Summary
Här beskriver vi användningen av inducerargradientplattor för att utvärdera bakteriell svärmande rörlighet samtidigt som man erhåller flera koncentrationssvar.
Abstract
Bakteriell svärmande rörlighet är en vanlig mikrobiologisk fenotyp som bakteriesamhällen använder för att migrera över halvfatta ytor. Vid undersökningar av inducerad svärmande motilitet kan det vara möjligt att specifik koncentration av en inducerare inte kan rapportera händelser som inträffar inom det optimala koncentrationsområdet för att framkalla de önskade svaren från en art. Halvfacitplattor innehållande flera koncentrationer används vanligen för att undersöka responsen inom ett inducerarkoncentrationsområde. Separata halvfasta plattor ökar emellertid variationerna i medelviskositet och fuktinnehåll inom varje platta på grund av ojämn stelningstid.
Detta dokument beskriver en enstegsmetod för att samtidigt testa ytans svärmande rörlighet på en enda gradientplatta, där de isometriskt anordnade testbrunnarna möjliggör samtidig förvärv av multikoncentrationssvar. I det aktuella arbetet utvärderades ytsvärmningen av Escherichia coli K12 och Pseudomonas aeruginosa PAO1 som svar på en koncentrationsgradient av inducerare såsom resveratrol och arabinos. Periodiskt avbildades svärmmorfologierna med hjälp av ett bildsystem för att fånga hela ytsvärmningsprocessen.
Den kvantitativa mätningen av svärmmorfologierna förvärvades med hjälp av ImageJ-programvaran, vilket gav analyserbar information om svärmområdet. Denna uppsats presenterar en enkel gradient swarm plate metod som ger kvalitativ och kvantitativ information om inducerarnas effekter på ytsvärmning, som kan utvidgas för att studera effekterna av andra inducerare på ett bredare spektrum av rörliga bakteriearter.
Introduction
Bakteriell svärmande motilitet avser den kollektiva migrationen av bakterieceller över ytan av ett ämne. Förutom halvfafa agarplattor speciellt framställda i laboratoriet1 observeras denna fenotyp också på vissa mjuka substrat såsom djurvävnader2, hydratiserade ytor3 och växtrötter4. Medan en halvfast yta anses vara en av de grundläggande förutsättningarna för bakteriell svärmning, kräver vissa arter också ett energirikt medium för att stödja deras svärmande rörlighet5. Flagellarotationskrafter både simning och svärmande motilitetssimning beskriver den encelliga rörligheten i en flytande miljö, medan svärmning är den synkrona rörelsen hos en mikrobiell population över halvfatta ytor.
Substratviskositet påverkar bakteriell motilitet; Studier av patogena mikrober, såsom Helicobacter pylori, har visat att patogenens rörlighet förändras beroende på mucinskiktets viskositet, vilket påverkas av miljöförsurning i den mänskliga värden6. För att replikera dessa miljöer begränsar tidigare studier med agarkoncentration över 0,3% (w / v) bakteriell simningsmotilitet för att åstadkomma en gradvis övergång till ytsvärmning. Användningen av agarkoncentration över 1 % (w/v) förhindrar svärmande rörlighet hos många arter7. Kolonimönstren som bildas på ytan är olika, inklusive funktionslös matta8, tjuröga9, dendriter10 och virvel11.
Även om relevansen av sådana mönster fortfarande är oklar verkar dessa mönster vara beroende av miljömässiga och kemiska signaler12. Miljösignaler täcker olika aspekter, inklusive temperatur, salthalt, ljus och pH, medan kemiska signaler inkluderar närvaron av mikrobiella kvorumavkänningsmolekyler, biokemiska biprodukter och näringsämnen. Autoinducerares kvorumavkännande signalmolekyler såsom AHL (N-hexanoyl-L homoserinlakton) kan påverka ytsvärmningen genom att reglera produktionen av ytaktivt medel13,14. Resveratrol, en fytoalexinförening, kan begränsa bakteriell svärmande rörlighet15.
