閉塞した状態でより多くの時間を費やすC57BL6/Jよりも、部分的に再灌流された状態および部分的に閉塞した状態でより多くの時間を費やすことを決定するのに役立ちました(図4B)。
図5 は、レーザー光凝固後最初の10分以内に血管の閉塞状態がどのように急速に変化するかを示しています。これらの最初の10分が経過すると、閉塞は安定し、24時間の時点まで維持されます。したがって、眼当たりの正確な初期閉塞数を評価するには、照射後10分間待つことが推奨される。このモデルの以前の評価では、ほとんどの閉塞が照射後8日までに再灌流することが決定されました8;ただし、1日に再灌流する閉塞の割合はひずみによって異なる可能性があり、各実験モデルで決定する必要があります。ここで紹介するモデルは急性損傷のものであり、閉塞後24時間以内に発症する浮腫につながる経路を理解するために使用されることを目的としています。RVOのもう一つの特徴は、 図5に示すように、損傷後24時間で観察できる炎状の出血です。
RVO後24時間のフォローアップにより、RVO法の結果として発生する可能性のある他の眼科の病状が明らかになる可能性があります。いくつかには、網膜下出血(連続的な血液パッチを特徴とする)、網膜剥離、完全虚血性網膜(静脈および動脈に血流がない)、および白内障が含まれるがこれらに限定されない。図 6 は、白内障の存在下ではOCTを行うことができないため、白内障が形成される眼(図6F)を除いて、これらの例として対応するOCTを含む眼底画像を示しています。 図6A は、参考のために、怪我をしていない目の眼底画像とOCTがどのように見えるかの例を示しています。
このモデルにおけるRVOの主な形態学的病理は網膜浮腫である。網膜浮腫のレベルを評価するには、ベースライン読み取りのためにRVO手順の日の前、および関心のある時点でOCT画像を撮影することをお勧めします。図7は、損傷した眼における網膜浮腫のOCT定量化を示す。ニューロン層の状態を決定するために使用される別の尺度は、網膜内層の混乱(DRIL)を評価することである。これは、RVO 5,9,10のもう一つの特徴である毛細血管非灌流を表す臨床現場で使用される尺度です。この評価の例を図7Bに示します。図7Cは、各網膜層に対応するラベルを有するOCT画像の例を示す。
図1:RVOマウスモデルのタイムラインと概略図。 (A)バラベンガル投与から閉塞静脈のイメージングまでのイベントのタイムライン。(B)網膜静脈光凝固を成功させるための方法の要約表現。赤いボックスは、非常に変動しやすく、マウスモデルや関心のある質問ごとに最適化できるプロセスの重要なステップを表しています。(C)網膜大静脈(V)は動脈(A)に比べて幅が広くて暗い。各主要静脈に、視神経から平均375μmの距離で、532nm、スポットサイズ50μm、パワー100mW、持続時間1秒、総エネルギー0.3J、放射曝露15278.87J/cm2の誘導レーザーを照射します。(D)レーザー塗布により、眼底イメージングで約150μmの気化気泡が見え、網膜全面積の<4%をカバーします。数字は、血管を照射する際のレーザー光の推奨位置と移動方向(矢印)を表します。略語:A =動脈;V =静脈;オン=視神経。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:バラベンガル投与に対する光閉塞の時間は、光凝固を成功させるために重要です 。 (A)iEC Casp9 WTおよびiEC Casp9 KOの眼底網膜像は、ローズベンガル投与の10分後および20分後に光遮蔽された。白い円は、閉塞が成功した静脈を表します。(B)照射直後(0時間)および照射後1日、ローズベンガル注射後10分および20分の併用遺伝子型の閉塞数。ウェルチの t検定、エラーバーはSEMを示します。 (C)遺伝子型によって分離された閉塞の数。双方向分散分析とフィッシャーのLSDテスト。エラーバーはSEMを示します。 略語:WT =野生型;KO =ノックアウト;SEM = 平均の標準誤差ANOVA = 分散分析;LSD = 最小有意差;ns =有意ではありません。P-RVO =網膜静脈閉塞後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ベースラインと実験的なレーザー出力の測定は、光凝固を成功させるための重要なステップです。 