Summary
Her beskriver vi brugen af inducergradientplader til at evaluere bakteriel sværmningsmotilitet og samtidig opnå flere koncentrationsresponser.
Abstract
Bakteriel sværmende bevægelighed er en almindelig mikrobiologisk fænotype, som bakteriesamfund bruger til at migrere over halvfaste overflader. I undersøgelser af induceret sværmende bevægelighed kan en specifik koncentration af en inducer muligvis ikke rapportere hændelser, der forekommer inden for det optimale koncentrationsområde for at fremkalde de ønskede reaktioner fra en art. Halvfaste plader indeholdende flere koncentrationer anvendes almindeligvis til at undersøge responsen inden for et inducerkoncentrationsområde. Imidlertid øger separate halvfaste plader variationer i medium viskositet og fugtindhold i hver plade på grund af uensartet størkningstid.
Dette papir beskriver en et-trins metode til samtidig at teste overfladesværmende bevægelighed på en enkelt gradientplade, hvor de isometrisk arrangerede testbrønde muliggør samtidig erhvervelse af multikoncentrationsresponser. I det foreliggende arbejde blev overfladesværmen af Escherichia coli K12 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 evalueret som reaktion på en koncentrationsgradient af induktorer såsom resveratrol og arabinose. Med jævne mellemrum blev sværmmorfologierne afbildet ved hjælp af et billeddannelsessystem til at fange hele overfladesværmningsprocessen.
Den kvantitative måling af sværmmorfologierne blev erhvervet ved hjælp af ImageJ-software, der gav analyserbar information om sværmområdet. Dette papir præsenterer en simpel gradient sværmplademetode, der giver kvalitativ og kvantitativ information om induktorernes virkninger på overfladesværmning, som kan udvides til at studere virkningerne af andre induktorer på en bredere vifte af bevægelige bakteriearter.
Introduction
Bakteriel sværmende bevægelighed refererer til den kollektive migration af bakterieceller over overfladen af et stof. Ud over halvfaste agarplader, der er specielt fremstillet i laboratoriet1, observeres denne fænotype også på nogle bløde substrater såsom animalsk væv2, hydrerede overflader3 og planterødder4. Mens en halvfast overflade betragtes som en af de grundlæggende betingelser for bakteriesværmning, kræver nogle arter også et energirigt medium for at understøtte deres sværmende bevægelighed5. Flagella rotationskræfter både svømning og sværmende motilitetssvømning beskriver den encellede bevægelighed i et flydende miljø, mens sværmning er den synkrone bevægelse af en mikrobiel population på tværs af halvfaste overflader.
Substratviskositet påvirker bakteriel bevægelighed; undersøgelser af patogene mikrober, såsom Helicobacter pylori, har vist, at patogenets bevægelighed ændres afhængigt af mucinlagets viskositet, som påvirkes af miljøforsuring i den menneskelige vært6. For at replikere disse miljøer begrænser tidligere undersøgelser ved hjælp af agarkoncentration over 0,3% (w / v) bakteriel svømmemotilitet for at gennemføre et gradvist skift til overfladesværmning. Anvendelsen af agarkoncentration over 1 % (w/v) forhindrer sværmende bevægelighed hos mange arter7. Kolonimønstrene dannet på overfladen er forskellige, herunder funktionsløs mat8, bull's eye9, dendritter10 og hvirvel11.
Selv om relevansen af sådanne mønstre fortsat er uklar, synes disse mønstre at være afhængige af miljømæssige og kemiske signaler12. Miljømæssige signaler dækker forskellige aspekter, herunder temperatur, saltholdighed, lys og pH, mens kemiske signaler omfatter tilstedeværelsen af mikrobielle quorum sensing molekyler, biokemiske biprodukter og næringsstoffer. Autoinducer quorum sensing signalmolekyler såsom AHL (N-hexanoyl-L homoserin lacton) kan påvirke overflade sværmning ved at regulere produktionen af overfladeaktivt stof13,14. Resveratrol, en phytoalexinforbindelse, kan begrænse bakteriel sværmende bevægelighed15.
