Summary
Ici, nous décrivons l’utilisation de plaques de gradient inducteur pour évaluer la motilité de l’essaimage bactérien tout en obtenant simultanément plusieurs réponses de concentration.
Abstract
La motilité d’essaimage bactérien est un phénotype microbiologique commun que les communautés bactériennes utilisent pour migrer sur les surfaces semi-solides. Dans les études de la motilité d’essaimage induite, la concentration spécifique d’un inducteur peut ne pas être en mesure de signaler des événements se produisant dans la plage de concentration optimale pour obtenir les réponses souhaitées d’une espèce. Les plaques semi-solides contenant plusieurs concentrations sont couramment utilisées pour étudier la réponse dans une plage de concentration d’inducteur. Cependant, les plaques semi-solides séparées augmentent les variations de viscosité moyenne et de teneur en humidité à l’intérieur de chaque plaque en raison du temps de solidification non uniforme.
Cet article décrit une méthode en une étape pour tester simultanément la motilité de l’essaimage de surface sur une seule plaque de gradient, où les puits d’essai disposés isométriquement permettent l’acquisition simultanée de réponses multiconcentrations. Dans les présents travaux, l’essaimage de surface d’Escherichia coli K12 et de Pseudomonas aeruginosa PAO1 a été évalué en réponse à un gradient de concentration d’inducteurs tels que le resvératrol et l’arabinose. Périodiquement, les morphologies de l’essaim ont été imagées à l’aide d’un système d’imagerie pour capturer l’ensemble du processus d’essaimage de surface.
La mesure quantitative des morphologies de l’essaim a été acquise à l’aide du logiciel ImageJ, fournissant des informations analysables sur la zone de l’essaim. Cet article présente une méthode simple de plaque d’essaim à gradient qui fournit des informations qualitatives et quantitatives sur les effets des inducteurs sur l’essaimage de surface, qui peut être étendue pour étudier les effets d’autres inducteurs sur un plus large éventail d’espèces bactériennes mobiles.
Introduction
La motilité d’essaimage bactérien fait référence à la migration collective de cellules bactériennes à travers la surface d’une substance. Outre les plaques de gélose semi-solides spécialement préparées en laboratoire1, ce phénotype est également observé sur certains substrats mous tels que les tissus animaux2, les surfaces hydratées3 et les racines végétales4. Alors qu’une surface semi-solide est considérée comme l’une des conditions fondamentales de l’essaimage bactérien, certaines espèces ont également besoin d’un milieu riche en énergie pour soutenir leur motilité d’essaimage5. La rotation des flagelles alimente à la fois la nage et l’essaimage, la nage de motilité décrit la motilité unicellulaire dans un environnement liquide, tandis que l’essaimage est le mouvement synchrone d’une population microbienne sur des surfaces semi-solides.
La viscosité du substrat influence la motilité bactérienne; des études sur des microbes pathogènes, tels que Helicobacter pylori, ont montré que la motilité de l’agent pathogène change en fonction de la viscosité de la couche de mucine, qui est influencée par l’acidification environnementale chez l’hôte humain6. Pour reproduire ces environnements, des études antérieures utilisant une concentration de gélose supérieure à 0,3% (p / v) limitent la motilité de nage bactérienne pour effectuer un déplacement progressif vers l’essaimage de surface. L’utilisation d’une concentration de gélose supérieure à 1 % (p/v) empêche la motilité d’essaimage de nombreuses espèces7. Les motifs de colonie formés à la surface sont divers, y compris mat8 sans caractéristiques, œil de taureau9, dendrites10 et vortex11.
Bien que la pertinence de ces modèles reste incertaine, ces modèles semblent dépendre d’indices environnementaux et chimiques12. Les indices environnementaux couvrent différents aspects, y compris la température, la salinité, la lumière et le pH, tandis que les indices chimiques comprennent la présence de molécules microbiennes de détection du quorum, de sous-produits biochimiques et de nutriments. Les molécules de signalisation de détection de quorum auto-inducteurs telles que l’AHL (N-hexanoyl-L homosérine lactone) peuvent avoir un impact sur l’essaimage de surface en régulant la production de tensioactif13,14. Le resvératrol, un composé phytoalexine, pourrait limiter la motilité de l’essaimage bactérien15.