光凝固の10分後のiEC Casp9 WTおよびiEC Casp9 KOの眼底網膜画像;異なるベースラインおよび実験的なレーザー出力レベルで光遮蔽。低いベースラインレーザー出力は、実験的なレーザー出力(12.8 mW、110 mW)で補償できます。白い円は、閉塞が成功した静脈を表します。略語:WT =野生型;KO =ノックアウト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:RVO法では、さまざまな種類の閉塞が発生します 。 (A)光凝固の10分後のC57BL/6J、iEC Casp9 WT、およびiEC Casp9 KOの眼底網膜画像:完全閉塞、部分閉塞、部分再灌流、完全再灌流。挿入図は、光凝固後に特定のタイプの閉塞をもたらした静脈の焦点を絞ったビューを示す。(B)照射後最初の10分間に、各遺伝子型の異なる閉塞状態で閉塞した静脈の割合の定量化。10分間のビデオは、遺伝子型を知らされていない2人の研究者によって評価され、持続時間ごとに異なる閉塞状態(完全に閉塞(-2)、部分的に閉塞(-1)、完全に再灌流(2)、および部分的に再灌流された(1))に番号を割り当てました。略語:RVO =網膜静脈閉塞;WT =野生型;KO =ノックアウト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: RVO 後のオクルージョンのタイムライン。 レーザー照射後5分、10分、24時間のC57BL/6J、iEC Casp9 WT、およびiEC Casp9 KO 0の眼底網膜画像。最初の10分間はオクルージョンの状態にとって重要であり、急速に変化する可能性があります。最初の10分後、閉塞は少なくとも24時間まで安定しています。白い円は閉塞に成功した静脈を表し、黄色の矢じりは炎の形をした出血を表しています。略語:RVO =網膜静脈閉塞;WT =野生型;KO =ノックアウト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:RVO後に異なる眼科病理が発生する可能性があります 。 (A〜E)は眼底網膜画像および対応するOCTを示す。 (A)RVOプロセスを経なかった無傷の眼の例。(B)眼底画像の血管から血液が漏れていることを示す網膜下出血。(C)眼底のぼやけたひだとOCTの網膜の隆起によって見られる網膜剥離。 (D)OCTの大量の腫れによって示される過度の浮腫。 (E)血流が完全に損なわれ、網膜が白くなる完全な虚血性眼。(F)鮮明な眼底画像とOCTが得られなかった白内障眼の2つの異なる例。OCTスケールバー:100μm。略語:RVO =網膜静脈閉塞;OCT = 光コヒーレンストモグラフィー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:OCT画像の定量化。(A)レーザーなしコントロールアイとRVO手順を経たアイの層の厚さとDRILを調べます。GCL、IPL、INL、OPL、ONL、アウターセグメント、および網膜全体の測定。統計、マンホイットニー検定p値:GCL:0.0070、IPL:0.0205、INL:<0.0001、OPL:0.0014、ONL:0.5582、外部セグメント:0.44852、網膜全体:0.0019。エラーバーはSEMを示す。 (B)非レーザーコントロールおよびRVO WTおよびKO iEC Casp9マウスならびにRVOを有するc57/BL6JマウスからのOCT画像から測定されたDRIL定量。エラーバーはSEMを示す。 (C)OCTの例と各網膜層のラベル。略語:DRIL =網膜内層の混乱;RVO =網膜静脈閉塞;WT =野生型;KO =ノックアウト;GCL = 神経節細胞層;IPL =内側のプレキシフォーム層。INL =内核層;OPL =外側のプレキシフォーム層;ONL = 外核層;SEM = 平均の標準誤差OCT = 光コヒーレンストモグラフィー;ns = 有意ではない。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ベースラインレーザー出力(mW) | 推奨実験用レーザー出力(mW) | 推奨時間露出 (ミリ秒) |
| <11.0 または >15.0 | レーザーをオフにし、レーザーコントロールボックスに接続されている端のファイバーを調整します。ネジを外し、右または左に少し動かします。より高い値またはより低い値に達するまで、結果を再度測定します。 | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