I det foreliggende arbejde undersøger vi effekten af gradientkoncentrationer af resveratrol på vildtype Escherichia coli K12 stamme og undersøger arabinose-inducerbar sværmende bevægelighed af konstruerede E. coli K12-YdeH og Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH arter. Produktionen af YdeH-enzymet induceres af arabinose via araBAD-promotoren, hvilket resulterer i cellulær c-di-GMP-forstyrrelse og påvirker bakteriesværmningsmotiliteten16,17. Denne inducerbare sværmningsadfærd studeres ved hjælp af arabinose gradient sværmplader med E. coli K12-YdeH og P. aeruginosa PAO1-YdeH stammer.
Gradientsværmpladerne fremstilles ved successivt størkning af dobbeltlagsmedium (figur 1B). Bundlaget består af mediet tilsat med induktoren, hældt på den ene side af en proppet petriskål. Ved størkning af bundlaget returneres petriskålen til en plan overflade, hvor det øverste lag, der indeholder mediet uden induktoren, tilsættes fra den anden side af pladen. Efter at sværmpladerne er fuldstændig størknet, produceres isometrisk arrangerede holdebrønde ved boring af huller på sværmpladerne efter et fast layout (figur 1C) eller ved at præge brøndene ved hjælp af en 3D-trykt model af pladedækslet, der indeholder pinde under mediumhærdningsprocessen (supplerende figur S1). Et gelbilleddannelsessystem bruges til at fange de sværmende morfologier på forskellige tidspunkter (figur 2). Analyse af overfladesværmning ved hjælp af ImageJ-software (supplerende figur S2) giver kvantitative resultater af overfladesværmningsprocessen (figur 3).
Således foreslår vi en simpel metode til at teste overfladesværmende bevægelighed inden for et koncentrationsområde af induktorer. Denne metode kan bruges til at teste flere koncentrationsresponser fra andre induktorer ved at blande induktoren i bundlagsmediet og kan anvendes på andre bevægelige arter (f.eks . Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Denne tilgang kan give pålidelige kvalitative og kvantitative resultater til screening af en enkelt kemisk induktor, og der kan anvendes separate plader til at evaluere flere kemiske induktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af gradientsværmplader
- Forberedelse af sværmmedium
BEMÆRK: Se diskussionsafsnittet for en kort sammenligning af forskellige mellemstore viskositeter; 0,7% (w/v) agarkoncentration af sværmmedium blev anvendt i denne protokol.- Forbered Lysogeny bouillon (LB) pulver med agar i to koniske kolber; hver kolbe indeholder 2 g trypton, 2 g natriumchlorid, 1 g gærekstrakt og 1,4 g agar. Tilsæt dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og rør suspensionen ved hjælp af en magnetisk omrøringsstang. Juster den endelige lydstyrke til 200 ml ved at tilføje yderligere ddH2O.
- Autoklaver opløsningen ved 121 °C i 20 min. Brug en luftgennemtrængelig hætte eller flaskeforseglingsfilm med en udluftning.
BEMÆRK: Agar opløses, når den opvarmes i autoklaven. - Når temperaturen falder til 65 °C, blandes opløsningen for at sikre homogenitet, og mellemtinget overføres til en 65 °C inkubator eller et vandbad til kortvarig brug.
- Fremstilling af bundlags sværmmedium
BEMÆRK: Bundlagsmediet er blandingen af sværmmedium og inducerstandeopløsninger. Formuleringen af induktorgradientsværmplader er vist i tabel 1.- En 100 mM resveratrol stamopløsning fremstilles ved at opløse 114,12 mg lyofiliseret resveratrolpulver i 5 ml dimethylsulfoxid (DMSO), og opløsningen opbevares ved -20 °C.
- Der fremstilles en 20 % (w/v) arabinose stamopløsning ved at opløse 6 g arabinosepulver i 30 ml ddH2O; vent i 10-15 minutter for at lade arabinosen opløses; og opbevar opløsningen ved stuetemperatur.
- Tag mediet ud af 65 °C-inkubatoren, og anbring det ved stuetemperatur; Lad sværmmediet køle af, indtil Erlenmeyer-kolben er kølig nok til at holde (~50 °C). Anbring ikke sværmmediet ved stuetemperatur i lange perioder, da dette vil medføre størkning af agar.