Dans le présent travail, nous étudions l’effet des concentrations de gradient de resvératrol sur la souche Escherichia coli K12 de type sauvage et étudions la motilité d’essaimage inductible à l’arabinose des espèces E. coli K12-YdeH et Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La production de l’enzyme YdeH est induite par l’arabinose via le promoteur araBAD, ce qui entraîne une perturbation cellulaire c-di-GMP et affecte la motilité de l’essaimage bactérien16,17. Ce comportement d’essaimage inductible est étudié à l’aide de plaques d’essaim à gradient arabinose avec des souches E. coli K12-YdeH et P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Les plaques d’essaim gradient sont préparées en solidifiant successivement un milieu à double couche (Figure 1B). La couche inférieure comprend le milieu ajouté avec l’inducteur, versé sur un côté d’une boîte de Petri soutenue. Lors de la solidification de la couche inférieure, la boîte de Petri est renvoyée sur une surface plane, où la couche supérieure contenant le milieu sans inducteur est ajoutée de l’autre côté de la plaque. Une fois les plaques d’essaim complètement solidifiées, des puits de rétention disposés isométriquement sont produits en forant des trous sur les plaques d’essaim suivant une disposition fixe (figure 1C) ou en imprimant les puits à l’aide d’un modèle imprimé en 3D du couvercle de la plaque contenant des chevilles pendant le processus de durcissement du milieu (figure supplémentaire S1). Un système d’imagerie sur gel est utilisé pour capturer les morphologies d’essaimage à différents moments (Figure 2). L’analyse de l’essaimage de surface à l’aide du logiciel ImageJ (figure supplémentaire S2) fournit des résultats quantitatifs du processus d’essaimage de surface (figure 3).
Ainsi, nous proposons une méthode simple pour tester la motilité de l’essaimage de surface dans une plage de concentration d’inducteurs. Cette méthode peut être utilisée pour tester les réponses de concentration multiples d’autres inducteurs en mélangeant l’inducteur dans le milieu de la couche inférieure et peut être appliquée à d’autres espèces mobiles (par exemple, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Cette approche pourrait fournir des résultats qualitatifs et quantitatifs fiables pour le criblage d’un seul inducteur chimique, et des plaques séparées pourraient être utilisées pour évaluer davantage d’inducteurs chimiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation des plaques d’essaim gradient
- Préparation du milieu d’essaim
NOTE: Voir la section de discussion pour une brève comparaison des différentes viscosités moyennes; Une concentration de 0,7 % (p/v) de gélose dans le milieu de l’essaim a été utilisée dans ce protocole.- Préparer le bouillon de lysogénie (LB) en poudre avec de la gélose dans deux flacons coniques; chaque flacon contient 2 g de tryptone, 2 g de chlorure de sodium, 1 g d’extrait de levure et 1,4 g de gélose. Ajouter l’eau double distillée (ddH2O) et remuer la suspension à l’aide d’une barre d’agitation magnétique. Réglez le volume final à 200 mL en ajoutant du ddH2O supplémentaire.
- Autoclaver la solution à 121 °C pendant 20 min. Utilisez un bouchon perméable à l’air ou un film d’étanchéité de bouteille avec une bouche d’aération.
REMARQUE: La gélose se dissout lorsqu’elle est chauffée dans l’autoclave. - Lorsque la température tombe à 65 °C, mélanger la solution pour assurer l’homogénéité et transférer le milieu dans un incubateur ou un bain-marie à 65 °C pour une utilisation à court terme.