I det aktuella arbetet undersöker vi effekten av gradientkoncentrationer av resveratrol på vildtyp Escherichia coli K12-stam och undersöker arabinosinducerbar svärmande motilitet hos konstruerade E. coli K12-YdeH och Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-arter. Produktionen av YdeH-enzymet induceras av arabinos via araBAD-promotorn, vilket resulterar i cellulär c-di-GMP-störning och påverkar bakteriell svärmande motilitet16,17. Detta inducerbara svärmningsbeteende studeras med användning av arabinosgradientsvärmplattor med E. coli K12-YdeH och P. aeruginosa PAO1-YdeH-stammar.
Gradientsvärmplattorna framställs genom successivt stelnande dubbelskiktsmedium (figur 1B). Bottenskiktet består av mediet tillsatt med induceraren, hälld på ena sidan av en uppspänd petriskål. Vid stelningen av bottenskiktet återförs petriskålen till en plan yta, där det övre skiktet innehållande mediet utan induceraren tillsätts från andra sidan plattan. Efter att svärmplattorna har stelnat helt produceras isometriskt anordnade hållbrunnar genom uppborrningshål på svärmplattorna efter en fast layout (figur 1C) eller genom att brunnarna präglas med hjälp av en 3D-printad modell av plattkåpan som innehåller pinnar under medelhärdningsprocessen (tilläggsfigur S1). Ett gelarvbildningssystem används för att fånga de svärmande morfologierna vid olika tidpunkter (figur 2). Analys av ytsvärmning med hjälp av ImageJ-programvara (kompletterande figur S2) ger kvantitativa resultat av ytsvärmningsprocessen (figur 3).
Således föreslår vi en enkel metod för att testa ytsvärmande rörlighet inom ett koncentrationsområde av inducerare. Denna metod kan användas för att testa flera koncentrationssvar från andra inducerare genom att blanda induceraren i bottenskiktets medium och kan appliceras på andra rörliga arter (t.ex. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Detta tillvägagångssätt kan ge tillförlitliga kvalitativa och kvantitativa resultat för screening av en enda kemisk inducerare, och separata plattor kan användas för att utvärdera fler kemiska inducerare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av gradientsvärmplattor
- Framställning av svärmmedium
OBS: Se diskussionsavsnittet för en kort jämförelse av olika medelviskositeter; 0,7% (w/v) agarkoncentration av svärmmedium användes i detta protokoll.- Förbered lysogenbuljongpulver (LB) med agar i två koniska kolvar; varje kolv innehåller 2 g trypton, 2 g natriumklorid, 1 g jästextrakt och 1,4 g agar. Tillsätt dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och rör om suspensionen med en magnetisk omrörningsstång. Justera den slutliga volymen till 200 ml genom att lägga till ytterligare ddH2O.
- Autoklavera lösningen vid 121 °C i 20 min. Använd ett luftgenomsläppligt lock eller flasktätningsfilm med en luftventil.
OBS: Agar kommer att lösas upp vid uppvärmning i autoklaven. - När temperaturen sjunker till 65 °C, blanda lösningen för att säkerställa homogenitet och överför mediet till en 65 °C inkubator eller vattenbad för kortvarig användning.
- Framställning av svärmmedium i bottenskiktet
OBS: Bottenskiktsmediet är blandningen av svärmmedium och inducerarslagslösningar. Formuleringen av inducerande gradientsvärmplattor visas i tabell 1.- Bered en 100 mM resveratrol stamlösning genom att lösa upp 114,12 mg lyofiliserat resveratrolpulver i 5 ml dimetylsulfoxid (DMSO) och förvara lösningen vid -20 °C.
- Bereda en 20 % (w/v) arabinoss stamlösning genom att lösa upp 6 g arabinospulver i 30 ml ddH2O; vänta i 10-15 minuter för att låta arabinosen lösas upp; och förvara lösningen vid rumstemperatur.
- Ta ut mediet från inkubatorn på 65 °C och placera det vid rumstemperatur. låt svärmmediet svalna tills Erlenmeyerkolven är tillräckligt sval för att hålla (~ 50 ° C). Placera inte svärmmediet vid rumstemperatur under långa perioder, eftersom detta kommer att orsaka stelning av agar.