- Der tilsættes det krævede volumen af induktorstrumopløsningen til sværmmediet ved 50 °C (tabel 1). Brug en pipette til at dispensere induktoropløsningen i stedet for at hælde den. Hvirvl forsigtigt for at blande induktoren med sværmmediet.
BEMÆRK: Dette trin er til inducere, der ikke kan autoklaveres. Pas på ikke at indføre bobler i mediet.
- Fremstilling af dobbeltlags gradientsværmplader
BEMÆRK: Det øverste lag medium er LB medium indeholdende 0,7% (w/ v) agar.- Mærk 13 x 13 cm firkantede petriskåle med induktornavn og stammer, og støt skålene op over kanten af lågene (figur 1B).
- Tilsæt 40 ml varmt bundlagsmedium (50 °C) ved hjælp af en 50 ml pipette eller et 50 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Alternativt er 40 ml bundlag og øvre lag medium egnet til 13 x 13 cm firkantede petriskåle; til 10 x 10 cm firkantede petriskåle er 25 ml bundlag og øverste lag medium egnet. - Lad bundlagsmediet hærde utildækket i 1 time inde i en laminær flowhætte. Forstyr ikke firkantede petriskåle, mens mediet størkner.
BEMÆRK: Under hærdning af bundlaget skal sværmmedium, der ikke indeholder induktorer, opretholdes i en 65 °C inkubator eller vandbad. - Når bundlaget er størknet helt, skal du fjerne lågene og lægge de firkantede petriskåle inde i en laminær flowhætte.
- Der tilsættes 40 ml varmt overlagsmedium (50 °C) ved hjælp af en 50 ml pipette eller et 50 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Det øverste lag medium indeholder ikke induktorer. - Hærd dobbeltlagspladerne på bordpladen dækket og uforstyrret i 1 time. Opbevar de tilberedte plader ved 4 °C i op til 24 timer.
BEMÆRK: Længere hærdningstider vil reducere fugtindholdet og begrænse sværmende bevægelighed.
2. Vækst af E. coli K12 og P. aeruginosa PAO1
- Forbered 500 ml LB-medium ved at tilsætte 5 g tryptone, 5 g NaCl og 2,5 g gærekstrakt i ddH2O, og påd opløsningen til 500 ml. Opløsningen autoklaveres på flydende cyklus i 20 minutter ved 121 °C, og den opbevares ved 4 °C.
- Forbered 100 ml 1,5% (w/v) LB-agarmedium ved at tilsætte 1 g trypton, 1 g NaCl, 0,5 g gærekstrakt og 1,5 g agar i ddH2O og pås opløsningen til 100 ml. Autoklaver opløsningen på flydende cyklus i 20 minutter ved 121 °C. Overfør mediet til et vandbad på 50 °C for at forhindre, at agaren størkner.
- Når LB-agar medium kolben er behagelig at holde, tilsættes 20 ml LB-agar medium i en petriskål (10 cm i diameter) ved hjælp af en 25 ml pipette. Lad pladen stå ved stuetemperatur natten over, og opbevar LB-agarpladen ved 4 °C.
- Tag lagerkulturer opbevaret ved -80 ° C, stribe E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PAO1-YdeH stammer på LB-agar Petriskåle ved hjælp af engangsokulationssløjfer. Inkuber petriskålene omvendt natten over ved 37 °C.
- Vælg enkelte kolonier til forskellige stammer fra petriskålene, inokuler hver koloni i 5 ml LB-medium, og inkuber kulturen ved 37 ° C i en laboratorie orbital shaker sat til 220 o / min.
- Når kulturtætheden når OD600nm ~ 1,0, skal du fjerne kulturen fra rysteren og placere den ved stuetemperatur. Kulturtætheden justeres til OD600nm = 1,0 som beskrevet i trin 3.2.1.
3. Podning og inkubation af gradientsværmplader
- Fremstilling af podningsbrønde
BEMÆRK: 3D-printdæksmodeller, der er i stand til at generere brønde adskilt af en standardafstand, kan anvendes i stedet for den metode, der er beskrevet nedenfor (supplerende figur S1).- Marker brøndpositionerne på A4-papir vist i figur 1C. Sæt tre testkoncentrationer i en firkantet petriskål med to eller tre replikater.