- Préparation du milieu d’essaim de la couche inférieure
REMARQUE: Le milieu de la couche inférieure est le mélange de milieu d’essaim et de solutions mères inductrices. La formulation des plaques d’essaim à gradient inducteur est présentée dans le tableau 1.- Préparer une solution mère de resvératrol de 100 mM en dissolvant 114,12 mg de poudre de resvératrol lyophilisée dans 5 mL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) et conserver la solution à -20 °C.
- Préparer une solution mère d’arabinose à 20 % (p/v) en dissolvant 6 g de poudre d’arabinose dans 30 mL de ddH2O; attendre 10-15 min pour permettre à l’arabinose de se dissoudre; et conservez la solution à température ambiante.
- Retirez le milieu de l’incubateur à 65 °C et placez-le à température ambiante; laisser refroidir le milieu de l’essaim jusqu’à ce que la fiole d’Erlenmeyer soit suffisamment froide pour tenir (~50 °C). Ne placez pas le milieu de l’essaim à température ambiante pendant de longues périodes, car cela entraînerait la solidification de la gélose.
- Ajouter le volume requis de la solution mère inductrice au milieu de l’essaim à 50 °C (tableau 1). Utilisez une pipette pour distribuer la solution inductrice au lieu de la verser. Tourbillonnez doucement pour mélanger l’inducteur avec le milieu de l’essaim.
REMARQUE: Cette étape concerne les inducteurs qui ne peuvent pas être autoclavés. Veillez à ne pas introduire de bulles dans le milieu.
- Préparation de plaques d’essaim à gradient double couche
REMARQUE: Le milieu de la couche supérieure est un milieu LB contenant 0,7% (p / v) de gélose.- Étiquetez les boîtes de Petri carrées de 13 x 13 cm avec le nom de l’inducteur et les souches, et soutenez les plats sur le bord des couvercles (Figure 1B).
- Ajouter 40 mL de milieu chaud de couche inférieure (50 °C) à l’aide d’une pipette de 50 mL ou d’un tube de centrifugeuse de 50 mL.
REMARQUE: Alternativement, pour les boîtes de Petri carrées de 13 x 13 cm, la couche inférieure de 40 mL et le milieu de couche supérieure conviennent; pour les boîtes de Petri carrées de 10 x 10 cm, la couche inférieure de 25 mL et le milieu de couche supérieure conviennent. - Laissez le milieu de la couche inférieure durcir à découvert pendant 1 h à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire. Ne pas déranger les boîtes de Petri carrées pendant que le milieu se solidifie.
REMARQUE: Lors du durcissement de la couche inférieure, le milieu d’essaim ne contenant pas d’inducteurs doit être maintenu dans un incubateur ou un bain-marie à 65 ° C. - Une fois la couche inférieure complètement solidifiée, retirez les couvercles et posez les boîtes de Petri carrées à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
- Ajouter 40 mL de milieu chaud de couche supérieure (50 °C) à l’aide d’une pipette de 50 mL ou d’un tube de centrifugeuse de 50 mL.
REMARQUE: Le milieu de la couche supérieure ne contient pas d’inducteurs. - Durcir les plaques à double couche sur la paillasse couvertes et non dérangées pendant 1 h. Conserver les plaques préparées à 4 °C jusqu’à 24 h.
REMARQUE: Des temps de durcissement plus longs réduiraient la teneur en humidité et limiteraient la motilité de l’essaimage.
2. Croissance d’E. coli K12 et de P. aeruginosa PAO1
- Préparer 500 mL de milieu LB en ajoutant 5 g de tryptone, 5 g de NaCl et 2,5 g d’extrait de levure dans du ddH2O, et compléter la solution à 500 mL. Autoclaver la solution en cycle liquide pendant 20 min à 121 °C et la conserver à 4 °C.
- Préparer 100 mL de milieu LB-agar à 1,5 % (p/v) en ajoutant 1 g de tryptone, 1 g de NaCl, 0,5 g d’extrait de levure et 1,5 g de gélose dans du ddH2O et compléter la solution à 100 mL. Autoclaver la solution en cycle liquide pendant 20 min à 121 °C. Transférer le milieu dans un bain-marie à 50 °C pour empêcher la gélose de se solidifier.