- Tillsätt den erforderliga volymen av inducerarsallösningen till svärmmediet vid 50 °C (tabell 1). Använd en pipett för att avge inducerarlösningen istället för att hälla den. Virvla försiktigt för att blanda induceraren med svärmmediet.
OBS: Det här steget är för inducerare som inte kan autoklaveras. Var försiktig så att du inte introducerar bubblor i mediet.
- Framställning av dubbelskiktiga gradientsvärmplattor
OBS: Det övre lagrets medium är LB-medium innehållande 0,7% (w/v) agar.- Märk 13 x 13 cm fyrkantiga petriskålar med inducerarnamn och stammar och stötta diskarna upp över lockkanten (figur 1B).
- Tillsätt 40 ml varmt bottenskiktsmedium (50 °C) med en 50 ml pipett eller ett 50 ml centrifugrör.
OBS: Alternativt, för 13 x 13 cm fyrkantiga petriskålar, är 40 ml bottenskikt och övre lager medium lämpligt; för 10 x 10 cm kvadratiska petriskålar är 25 ml bottenskikt och övre lager medium lämpligt. - Låt bottenskiktets medium härda utan lock i 1 timme inuti en laminär flödeshuva. Stör inte fyrkantiga petriskålar medan mediet stelnar.
OBS: Vid härdning av bottenskiktet bör svärmmedium som inte innehåller inducerare bibehållas i en 65 °C inkubator eller ett vattenbad. - När bottenskiktet är helt stelnat, ta bort locken och lägg de fyrkantiga petriskålarna inuti en laminär flödeshuva.
- Tillsätt 40 ml varmt övre lagermedium (50 ° C) med en 50 ml pipett eller 50 ml centrifugrör.
OBS: Det övre lagrets medium innehåller inte inducerare. - Härda dubbelskiktsplattorna på bänkskivan täckt och ostörd i 1 timme. Förvara de förberedda plattorna vid 4 °C i upp till 24 timmar.
OBS: Längre härdningstider skulle minska fuktinnehållet och begränsa svärmande rörlighet.
2. Tillväxt av E. coli K12 och P. aeruginosa PAO1
- Förbered 500 ml LB-medium genom att tillsätta 5 g trypton, 5 g NaCl och 2,5 g jästextrakt i ddH2O och fyll på lösningen till 500 ml. Autoklavera lösningen på vätskecykeln i 20 minuter vid 121 °C och förvara den vid 4 °C.
- Förbered 100 ml 1,5% (w/v) LB-agarmedium genom att tillsätta 1 g trypton, 1 g NaCl, 0,5 g jästextrakt och 1,5 g agar i ddH2O och fyll på lösningen till 100 ml. Autoklavera lösningen på vätskecykeln i 20 min vid 121 °C. Överför mediet till ett 50 °C vattenbad för att förhindra att agaren stelnar.
- När LB-agar mediumkolven är bekväm att hålla, tillsätt 20 ml LB-agar medium i en petriskål (10 cm i diameter) med en 25 ml pipett. Låt plattan stå i rumstemperatur över natten och förvara LB-agarplattan vid 4 °C.
- Ta lagerkulturer lagrade vid -80 ° C, streck E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 och P. aeruginosa PAO1-YdeH stammar på LB-agar Petri-rätter med engångsinokuleringsslingor. Inkubera petriskålarna inverterade över natten vid 37 ° C.
- Välj enskilda kolonier för olika stammar från petriskålarna, inokulera varje koloni i 5 ml LB-medium och inkubera kulturen vid 37 ° C i en laboratorieorbitalskakare inställd på 220 rpm.
- När odlingstätheten når OD600nm ~ 1,0, ta bort kulturen från shakern och placera den vid rumstemperatur. Justera odlingstätheten till OD600nm = 1,0, enligt beskrivningen i steg 3.2.1.
3. Inokulering och inkubation av gradientsvärmplattor
- Framställning av ympningsbrunnar
OBS: 3D-utskriftsomslagsmodeller som kan generera brunnar åtskilda av ett standardavstånd kan användas istället för den metod som beskrivs nedan (kompletterande figur S1).- Markera brunnspositionerna på A4-papper som visas i figur 1C. Ställ in tre testkoncentrationer i en fyrkantig petriskål med två eller tre repliker.