- Anbring det markerede A4-papir under en størknet gradientplade. Skub den bredere side af en 100 μL pipettespids ind i den halvfaste mediumoverflade i den markerede position. Tryk på pipettespidsen, indtil den når bunden af det øverste lagmedium.
- Når spidsen rører bunden, skal du ikke anvende nogen lodret kraft på spidsen; Drej forsigtigt spidsen for at isolere indholdet af den cylindriske brønd.
- Flyt pipettespidserne vandret langs en meget lille afstand for at tillade luftstrøm ind i det smalle sted, der er afsat. Tryk på spidsen med pegefingeren for at blokere gasstrømmen inde i spidsen, mens du holder pipetten ved hjælp af tommelfingeren og langfingeren.
- Træk spidsen lodret ud, og hold brøndindholdet i spidsen, mens du trækker den ud.
BEMÆRK: Hvis brøndindholdet glider, skal du lægge lidt mere tryk med pegefingeren for at forsegle spidsen helt. - Gentag trin 3.1.2 til 3.1.5 i hver markeret position. Dæk sværmpladen inden podning.
- Gradientpladepodning og inkubation
- Juster den dag til dag-vækstkulturtætheden til OD600nm = 1,0.
- Pipette 80 μL af vækstkulturen natten over i hver brønd. Spild ikke bakteriekulturen uden for brøndene.
- Pak pladerne med tætningsfilm. Til langvarig observation (3-5 dage) skal du pakke pladerne med sterilt laboratoriegummibånd.
BEMÆRK: Gummitape er mindre tilbøjelig til at gå i stykker. - Placer et bægerglas fyldt med ddH2O i inkubatoren for at opretholde fugtighed inde i inkubatoren. Inkuber gradientsværmpladerne ved 37 °C.
BEMÆRK: Udred ikke sværmpladerne på hovedet; dette vil få bakteriekulturen til at lække fra brøndene. - Forestil dig sværmpladen umiddelbart efter podning, og optag dette som 0 timers tidspunkt.
4. Billeddannelse af bakteriel overflade sværmning
- Tag sværmpladerne ud, en ad gangen, fra inkubatoren hver 12. time, hold pladen vandret, og læg dem i gelbilleddannelsessystemet (se materialetabellen).
BEMÆRK: Efterlad ikke fingeraftryk på overfladen af plader; hold siden af sværmpladen med rene handsker. - Vælg gelbilleddannelsestilstand ; udsæt sværmpladen for hvidt lys; og juster brændvidden for at give det klareste udsyn til sværme.
BEMÆRK: Brug den samme brændvidde til alle plader i et givet parti. - Forbedr lysstyrken af sværmene for klar observation ved at justere eksponeringstiden til 300 ms. Juster tærsklen for at minimere interferens fra baggrundslyset.
BEMÆRK: Tærsklen justeres på gelbilleddannelsessystemets betjeningsgrænseflade. Forøg værdierne til venstre for at minimere interferens fra baggrundslys; reducere værdier til højre for at forbedre sværmens lysstyrke. I denne protokol er regionen normalt mellem 6.000 og 50.000. - Gem billedfilen til yderligere analyse. Optag billedbehandlingstid, inducertype, gradientretning og stammer i en .txt fil.
5. Kvantificer sværmområdet ved hjælp af ImageJ-software
- Importer billedfilen erhvervet ved hjælp af gelbilleddannelsessystemet.
- Indstil skalalinjen ved hjælp af ImageJ-software, og anvend den på alle billederne.
- Opret et linjesegment, der markerer længden af tavlen ved at klikke på linjeværktøjet.
- Klik på Analysér | Indstil Skaler for at åbne vinduet Indstil skalering .
- Skriv den faktiske længde i Kendt afstand og Længdeenhed.
BEMÆRK: Fordi der blev brugt 13 x 13 cm firkantede petriskåle i dette værk, er den faktiske længde '130', og længdeenheden er 'mm'. - Markér afkrydsningsfeltet Global .
- Indsæt en skaleringslinje ved at klikke på Analysér | Værktøjer | Skaler bjælke, skriv Bredde i mm, Højde i pixels, Skriftstørrelse, og vælg Farve, Baggrund og Placering i rullemenuen. Alternativt kan du vælge Fed tekst, Skjul tekst, Serif-skrifttype og Overlejring ved at markere afkrydsningsfelterne.