表1:低いベースラインレーザー出力は、より高い実験的レーザー出力で補償できます。 ベースラインレーザー出力の変動と推奨される実験レーザー出力と露光時間。
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Discussion
マウスRVOモデルは、RVOの病理をさらに理解し、潜在的な治療法をテストするための手段を提供します。マウスRVOモデルは現場で広く使用されていますが、その変動性に対処し、モデルの最適化を記述するモデルの現在の詳細なプロトコルが必要です。ここでは、実験動物のコホート全体で最も一貫した結果を得るために何を変更できるかについての経験からの例をガイドし、信頼できるデータを提供します。
RVOマウスモデルの2つの最も重要な要素は、レーザー出力と光増感剤色素の静脈内注射の成功です。レーザーが特定の静脈に向けられているときに凝固を誘発するために必要なパワーを生成するには、レーザー出力を適切に調整する必要があります。これは、メソッドで提案された手法を使用して達成できますが、各ラボのシステムセットアップの違いを考慮することが重要です。光ファイバケーブルのバリエーションと、機器と室温に関連してどのように収容されるかは、低レーザー出力を説明する可能性のある変数の一部です。レーザー出力を増やすには、システムセットアップを個別に調整することをお勧めします。
しかし、この努力は、光増感色素を送達するための適切な尾静脈技術がなければ動作不能である。尾静脈注射は達成が難しい場合があり、開発に時間がかかるスキルです。不十分な注射は閉塞をもたらさない可能性があります。この場合、ローズベンガルはIPを介して管理できます。IPによるローズベンガル投与はRVOのモデル化に使用されていますが、レーザー照射時間が長く(3秒)、ローズベンガル濃度が高くなっています(40 mg/mL)11。長時間のレーザー照射を制限し、血管系を特異的に標的とするために、尾静脈が好ましい投与様式である。
このモデルは、Yエオシンやフルオレセインナトリウムなどの他の光活性化可能な色素を使用して達成することもできます12,13,14、ローズベンガルが最も使用されている光活性化可能な色素4,5,6,8です。すべての色素は、網膜出血や網膜浮腫などの臨床疾患の初期の特徴を生み出すことが示されています15。光活性化可能な色素は動物に悪影響を及ぼさないことが示されているため、わずかなシステム毒性を示します15,16。選択される色素は、使用されるレーザの波長と互換性のある吸収極大を有するべきであることにも留意すべきである。ローズベンガルは525 nm17、フルオレセインナトリウムは475-490 nm 18、Yエオジンは490 nm19で励起します。
このモデルの変動の主な原因は、バラベンガル投与に対する光閉塞の時間と、ベースラインおよび実験的なレーザー出力です。 図2 は、光オクルージョンの10分と20分の時点を示していますが、少数の5分と15分の実験も実行され(データは示されていません)、10分の時点ほど一貫性のないオクルージョンが得られました。したがって、この方法では、ローズベンガル投与から光閉塞までの最適な待機時間として10分が選択されました。しかし、研究によると、RVOはローズベンガル5の投与後3分という早い時期にも誘発される可能性があることが報告されています。ローズベンガルから光オクルージョンまでのマウス系統特異的な最適な待機時間を決定する別の方法は、テトラメチルローダミン(TRITC)フィルターを備えた蛍光イメージングモードを使用して相対的なローズベンガル濃度を監視することです。しかしながら、ここで説明するプロトコルは、TRITCフィルタを有しない網膜画像化顕微鏡を用いて実施することができる。
このモデルにおける大きな変動性の他の原因は、ベースラインレーザー出力です。ベースラインレーザー出力の日々のレベルは大きく異なる可能性があるため、各実験の前にレベルを評価することが重要です。研究全体でベースラインレーザー出力を標準化することは、RVOマウスモデルの使用を強化し、拡大するのに役立ちます。ファイバーケーブルを再調整するだけで、ベースラインレベルを変更できます。ただし、13.0mWの測定値に到達できない場合は、 表1 に実験電力を使用した補償のガイドを示します。網膜は閉鎖系であるため、閉塞した静脈の割合(閉塞した静脈の数を照射された静脈の数で割ったもの)を決定することは、RVOモデルの損傷の重症度を理解、制御、および予測するために不可欠であることに注意することが重要です。損傷した読み出し(DRILおよび網膜の厚さ)の以前の分析は、閉塞した静脈の割合と相関し、RVO8の8日後に網膜萎縮を予測しました。したがって、閉塞した静脈の割合を考慮し、評価する必要があります。部分再灌流、部分閉塞、または一度閉塞して10分で再灌流された静脈などの他の中間閉塞状態が、網膜浮腫および萎縮の発症にどのように寄与するかはまだ不明です。