- Placera det märkta A4-papperet under en stelnad övertoningsplatta. Tryck in den bredare sidan av en 100 μL pipettspets i den halvfasetterade mediumytan vid det markerade läget. Tryck på pipettspetsen tills den når botten av det övre lagret.
- När spetsen rör vid botten, applicera ingen vertikal kraft på spetsen; rotera försiktigt spetsen för att isolera innehållet i den cylindriska brunnen.
- Flytta pipettspetsarna horisontellt längs ett mycket litet avstånd för att tillåta luftflöde till den smala platsen som är avsatt. Tryck på spetsen med pekfingret för att blockera gasflödet inuti spetsen medan du håller pipetten med tummen och långfingret.
- Dra ut spetsen vertikalt och håll brunnsinnehållet i spetsen medan du drar ut den.
OBS: Om brunnsinnehållet glider, applicera något mer tryck med pekfingret för att helt försegla spetsen. - Upprepa steg 3.1.2 till 3.1.5 i varje markerad position. Täck svärmplattan före ympning.
- Gradientplatta ympning och inkubation
- Justera tillväxtodlingstätheten över natten till OD600nm = 1,0.
- Pipettera 80 μL av tillväxtkulturen över natten i varje brunn. Spill inte bakteriekulturen utanför brunnarna.
- Vik in plattorna med tätningsfilm. För långvarig observation (3-5 dagar), linda plattorna med sterilt laboratoriegummitejp.
OBS: Gummitejp är mindre benägna att gå sönder. - Placera en bägare fylld med ddH2O i inkubatorn för att bibehålla fuktigheten inuti inkubatorn. Inkubera gradientsvärmeplattorna vid 37 °C.
OBS: Inkubera inte svärmplattorna upp och ner; detta kommer att orsaka att bakteriekulturen läcker från brunnarna. - Föreställ dig svärmplattan omedelbart efter ympning och registrera detta som 0 h-tidpunkten .
4. Avbildning av bakteriell ytsvärmning
- Ta ut svärmplattorna, en i taget, från inkubatorn var 12: e timme, håll plattan horisontellt och placera dem i gelarvbildningssystemet (se materialtabellen).
OBS: Lämna inte fingeravtryck på plattans yta; håll sidan av svärmplattan med rena handskar. - Välj gelavbildningsläge ; utsätta svärmplattan för vitt ljus; och justera brännvidden för att ge den tydligaste bilden av svärmar.
OBS: Använd samma brännvidd för alla plattor i en viss sats. - Förbättra svärmarnas ljusstyrka för tydlig observation genom att justera exponeringstiden till 300 ms. Justera tröskeln för att minimera störningar från bakgrundsljuset.
OBS: Tröskeln justeras på gelavbildningssystemets arbetsgränssnitt. Öka värdena till vänster för att minimera störningar från bakgrundsljus; minska värdena till höger för att förbättra svärmarnas ljusstyrka. I detta protokoll är regionen vanligtvis mellan 6 000 och 50 000. - Spara bildfilen för vidare analys. Registrera bildtid, inducerartyp, gradientorientering och stammar i en .txt fil.
5. Kvantifiera svärmområdet med Hjälp av ImageJ-programvaran
- Importera bildfilen som förvärvats med gelarvbildningssystemet.
- Ställ in skalningsfältet med ImageJ-programvaran och tillämpa den på alla bilder.
- Skapa ett linjesegment som markerar längden på tavlan genom att klicka på linjeverktyget.
- Klicka på Analysera | Ställ in Skala för att öppna fönstret Ange skala .
- Ange den faktiska längden i Känt avstånd och Längdenhet.
OBS: Eftersom 13 x 13 cm fyrkantiga petriskålar användes i detta arbete är den faktiska längden '130' och längdenheten är 'mm'. - Markera rutan Global .
- Infoga en skalningsfält genom att klicka på Analysera | Verktyg | Skala stapel, skriv Bredd i mm, Höjd i pixlar, Teckenstorlek och välj Färg, Bakgrund och Plats i rullgardinsmenyn. Alternativt kan du välja Fet text, Dölj text, Serif-teckensnitt och Överlägg genom att markera kryssrutorna.