- Lorsque la fiole de milieu LB-agar est confortable à tenir, ajouter 20 mL de milieu LB-gélose dans une boîte de Petri (10 cm de diamètre) à l’aide d’une pipette de 25 mL. Laissez la plaque à température ambiante pendant la nuit et conservez la plaque de gélose LB à 4 °C.
- Prenez des cultures d’inventaire stockées à -80 °C, des souches E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PAO1-YdeH sur des boîtes de Petri LB-agar à l’aide de boucles d’inoculation jetables. Incuber les boîtes de Petri inversées pendant la nuit à 37 °C.
- Choisissez des colonies individuelles pour différentes souches dans les boîtes de Pétri, inoculez chaque colonie dans 5 mL de milieu LB et incubez la culture à 37 °C dans un agitateur orbital de laboratoire réglé à 220 tr / min.
- Lorsque la densité de culture atteint OD600nm ~ 1.0, retirez la culture du shaker et placez-la à température ambiante. Ajustez la densité de culture à OD600nm = 1,0, comme décrit à l’étape 3.2.1.
3. Inoculation et incubation de plaques d’essaim gradient
- Préparation des puits d’inoculation
REMARQUE: Des modèles de couverture d’impression 3D capables de générer des puits séparés par une distance standard peuvent être utilisés à la place de la méthode décrite ci-dessous (figure supplémentaire S1).- Marquez les positions des puits sur le papier A4 illustré à la figure 1C. Définissez trois concentrations d’essai dans une boîte de Petri carrée avec deux ou trois répétitions.
- Placez le papier A4 marqué sous une plaque dégradée solidifiée. Poussez le côté plus large d’une pointe de pipette de 100 μL dans la surface du milieu semi-solide à la position marquée. Appuyez sur la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’elle atteigne le fond du milieu de la couche supérieure.
- Lorsque la pointe touche le fond, n’appliquez aucune force verticale à la pointe; faire pivoter doucement la pointe pour isoler le contenu du puits cylindrique.
- Déplacez horizontalement les extrémités de la pipette sur une très petite distance pour permettre à l’air de circuler dans l’endroit étroit mis de côté. Appuyez sur la pointe avec l’index pour bloquer le flux de gaz à l’intérieur de la pointe tout en tenant la pipette à l’aide du pouce et du majeur.
- Retirez la pointe verticalement, en gardant le contenu du puits dans la pointe tout en la retirant.
REMARQUE: Si le contenu du puits glisse, appliquez un peu plus de pression avec l’index pour sceller complètement la pointe. - Répétez les étapes 3.1.2 à 3.1.5 dans toutes les positions marquées. Couvrir la plaque d’essaim avant l’inoculation.
- Inoculation et incubation sur plaque de gradient
- Ajuster la densité de culture de croissance pendant la nuit à OD600nm = 1,0.
- Pipette 80 μL de la culture de croissance pendant la nuit dans chaque puits. Ne renversez pas la culture bactérienne à l’extérieur des puits.
- Enveloppez les plaques avec un film d’étanchéité. Pour une observation à long terme (3-5 jours), enveloppez les plaques avec du ruban en caoutchouc de laboratoire stérile.
REMARQUE: Le ruban en caoutchouc est moins susceptible de se casser. - Placez un bécher rempli de ddH2O dans l’incubateur pour maintenir l’humidité à l’intérieur de l’incubateur. Incuber les plaques d’essaim de gradient à 37 °C.
REMARQUE: Ne pas incuber les plaques d’essaim à l’envers; cela entraînera la fuite de la culture bactérienne des puits. - Imagez la plaque de l’essaim immédiatement après l’inoculation, en l’enregistrant comme le point de temps de 0 h .