これらのタイプの咬合を伴う眼のさらなる研究は、持続的な咬合が実質的な損傷に必要かどうか、またはこのモデルで一時的な咬合でさえ重要であるかどうかを調査するのに役立ちます。実験的な質問に応じて、異なる閉塞率が最適になります。ほとんどの場合、40〜50%の閉塞率が理想的であり、6本の静脈を持つ眼に2つまたは3つの閉塞を意味します。これにより、かなりの損傷が保証されますが、網膜は無傷であり、免疫組織化学的および生化学的分析のために解剖することができます。
これを決定するには、RVOシグネチャの成功した代表的な閉塞の病理学的見解を区別することが関連している。RVOによって提示される自然閉塞には、炎状の出血20(網膜下出血と混同しないでください)が含まれ、これは損傷後24 時間でこのモデルで観察できます。RVOモデルは、そのパラメータが慎重に制御されていない場合、 図6B-Fに示すような望ましくない網膜損傷(RVO病理の特徴ではない)を引き起こす可能性もあります。これらを回避するために取ることができるアプローチは、ローズベンガルの濃度と実験的なレーザー出力を調整することに加えて、1回目または2回目の照射後に血栓が明確に形成されている血管への照射を停止することです。
このモデルを採用し、どの静脈を閉塞するかを決定する際に考慮すべき他の要因は、マウスの系統と血管の直径です。最も一般的にアルビノとして知られているBALB / cなどの一部のマウス系統は、軽い損傷を受けやすい21。さらに、彼らは視交叉と視力22,23での解剖の欠陥につながる網膜発達障害を持っています。RVO研究のために選択されたマウス系統の無傷対照の基礎網膜および血管の完全性を完全に評価することが推奨される。研究によると、静脈幅は網膜浮腫および疾患病理の発症を妨げる可能性があります24。したがって、さらなる変動を避けるために、同様の体重の動物を使用すべきである。研究で使用する目を排除する要因は、実験の質問にも依存します。シグナル伝達のフォローアップ時点で再灌流された場合でも、一度閉塞した眼を含めるのが賢明かもしれません。ただし、安定した閉塞が必要な場合は、これらの目は除外されます。図6は、病理学的分析に使用できる可能性のある除外基準または眼の例を示しています。
これらのレーザー設定が損傷を引き起こさず、見られた効果が本当に閉塞自体によって引き起こされたことを示すために、以前の研究で偽の制御が行われました8。偽マウスは依然としてローズベンガルの尾静脈注射を受けたが、静脈に照射されるのではなく、主要な血管の間の実質空間に照射された。これは、モデルが単にレーザーで組織を傷つけるのではなく、患者に見られるRVO損傷を再現することを保証するための重要なステップでした。これらの偽物は、カスパーゼ-9または-7の活性化、または血管への正常なレーザー照射を受けたマウスに見られる浮腫のいずれも示さず、レーザーに悪影響がなかったことを示しています。これらのコントロールを持つことは、特にモデル化されている損傷が望ましい損傷の正確な表現であることを保証するためにより高いレーザー設定が使用される場合に不可欠です8。
RVOマウスモデルは、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、脳卒中など、網膜および脳の低酸素性虚血性損傷に起因する他の疾患の研究に適用できます。さらに、血管損傷の発症に関連するシグナル伝達経路を研究し、中枢神経系の神経変性を改善する潜在的な治療法をテストするためのモデルとして役立ちます。このレポートで調整された最適化は、マウスRVOモデルの変動を制限し、RVOの病態生理学に光を当てることができます。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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