BEMÆRK: Valget af disse parametre bestemmes af brugerne og billedernes egenskaber. I denne protokol blev Bredde i mm indstillet til 25, Højde i pixels til 20, Skriftstørrelse til 80, og skalalinjen blev placeret i nederste højre hjørne ved at vælge Placering | Nederst til højre. Andre parametre kan vælges af brugeren.
- Klik på | Skygger for at forbedre billedets skarphed, især grænserne (supplerende figur S2A). Klik på | Batch til behandling af billeder.
BEMÆRK: Formålet med dette trin er at give en mere præcis grænseafgrænsning.- Behandl et billede som reference ved at klikke på Proces | Skygger | Sydpå.
- Klik på | Batch | Makro for at åbne vinduet Batchproces . Se efter følgende kommandoer, der vises i vinduet:
løb("Syd");
kør("Gem");
tæt på(); - Indtast mappeadressen på de originale billeder og outputfiladressen ved at klikke på Behandl i vinduet Batchproces .
BEMÆRK: Det anbefales at eksportere billeder med skygger til en anden mappe og beholde en kopi af de originale billeder.
- Brug værktøjet Wand (sporing) til at vælge sværme individuelt og justere tolerancen (dobbeltklik på Wand (tracing) -værktøjet), indtil den genererede linje passer korrekt til sværmgrænsen (supplerende figur S2B).
BEMÆRK: Klik først på Værktøjet Wand (tracing), og vælg en sværm på et billede. Hvis grænserne ikke er afbildet korrekt, skal du dobbeltklikke på værktøjet Stav (sporing) for at åbne vinduerne i Wand Tool , hvor tolerancen kan justeres. - Klik på Analysér | Mål for at eksportere arealværdien.
- Gentag trin 5.1.1-5.1.5, indtil alle sværme er målt, gem resultaterne i en .csv fil til yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsgangen bestående af fremstilling af gradientsværmplader, podning og inkubation er vist i figur 1B. For at generere gradient svømmede plader hældes bundlagsmediet i proppede tallerkener på ~ 4,3 ° fra det vandrette plan (supplerende figur S3) efterfulgt af hældning af det øverste lagmedium, efter at bundlaget er fuldstændigt størknet. Sammensætningen af dobbeltlagsmediet er vist i tabel 1. Derefter pipetteres bakteriekultur, der dyrkes natten over, i testbrøndene og inkuberes ved 37 °C, hvorved der opretholdes passende fugtighedsniveauer. Flere testkoncentrationer indstilles i en gradientsværmplade med to eller tre replikater (figur 1C). Den alternative mulighed for en 3D-printmodel af dækslåget med det søjleformede fremspring på testpunkterne er vist i supplerende figur S1.
To konstruerede arter, E. coli K12-YdeH og P. aeruginosa PAO1-YdeH, blev testet på arabinose gradientplader. Figur 2A viser overfladesværmningsprocestesten i fem brønde, hvor der forekommer overlapning mellem tilstødende brønde. Tre testbrønde blev sat i en plade, som vist i figur 2B,C, hvilket muliggjorde dannelsen af ikke-overskridende grænser. Bakteriel sværmende bevægelighed blev fremmet med en stigning i arabinosekoncentrationen fra den laveste koncentration, men blev gradvist begrænset med højere arabinosekoncentrationer. E. coli K12-vildtypestamme blev testet på resveratrolgradientplader (figur 2C) inden for koncentrationsområdet 0-400 μM. En beskeden begrænsning af sværmende bevægelighed blev observeret med stigende resveratrolkoncentration. Sværmområder blev kvantificeret af ImageJ-software (supplerende figur S2). Sværmende kurver viser de mange koncentrationsreaktioner (figur 3).