OBS: Valet av dessa parametrar bestäms av användarna och egenskaperna hos bilderna. I det här protokollet var Bredd i mm inställd på 25, Höjd i pixlar till 20, Teckenstorlek till 80 och skalningsfältet placerades i det nedre högra hörnet genom att välja Plats | Nedre höger. Andra parametrar kan väljas av användaren.
- Klicka på Bearbeta | Skuggor för att förbättra bildens skärpa, särskilt gränserna (kompletterande figur S2A). Klicka på Bearbeta | Batch för att bearbeta bilder.
OBS: Syftet med detta steg är att ge en mer exakt gränsavgränsning.- Bearbeta en bild som referens genom att klicka på Bearbeta | Skuggor | Söderut.
- Klicka på Bearbeta | Sats | Makro för att öppna fönstret Batchprocess . Leta efter följande kommandon som visas i fönstret:
run("Södra");
run("Spara");
nära(); - Skriv mappadressen för originalbilderna och utdatafilens adress genom att klicka på Bearbeta i fönstret Batchprocess .
OBS: Det rekommenderas att exportera bilder med skuggor till en annan mapp och behålla en kopia av originalbilderna.
- Använd verktyget Wand (spårning) för att välja svärmar individuellt och justera toleransen (dubbelklicka på Verktyget Wand (tracing) tills den genererade linjen passar svärmgränsen korrekt (kompletterande figur S2B).
OBS: Klicka först på Wand (spårning) verktyg och välj en svärm på en bild. Om gränserna inte har avbildats korrekt dubbelklickar du på verktyget Wand (tracing) för att öppna Wand Tool-fönstren , där toleransen kan justeras. - Klicka på Analysera | Mät för att exportera areavärdet.
- Upprepa steg 5.1.1-5.1.5 tills alla svärmar har mätts, spara resultaten i en .csv fil för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflödet som består av beredning av gradientsvärmplattor, ympning och inkubation visas i figur 1B. För att generera gradientsvadplattor hälls bottenskiktets medium i uppspända diskar vid ~ 4,3 ° från horisontalplanet (kompletterande figur S3), följt av att hälla det övre skiktmediet efter att bottenskiktet har stelnat helt. Sammansättningen av dubbelskiktsmediet visas i tabell 1. Därefter pipetteras bakterieodling över natten i testbrunnarna och inkuberas vid 37 °C, med bibehållen fuktighetsnivå. Flera testkoncentrationer ställs in i en gradientsvärmplatta med två eller tre replikat (figur 1C). Alternativet för en 3D-utskriftsmodell av locklocket med det pelarföra utsprånget på testpunkterna visas i tilläggsfigur S1.
Två konstruerade arter, E. coli K12-YdeH och P. aeruginosa PAO1-YdeH, testades på arabinosgradientplattor. Figur 2A visar ytsvärmningsprocessen i fem brunnar, med överlappning mellan intilliggande brunnar. Tre testbrunnar sattes i en platta, som visas i figur 2B,C, vilket möjliggjorde bildandet av icke-överlappande gränser. Bakteriell svärmande rörlighet främjades med en ökning av arabinoskoncentrationen från den lägsta koncentrationen men begränsades gradvis med högre arabinoskoncentrationer. E. coli K12 vildtypsstam testades på resveratrolgradientplattor (figur 2C), inom koncentrationsområdet 0-400 μM. En blygsam begränsning av svärmande motilitet observerades med ökande resveratrolkoncentration. Svärmområden kvantifierades av ImageJ-programvaran (kompletterande figur S2). Svärmningskurvorna visar de flera koncentrationssvaren (figur 3).