4. Imagerie de l’essaimage de surface bactérienne
- Sortez les plaques d’essaim, une à la fois, de l’incubateur toutes les 12 heures, en tenant la plaque horizontalement, et placez-les dans le système d’imagerie en gel (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Ne laissez pas d’empreintes digitales sur la surface des plaques; tenez le côté de la plaque d’essaim avec des gants propres. - Sélectionnez le mode d’imagerie du gel ; exposer la plaque d’essaim à la lumière blanche; et ajustez la distance focale pour donner la vue la plus claire des essaims.
REMARQUE: Utilisez la même distance focale pour toutes les plaques d’un lot donné. - Améliorez la luminosité des essaims pour une observation claire en ajustant le temps d’exposition à 300 ms. Ajustez le seuil pour minimiser les interférences de la lumière de fond.
REMARQUE: Le seuil est ajusté sur l’interface de fonctionnement du système d’imagerie par gel. Augmenter les valeurs sur la gauche pour minimiser les interférences de la lumière de fond; diminuer les valeurs à droite pour améliorer la luminosité des essaims. Dans ce protocole, la région se situe généralement entre 6 000 et 50 000. - Enregistrez le fichier image pour une analyse plus approfondie. Enregistrez le temps d’imagerie, le type d’inducteur, l’orientation du gradient et les déformations dans un fichier .txt .
5. Quantifiez la zone de l’essaim à l’aide du logiciel ImageJ
- Importez le fichier image acquis à l’aide du système d’imagerie par gel.
- Définissez la barre d’échelle à l’aide du logiciel ImageJ et appliquez-la à toutes les images.
- Créez un segment de ligne marquant la longueur du tableau en cliquant sur l’outil de ligne.
- Cliquez sur Analyser | Définissez l’échelle pour ouvrir la fenêtre Définir l’échelle .
- Tapez la longueur réelle dans Distance connue et Unité de longueur.
REMARQUE: Étant donné que des boîtes de Petri carrées de 13 x 13 cm ont été utilisées dans ce travail, la longueur réelle est « 130 » et l’unité de longueur est « mm ». - Cochez la case Global .
- Insérez une barre d’échelle en cliquant sur Analyser | Outils | Barre d’échelle, tapez Largeur en mm, Hauteur en pixels, Taille de police, puis sélectionnez Couleur, Arrière-plan et Emplacement dans le menu déroulant. Vous pouvez également choisir Texte en gras, Masquer le texte, Serif Font et Superposition en cochant les cases.
REMARQUE: Le choix de ces paramètres est déterminé par les utilisateurs et les propriétés des images. Dans ce protocole, la largeur en mm a été définie sur 25, la hauteur en pixels sur 20, la taille de la police sur 80 et la barre d’échelle a été placée dans le coin inférieur droit en sélectionnant Emplacement | En bas à droite. D’autres paramètres peuvent être choisis par l’utilisateur.
- Cliquez sur | de processus Ombres pour améliorer la netteté de l’image, en particulier les limites (Figure supplémentaire S2A). Cliquez sur | de processus Batch pour traiter les images.
REMARQUE : Le but de cette étape est de fournir une démarcation des limites plus précise.- Traitez une image comme référence en cliquant sur Traiter | Ombres | Sud.
- Cliquez sur | de processus | par lots Macro pour ouvrir la fenêtre Traitement par lots . Recherchez les commandes suivantes affichées dans la fenêtre :
run(« Sud »);
run(« Enregistrer »);
fermer(); - Tapez l’adresse du dossier des images d’origine et l’adresse du fichier de sortie en cliquant sur Processus dans la fenêtre Traitement par lots .
REMARQUE: Il est recommandé d’exporter des images avec des ombres vers un autre dossier et de conserver une copie des images d’origine.
- Utilisez l’outil Baguette (tracé) pour sélectionner les essaims individuellement et ajuster la tolérance (double-cliquez sur l’outil Baguette (tracé)) jusqu’à ce que la ligne générée s’adapte correctement à la limite de l’essaim (Figure supplémentaire S2B).