Figur 1: Skematisk oversigt over inducergradient sværmpladeforberedelse, podning og inkubation. (A) Vækst af bakteriekultur natten over ved 37 °C. (B) Arbejdsgang af dobbeltlags induktorgradient sværmplade. i) Prop op firkantede petriskåle. ii) Hæld bundlagsmedium og størkne ved stuetemperatur. iii) Læg de firkantede petriskåle fladt, og hæld det øverste lag medium. iv) Pladehærdning. v) Lav brønde svarende til de markerede positioner. vi) Pipettebakteriekultur i brønde. vii) Pak pladerne ind ved hjælp af tætningsfilm eller gummitape. viii) Anbring sværmplader i en 37 °C inkubator. C) Skitsekort over brønde på A4-papir eller 3D-printmodel. Tre brønde med I) tre replikater og II) to replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Overfladesværmningsprocesser på induktorgradientplader. Bakterielle overfladesværmningsprocesser fanges ved hjælp af et gelbilleddannelsessystem inden for 5 dage efter podning. A) Arabinose-induceret overfladesværmningsproces af E. coli K12-YdeH. (B) Arabinose induceret overflade sværmning proces af P. aeruginosa PAO1-YdeH. C) Overfladesværmningsproces af E. coli K12-vildtypestamme på resveratrolgradientpladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Overfladesværmkurver repræsenterer flere koncentrationsreaktioner på induktorgradientplader. Hvert kvantificerbart datapunkt består af tre replikater. A) Arabinose-induceret sværmende bevægelighed af P. aeruginosa PAO1-YdeH; omtrentlige koncentrationer i testbrønde er 0,17 % (w/v), 0,25 % (w/v) og 0,42 % (w/v). B) E. coli K12 vildtypestamme, der sværmer på sværm om resveratrolgradientsværmplade omtrentlige koncentrationer inden for testbrønde er 67 μM, 200 μM og 335 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Øvre lag medium / lysogent bouillonmedium (pr. 100 ml) | ||
| Tryptone: 1 g | ||
| Natriumchlorid: 1 g | ||
| Gærekstrakt: 0,5 g | ||
| Agar: 0,7 g | ||
| Bundlagsmedium/inducerholdigt medium (pr. 100 ml) | ||
| Tryptone: 1 g | Arbejdskoncentration: | Koncentration af stamopløsning: |
| Natriumchlorid: 1 g | ||
| Gærekstrakt: 0,5 g | - Resveratrol: 400 μM | - Resveratrol: 100 mM |
| Agar: 0,7 g | ||
| Induktor: | - Arabinose: 0,5% (w/v) | - Arabinose: 20% (m/v) |
| - Resveratrol stamopløsning: 400 μL | eller 1% (w/v) | |
| - Arabinose stamopløsning: 2,5 ml eller 5 ml | ||
Tabel 1: Dobbeltlags sværm medium specifikationer.
Supplerende figur S1: 3D-printmodeller af sværmpladelåg. A) 3 x 3 brønde, herunder tre brønde og tre replikater. B) 3 x 2 brønde, herunder tre brønde og to replikater. (C) Lav brønde med 3D-udskrivningsmodeller. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Kvantificering af overfladesværmareal ved hjælp af ImageJ-software. (A) Føj "skygger" til originale billeder (Proces | Skygger) for at generere kvantificerbare sværme med klare grænser. (B) Indstil skalalinje (Analysér | Indstil skala), vælg sværme ved hjælp af Wand (tracing) Tools og eksporter sværmområde (Analysér | Mål). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Proppet firkantet petriskål til hældning af bundlagsmedium. Hældningsvinklen er ~ 4,3 °. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelse af bakteriel sværmende bevægelighed på halvfaste gradientplader kan være en udfordrende opgave18,19,20, da den involverer flere faktorer såsom substratviskositet, fugtighed og mellemstore komponenter. Blandt disse faktorer spiller agarkoncentration en afgørende rolle i bestemmelsen af mikrobiel tilbagevenden til enten svømning eller sværmende bevægelighed. Da agarkoncentrationen stiger fra 0,3 % (w/v) til 1 % (w/v), vil bakteriesvømmemotiliteten blive begrænset og gradvist skifte til overfladesværmning, og agarkoncentration over 1 % (w/v) vil forbyde både svømning og sværmende bevægelighed7. Agarkoncentrationen blev fastsat til 0,7% (w/v) baseret på foreløbige forsøg, da den viste bedre ydeevne end andre koncentrationer.