Figur 1: Schematisk över inducerargradient svärmplattberedning, ympning och inkubation. (A) Tillväxt över natten av bakteriekultur vid 37 ° C. (B) Arbetsflöde av dubbelskiktsinduceringsgradient svärmplatta. i) Stötta upp fyrkantiga petriskålar. ii) Häll bottenskiktet medium och stelna vid rumstemperatur. iii) Lägg de fyrkantiga petriskålarna platt och häll det övre lagret. iv) Härdning av plattor. v) Gör brunnar som motsvarar de markerade positionerna. vi) Pipettbakteriekultur i brunnar. vii) Vik in plattor med tätningsfilm eller gummitejp. viii) Placera svärmplattor i en 37 °C inkubator. C) Skisskarta över brunnar på A4-papper eller 3D-utskriftsmodell. Tre brunnar med I) tre replikat och II) två replikat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ytsvärmningsprocesser på inducerargradientplattor. Bakteriella ytsvärmningsprocesser fångas med hjälp av ett gelarvbildningssystem inom 5 dagar efter ympning. (A) Arabinosinducerad ytsvärmningsprocess av E. coli K12-YdeH. (B) Arabinosinducerad ytsvärmningsprocess av P. aeruginosa PAO1-YdeH. (C) Ytsvärmningsprocess av vildtyp E. coli K12 på resveratrolgradientplattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ytsvärmande kurvor representerar flera koncentrationssvar på inducerargradientplattor. Varje kvantifierbar datapunkt består av tre replikat. (A) Arabinosinducerad svärmande motilitet av P. aeruginosa PAO1-YdeH; ungefärliga koncentrationer inom testbrunnar är 0,17% (w/v), 0,25% (w/v) och 0,42% (w/v). B) E. coli K12 vildtypsstam som svärmar på svärmplattan med resveratrolgradient. ungefärliga koncentrationer inom testbrunnar är 67 μM, 200 μM och 335 μM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Övre lager medium / lysogen buljong medium (per 100 ml) | ||
| Trypton: 1 g | ||
| Natriumklorid: 1 g | ||
| Jästextrakt: 0,5 g | ||
| Agar: 0,7 g | ||
| Bottenskikt medium/inducerarinnehållande medium (per 100 ml) | ||
| Trypton: 1 g | Arbetskoncentration: | Koncentration av stamlösning: |
| Natriumklorid: 1 g | ||
| Jästextrakt: 0,5 g | Resveratrol: 400 μM | Resveratrol: 100 mM |
| Agar: 0,7 g | ||
| Inducerare: | - Arabinos: 0,5% (v) | - Arabinos: 20% (v) |
| - Resveratrol stamlösning: 400 μL | eller 1 % (w/v) | |
| - Arabinos stamlösning: 2,5 ml eller 5 ml | ||
Tabell 1: Specifikationer för svärmmedium med dubbla lager.
Kompletterande figur S1: 3D-utskriftsmodeller av svärmplåtslock. (A) 3 x 3 brunnar inklusive tre brunnar och tre replikat. (B) 3 x 2 brunnar inklusive tre brunnar och två replikat. (C) Gör brunnar med 3D-utskriftsmodeller. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Kvantifiering av ytsvärmarea med hjälp av ImageJ-programvaran. (A) Lägg till "skuggor" till originalbilder (Process | Skuggor) för att generera kvantifierbara svärmar med tydliga gränser. (B) Ställ in skalstång (Analysera | Ställ in skala), välj svärmar med hjälp av Wand (tracing) Tools och exportera svärmområde (Analysera | Mät). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur S3: Stöttad fyrkantig petriskål för hällning av bottenskiktsmedium. Lutningsvinkeln är ~ 4,3 °. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersökning av bakteriell svärmande rörlighet på halvfatta gradientplattor kan vara en utmanande uppgift18,19,20, eftersom det involverar flera faktorer såsom substratviskositet, fuktighet och medelstora komponenter. Bland dessa faktorer spelar agarkoncentrationen en avgörande roll för att bestämma mikrobiell återgång till antingen simning eller svärmande rörlighet. När agarkoncentrationen ökar från 0,3 % (w/v) till 1 % (w/v) kommer bakteriebadmotiliteten att begränsas och gradvis övergå till ytsvärmning, och agarkoncentrationen över 1 % (w/v) kommer att förbjuda både simning och svärmande rörlighet7. Agarkoncentrationen fastställdes till 0,7% (w/v) baserat på preliminära experiment, eftersom den visade bättre prestanda än andra koncentrationer.