REMARQUE: Tout d’abord, cliquez sur l’outil Wand (traçage) et sélectionnez un essaim sur une image. Si les limites n’ont pas été représentées correctement, double-cliquez sur l’outil Baguette (tracé) pour ouvrir les fenêtres de l’outil Baguette , où la tolérance peut être ajustée. - Cliquez sur Analyser | Mesure pour exporter la valeur de la surface.
- Répétez les étapes 5.1.1 à 5.1.5 jusqu’à ce que tous les essaims soient mesurés, enregistrez les résultats dans un fichier .csv pour une analyse plus approfondie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le flux de travail consistant en la préparation de plaques d’essaim de gradient, l’inoculation et l’incubation est illustré à la figure 1B. Pour générer des plaques de nage en dégradé, le milieu de la couche inférieure est versé dans des plats appuyés à environ 4,3 ° du plan horizontal (figure supplémentaire S3), puis verse le milieu de la couche supérieure une fois la couche inférieure complètement solidifiée. La composition du milieu à double couche est présentée dans le tableau 1. Ensuite, la culture bactérienne cultivée pendant la nuit est pipetée dans les puits d’essai et incubée à 37 ° C, en maintenant des niveaux d’humidité appropriés. Plusieurs concentrations d’essai sont définies dans une plaque d’essaim à gradient avec deux ou trois répétitions (Figure 1C). L’option alternative d’un modèle d’impression 3D du couvercle de couverture avec la saillie en colonnes sur les points d’essai est illustrée dans la figure supplémentaire S1.
Deux espèces modifiées, E. coli K12-YdeH et P. aeruginosa PAO1-YdeH, ont été testées sur des plaques de gradient arabinose. La figure 2A montre le test du processus d’essaimage de surface dans cinq puits, avec chevauchement entre les puits adjacents. Trois puits d’essai ont été placés dans une plaque, comme le montre la figure 2B, C, ce qui a permis la formation de limites non superposées. La motilité de l’essaimage bactérien a été favorisée avec une augmentation de la concentration d’arabinose par rapport à la concentration la plus faible, mais a été progressivement limitée avec des concentrations d’arabinose plus élevées. E. coli La souche de type sauvage K12 a été testée sur des plaques de gradient de resvératrol (figure 2C), dans la plage de concentration de 0 à 400 μM. Une restriction modeste de la motilité de l’essaimage a été observée avec une augmentation de la concentration de resvératrol. Les zones d’essaim ont été quantifiées par le logiciel ImageJ (figure supplémentaire S2). Les courbes d’essaimage affichent les réponses de concentration multiples (Figure 3).
Figure 1 : Schéma de la préparation, de l’inoculation et de l’incubation de la plaque d’essaim à gradient inducteur. (A) Croissance nocturne de la culture bactérienne à 37 °C. (B) Flux de travail de la plaque d’essaim à gradient inducteur à double couche. i) Soutenez les boîtes de Petri carrées. ii) Verser le milieu de la couche inférieure et solidifier à température ambiante. iii) Posez les boîtes de Petri carrées à plat et versez le milieu de la couche supérieure. iv) Durcissement des plaques. v) Faire des puits correspondant aux positions marquées. vi) Pipette la culture bactérienne dans les puits. vii) Enveloppez les plaques à l’aide d’un film d’étanchéité ou de ruban adhésif en caoutchouc. viii) Placer des plaques d’essaim dans un incubateur à 37 °C. C) Esquisse d’une carte des puits sur papier A4 ou modèle d’impression 3D. Trois puits avec I) trois répliques et II) deux répliques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Processus d’essaimage de surface sur des plaques de gradient inducteur. Les processus d’essaimage de surface bactérienne sont capturés à l’aide d’un système d’imagerie sur gel dans les 5 jours suivant l’inoculation. (A) Processus d’essaimage de surface induit par l’arabinose d’E. coli K12-YdeH. (B) Processus d’essaimage de surface induit par l’arabinose de P. aeruginosa PAO1-YdeH. (C) Essaimage de surface de la souche de type sauvage