Denne agarkoncentration blev også tidligere anvendt til at studere mikrobiel kemotaxis21. Nedsat agarkoncentration resulterer i et større sværmområde ledsaget af overlapninger mellem tilstødende brønde, hvilket øger vanskeligheden ved at kvantificere sværmområdet på grund af uklar grænseafgrænsning. Relativt høj agarkoncentration resulterer i et lille sværmområde, hvilket mindsker muligheden for overlapninger. Imidlertid kan overdreven agar (>1,0%) forhindre bakterieoverflade sværmning. Det er derfor vigtigt at vælge en passende agarkoncentration, der kan anvendes på alle forsøgsarter for at generere sammenlignelige resultater med en standardviskositet.
Isometrisk arrangerede brønde giver lige og passende plads til bakterier at sværme. Arrangementet af brønde kan være anderledes afhængigt af behovene hos gradientsværmplader. Overfladesværm kan overlappe hinanden på grund af utilstrækkelig afstand mellem testbrønde (figur 2A), hvilket hindrer kvantificeringen af sværmområdet, især i en langvarig undersøgelse. Tre testbrønde blev sat inden for en sværmplade for at teste flere koncentrationsresponser og samtidig forhindre kolonioverlapning (figur 2B,C).
Sammenlignet med en podningsnål22 giver holdebrønde fremstillet i disse halvfaste plader et standardiseret podningsvolumen. Holdingbrønde viste sig også at opretholde bakteriekulturen og forhindre bakteriel spredning observeret i andre metoder såsom pipettering 23. Holding-brønde lavet ved at indsætte 3D-printmodeller præsenterer klarere og standardiserede podningsstartsteder. Selvom disse brønde kræver yderligere forberedelse, reducerer de afvigelsen mellem testpunkterne ved at markere podningspositioner på skabelonen. Derudover kan de nøjagtige bakterietællinger i hver bedriftsbrønde beregnes, hvilket forbedrer reproducerbarheden af dataene. For en sikkerheds skyld kan forhastet eller skødesløs forberedelse af brønde resultere i revner i brøndene, hvilket resulterer i variation af overfladen, der sværmer under migration, da mikroberne er tilbøjelige til at bevæge sig gennem revnerne.
Der skal udvises forsigtighed for at undgå sprøjtning af den mikrobielle starterkultur under fremstillingen af lastebrønden og prøvebelastningen, især i sværmplader med lav viskositet. Endvidere skal volumenet af den belastede bakteriekultur optimeres for at minimere den tid, der er nødvendig for mikroberne til at skalere de indre vægge i hver holdebrønde, samtidig med at muligheden for spild under pladetransport (til billeddannelsesformål) forhindres. I dette arbejde reducerede vi bakteriekulturens belastningsvolumen for at minimere muligheden for spild, hvilket resulterede i en forsinkelse i bakteriemigration, der ofte forveksles med sværmlag24.
Det er nødvendigt at tilpasse mediumformuleringen på grund af forskellene i viskositet og krævede næringskilder mellem bevægelige arter. For nogle arter (f.eks. Bacillus subtilis25) kan overfladesværmning være hurtig; derfor bør billedintervallet forkortes. Computerassisteret sværmarealkvantificering giver mere præcise oplysninger end afstandsmåling af radius26. For at generere klare grænser til beregning af sværmareal ved hjælp af ImageJ-software blev der brugt en indbygget metode i denne protokol, der tilføjer skygger til de originale billeder, der er erhvervet ved hjælp af gelbilleddannelsessystemet. Hvis en grænse for sværmen smelter sammen med den tilstødende, vil migrationen mod grænsen blive hæmmet, hvor disse samfund foretrækker at migrere mod de ubesatte områder af sværmpladerne (figur 2A). Disse begrænsende faktorer som følge af de overlappende grænser udgør en betydelig udfordring med hensyn til at bestemme overfladesværmens migrationsafstand, når disse værdier ikke kan integreres i den frie sværmningsproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Udviklingen af denne teknik blev støttet af midlerne fra Ministeriet for Videnskab og Teknologis National Key R&D-plan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) og Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vil gerne tilbyde vores oprigtige taknemmelighed til frøken Chen Xinyi for hendes hjælp til korrekturlæsning af dokumentet og laboratorieledelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P.
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