Denna agarkoncentration användes också tidigare för att studera mikrobiell kemotaxi21. Minskad agarkoncentration resulterar i ett större svärmområde, åtföljt av överlappningar mellan intilliggande brunnar, vilket ökar svårigheten att kvantifiera svärmområdet på grund av oklar gränsdragning. Relativt hög agarkoncentration resulterar i ett litet svärmområde, vilket minskar risken för överlappningar. Överdriven agar (>1,0%) kan dock förhindra bakteriell ytsvärmning. Det är därför viktigt att välja en lämplig agarkoncentration som kan tillämpas på alla försöksarter för att generera jämförbara resultat med en standardviskositet.
Isometriskt anordnade brunnar ger lika och lämpligt utrymme för bakterier att svärma. Arrangemanget av brunnar kan vara olika beroende på behoven hos gradientsvärmplattor. Ytsvärm kan överlappa varandra på grund av otillräckligt avstånd mellan testbrunnar (figur 2A), vilket hindrar kvantifieringen av svärmområdet, särskilt i en långvarig studie. Tre testbrunnar sattes inom en svärmplatta för att testa flera koncentrationssvar samtidigt som koloniöverlappning förhindrades (figur 2B, C).
Jämfört med en inokuleringsnål22 ger hållbrunnar beredda i dessa halvfakta plattor en standardiserad ympningsvolym. Holding-wells befanns också upprätthålla bakteriekulturen, vilket förhindrade bakteriell spridning observerad i andra metoder såsom pipettering 23. Hållbrunnar som tillverkas genom att infoga 3D-utskriftsmodeller presenterar tydligare och standardiserade startplatser för ympning. Även om dessa brunnar kräver ytterligare förberedelser, minskar de avvikelsen mellan testpunkterna genom att markera ympningspositioner på mallen. Dessutom kan de exakta bakterieantalet i varje hållbrunn beräknas, vilket förbättrar reproducerbarheten av data. Som en försiktighetsåtgärd kan förhastad eller slarvig förberedelse av brunnar resultera i sprickbildning av brunnarna, vilket resulterar i variation av ytan som svärmar under migration, eftersom mikroberna är benägna att röra sig genom sprickorna.
Försiktighet måste vidtas för att undvika stänk av den mikrobiella startkulturen under beredningen av lastningsbrunnen och provbelastningen, särskilt i svärmplattor med låg viskositet. Vidare måste volymen av bakteriekulturen som laddas optimeras för att minimera den tid som krävs för att mikroberna ska kunna skala de inre väggarna i varje hållbrunn samtidigt som man förhindrar risken för spill under platttransport (för avbildningsändamål). I detta arbete minskade vi bakteriekulturens belastningsvolym för att minimera risken för spill, vilket resulterade i en fördröjning av bakteriell migration som vanligtvis misstas för svärmfördröjning24.
Det är nödvändigt att anpassa mediumformuleringen på grund av skillnaderna i viskositet och erforderliga näringskällor mellan rörliga arter. För vissa arter (t.ex. Bacillus subtilis25) kan ytsvärmningen vara snabb. Därför bör bildintervallet förkortas. Datorstödd svärmområdeskvantifiering ger mer exakt information än avståndsmätning av radie26. För att generera tydliga gränser för beräkning av svärmarea med ImageJ-programvaran användes en inbyggd metod i detta protokoll som lägger till skuggor till de ursprungliga bilderna som förvärvats med hjälp av gelarvbildningssystemet. Om en gräns för svärmen smälter samman med den intilliggande, kommer migrationen mot gränsen att hämmas, där dessa samhällen föredrar att migrera mot de obebodda områdena på svärmplattorna (Figur 2A). Dessa begränsande faktorer till följd av de överlappande gränserna utgör en betydande utmaning när det gäller att bestämma migrationsavståndet för ytsvärmningen, där dessa värden inte kan integreras i den fria svärmningsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Utvecklingen av denna teknik stöddes av medel från ministeriet för vetenskap och tekniks nationella nyckelforskningsplan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) och Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vill framföra vår uppriktiga tacksamhet till fröken Chen Xinyi för hennes hjälp med korrekturläsning av dokumentet och laboratoriehanteringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P.
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