E. coli K12 sur plaque de gradient de resvératrol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les courbes d’essaimage de surface représentent plusieurs réponses de concentration sur des plaques de gradient inducteur. Chaque point de données quantifiable se compose de trois réplications. (A) Motilité d’essaimage induite par l’arabinose de P. aeruginosa PAO1-YdeH; les concentrations approximatives dans les puits d’essai sont de 0,17 % (p/v), 0,25 % (p/v) et 0,42 % (p/v). B) Essaimage de souche de type sauvage E. coli K12 sur une plaque d’essaim à gradient de resvératrol; les concentrations approximatives dans les puits d’essai sont de 67 μM, 200 μM et 335 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Milieu de couche supérieure/milieu de bouillon de lysogénie (par 100 mL) | ||
| Tryptone: 1 g | ||
| Chlorure de sodium : 1 g | ||
| Extrait de levure : 0,5 g | ||
| Gélose : 0,7 g | ||
| Milieu de couche inférieure/milieu contenant un inducteur (par 100 mL) | ||
| Tryptone: 1 g | Concentration de travail: | Concentration de la solution mère : |
| Chlorure de sodium : 1 g | ||
| Extrait de levure : 0,5 g | - Resvératrol : 400 μM | - Resvératrol : 100 mM |
| Gélose : 0,7 g | ||
| Inducteur: | - Arabinose : 0,5 % (p/v) | - Arabinose: 20% (w /v) |
| - Solution mère de resvératrol : 400 μL | ou 1 % (p/v) | |
| - Solution mère d’arabinose : 2,5 mL ou 5 mL | ||
Tableau 1 : Spécifications des milieux d’essaim à double couche.
Figure supplémentaire S1: Modèles d’impression 3D de couvercle de plaque d’essaim. (A) 3 x 3 puits, dont trois puits et trois répliques. (B) 3 x 2 puits dont trois puits et deux répliques. (C) Fabriquez des puits avec des modèles d’impression 3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Quantification de la surface de l’essaim à l’aide du logiciel ImageJ. (A) Ajouter des « ombres » aux images originales (Process | Ombres) pour générer des essaims quantifiables avec des limites claires. (B) Définir la barre d’échelle (Analyser | Définir l’échelle), sélectionner des essaims à l’aide des outils Wand (suivi) et exporter la zone d’essaim (Analyser | Mesure). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3: Boîte de Petri carrée soutenue pour verser le milieu de la couche inférieure. L’angle d’inclinaison est d’environ 4,3 °. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’étude de la motilité de l’essaimage bactérien sur les plaques de gradient semi-solides peut être une tâche difficile18,19,20, car elle implique de multiples facteurs tels que la viscosité du substrat, l’humidité et les composants du milieu. Parmi ces facteurs, la concentration de gélose joue un rôle décisif dans la détermination de la réversion microbienne vers la motilité de nage ou d’essaimage. Au fur et à mesure que la concentration d’agar passera de 0,3 % (p/v) à 1 % (p/v), la motilité de nage bactérienne sera restreinte et passera progressivement à l’essaimage de surface, et la concentration de gélose supérieure à 1 % (p/v) interdira à la fois la motilité de nage et d’essaimage7. La concentration d’agar a été fixée à 0,7% (p / v) sur la base d’expériences préliminaires, car elle a montré de meilleures performances que les autres concentrations.
Cette concentration de gélose a également été utilisée précédemment pour étudier la chimiotaxie microbienne21. La diminution de la concentration d’agar entraîne une plus grande zone d’essaim, accompagnée de chevauchements entre les puits adjacents, ce qui augmente la difficulté de quantifier la zone de l’essaim en raison de la démarcation peu claire des limites. Une concentration relativement élevée d’agar entraîne une petite zone d’essaim, ce qui diminue la possibilité de chevauchements. Cependant, une gélose excessive (>1,0%) peut empêcher l’essaimage bactérien de surface. Par conséquent, il est essentiel de sélectionner une concentration de gélose appropriée qui peut être appliquée à toutes les espèces d’essai pour générer des résultats comparables avec une viscosité standard.
Les puits disposés de manière isométrique offrent un espace égal et approprié pour que les bactéries essaiment. La disposition des puits peut être différente en fonction des besoins des plaques d’essaim à gradient. L’essaim de surface peut se chevaucher en raison d’une distance insuffisante entre les puits d’essai (figure 2A), ce qui entrave la quantification de la zone de l’essaim, en particulier dans une étude prolongée. Trois puits d’essai ont été placés dans une plaque d’essaim pour tester plusieurs réponses de concentration tout en empêchant le chevauchement des colonies (figure 2B, C).
Par rapport à une aiguille d’inoculation22, les puits de maintien préparés dans ces plaques semi-solides fournissent un volume d’inoculation standardisé. Des puits de rétention ont également été trouvés pour soutenir la culture bactérienne, empêchant la propagation bactérienne observée dans d’autres méthodes telles que le pipetage 23. Les puits de maintien réalisés en insérant des modèles d’impression 3D présentent des sites de départ d’inoculation plus clairs et standardisés. Bien que ces puits nécessitent une préparation supplémentaire, ils réduisent l’écart entre les points d’essai en marquant les positions d’inoculation sur le gabarit. De plus, le nombre exact de bactéries dans chaque puits de détention peut être calculé, ce qui améliore la reproductibilité des données. Par mesure de précaution, une préparation hâtive ou négligente des puits pourrait entraîner la fissuration des puits, entraînant une variation de l’essaimage de surface pendant la migration, car les microbes sont enclins à se déplacer à travers les fissures.
Il faut veiller à éviter les éclaboussures de la culture de démarrage microbien pendant la préparation du puits de chargement et du chargement de l’échantillon, en particulier dans les plaques d’essaim à faible viscosité. De plus, le volume de la culture bactérienne chargée doit être optimisé afin de minimiser le temps nécessaire aux microbes pour mettre à l’échelle les parois internes de chaque puits de rétention tout en empêchant la possibilité de déversement pendant le transport des plaques (à des fins d’imagerie). Dans ce travail, nous avons réduit le volume de charge de la culture bactérienne afin de minimiser la possibilité de déversement, ce qui entraîne un retard dans la migration bactérienne qui est souvent confondu avec le décalage de l’essaim24.
Il est nécessaire d’adapter la formulation du milieu en raison des différences de viscosité et des sources de nutriments requises entre les espèces mobiles. Pour certaines espèces (p. ex. Bacillus subtilis25), l’essaimage de surface peut être rapide; par conséquent, l’intervalle d’imagerie doit être raccourci. La quantification assistée par ordinateur de la zone d’essaim donne des informations plus précises que la mesure de distance du rayon26. Pour générer des limites claires pour le calcul de la surface de l’essaim par le logiciel ImageJ, une méthode intégrée a été utilisée dans ce protocole qui ajoute des ombres aux images originales acquises à l’aide du système d’imagerie sur gel. Si une limite de l’essaim fusionne avec celle adjacente, la migration vers la frontière sera inhibée, où ces communautés préfèrent migrer vers les zones inoccupées des plaques d’essaimage (figure 2A). Ces facteurs limitatifs résultant du chevauchement des limites représentent un défi important pour déterminer la distance migratoire de l’essaimage de surface, où ces valeurs ne peuvent pas être intégrées dans le processus d’essaimage libre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Le développement de cette technique a été soutenu par les fonds du plan national de R&D clé du ministère de la Science et de la Technologie (2018YF0902604), du Fonds de recherche de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour les jeunes scientifiques internationaux (22050410270) et des fonds externes des Instituts de technologie avancée de Shenzhen (DWKF20190001). Nous tenons à exprimer notre sincère gratitude à Mlle Chen Xinyi pour son aide dans la relecture du document et la gestion du laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P.
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
