Summary
여기에서, 우리는 박테리아 떼 운동성을 평가하면서 동시에 다중 농도 반응을 얻기 위해 유도제 구배 플레이트의 사용을 설명합니다.
Abstract
박테리아 떼 운동성은 박테리아 공동체가 반고체 표면 위로 이동하기 위해 사용하는 일반적인 미생물 표현형입니다. 유도된 떼 떼 운동성에 대한 조사에서, 유도제의 특정 농도는 종으로부터 원하는 반응을 유도하기 위해 최적의 농도 범위 내에서 발생하는 사건을 보고할 수 없을 수 있다. 다중 농도를 함유하는 반고체 플레이트는 유도제 농도 범위 내에서 반응을 조사하기 위해 일반적으로 사용된다. 그러나, 분리된 반고체 플레이트는 불균일한 응고 시간으로 인해 각 플레이트 내의 중간 점도 및 수분 함량의 변화를 증가시킨다.
이 백서에서는 등각 방식으로 배열된 테스트 웰을 통해 다농도 반응을 동시에 획득할 수 있는 단일 구배 플레이트에서 표면 떼 운동성을 동시에 테스트하는 한 단계 방법을 설명합니다. 본 연구에서, 에스케리치아 콜리 K12 및 슈도모나스 aeruginosa PAO1의 표면 떼를 레스베라트롤 및 아라비노스와 같은 유도제의 농도 구배에 반응하여 평가하였다. 주기적으로, 떼 형태학은 이미징 시스템을 사용하여 전체 표면 떼 과정을 포착하기 위해 이미징되었습니다.
떼 형태학의 정량적 측정은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 획득하여 떼 영역의 분석 가능한 정보를 제공했습니다. 이 논문은 표면 떼에 대한 유도자의 효과에 대한 질적 및 양적 정보를 제공하는 간단한 구배 떼 플레이트 방법을 제시하며, 이는 더 넓은 범위의 운동성 박테리아 종에 대한 다른 유도제의 효과를 연구하기 위해 확장 될 수 있습니다.
Introduction
박테리아 떼 운동성은 물질의 표면을 가로 질러 박테리아 세포의 집단적 이동을 말합니다. 실험실1에서 특별히 제조된 반고체 한천 플레이트 외에도, 이 표현형은 동물 조직2, 수화된 표면3 및 식물 뿌리4와 같은 일부 연질 기질에서도 관찰됩니다. 반고체 표면은 박테리아 떼의 기본 조건 중 하나로 간주되지만, 일부 종은 또한 떼를 지어 운동성을 지원하기 위해 에너지가 풍부한 배지가 필요합니다5. 편모 회전은 수영과 떼를 지어 운동성 수영을 모두 할 수있는 힘은 액체 환경 내에서 단세포 운동성을 묘사하는 반면, 떼를 지어 떼를 지어 반고체 표면을 가로 지르는 미생물 집단의 동시 이동입니다.
기질 점도는 박테리아 운동성에 영향을 미친다; 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)와 같은 병원성 미생물에 대한 연구에 따르면 인간 숙주의 환경 산성화에 의해 영향을 받는 뮤신층 점도에 따라 병원균의 운동성이 변하는 것으로 나타났다6. 이러한 환경을 복제하기 위해 0.3 % (w / v) 이상의 한천 농도를 사용한 초기 연구는 박테리아 수영 운동성을 제한하여 표면 떼로 점진적으로 이동시킵니다. 한천 농도를 1%(w/v) 이상으로 사용하면 많은 종의 떼 지어지는 운동성을 예방할 수 있습니다7. 표면에 형성된 콜로니 패턴은 특징없는 mat8, 황소의 눈9, dendrites10 및 vortex11을 포함하여 다양합니다.
이러한 패턴의 관련성은 불분명하지만, 이러한 패턴은 환경 및 화학적 단서에 의존하는 것으로 보입니다12. 환경 단서는 온도, 염분, 빛 및 pH를 포함한 다양한 측면을 포괄하는 반면, 화학적 단서에는 미생물 쿼럼 감지 분자, 생화학 부산물 및 영양소의 존재가 포함됩니다. AHL(N-헥사노일-L 호모세린 락톤)과 같은 자동 유도기 정족수 감지 신호전달 분자는 계면활성제13,14의 생산을 조절함으로써 표면 떼에 영향을 줄 수 있다. 피토알렉신 화합물인 레스베라트롤은 박테리아의 떼 지어 모이는 운동성을 제한할 수 있다15.
본 연구에서는 야생형 에스케리치아 콜라이 K12 균주에 대한 레스베라트롤의 구배 농도의 영향을 조사하고 조작된 대장균 K12-YdeH 및 슈도모나스 aeruginosa PAO1-YdeH 종의 아라비노스 유도성 떼 운동성을 조사하였다. YdeH 효소의 생산은 araBAD 프로모터를 통해 아라비노스에 의해 유도되며, 이로 인해 세포 c-di-GMP 교란이 발생하고 박테리아 떼 운동성에 영향을 미친다16,17. 이 유도성 떼 거동은 대장균 K12-YdeH 및 P. aeruginosa PAO1-YdeH 균주를 갖는 아라비노스 구배 떼 플레이트를 사용하여 연구된다.
구배 떼 플레이트는 이중층 매질을 연속적으로 고형화하여 제조된다(그림 1B). 바닥층은 유도제와 함께 첨가된 배지를 포함하며, 소품이 올라간 페트리 접시의 한쪽에 부어진다. 바닥층이 응고되면 페트리 접시는 평평한 표면으로 되돌아 가며, 여기서 유도제가없는 배지를 포함하는 상층이 플레이트의 다른면에서 추가됩니다. 떼 플레이트가 완전히 응고된 후, 등각 방향으로 배열된 홀딩 웰은 고정된 레이아웃(그림 1C)에 따라 떼 플레이트에 구멍을 뚫거나 중간 경화 공정 중에 못을 포함하는 플레이트 커버의 3D 프린팅된 모델을 사용하여 웰을 각인함으로써 생성됩니다(보충 그림 S1). 겔 이미징 시스템은 서로 다른 시점에서 떼를 지어 모은 형태를 포착하는 데 사용됩니다(그림 2). ImageJ 소프트웨어를 사용한 표면 떼 분석(보충 그림 S2)은 표면 떼 공정의 정량적 결과를 제공합니다(그림 3).
따라서, 우리는 유도제의 농도 범위 내에서 표면 떼 운동성을 테스트하는 간단한 방법을 제안합니다. 이 방법은 유도제를 바닥층 배지 내로 혼합함으로써 다른 유도제의 다중 농도 반응을 시험하는데 사용될 수 있고, 다른 운동성 종 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 엔테리카, 프로테우스 미라빌리스, 예르시니아 엔테로콜리티카)에 적용될 수 있다. 이 접근법은 단일 화학 유도제를 스크리닝하기 위한 신뢰할 수 있는 정성적 및 정량적 결과를 제공할 수 있고, 더 많은 화학적 유도제를 평가하기 위해 별도의 플레이트를 사용할 수 있다.
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Protocol
1. 그라디언트 떼 플레이트의 제조
- 떼 배지의 제조
참고: 다른 중간 점도의 간략한 비교를 위해 토론 섹션을 참조하십시오. 0.7% (w/v) 아가 떼 배지의 한천 농도가 이 프로토콜에 사용되었다.- 두 개의 원뿔형 플라스크에 한천으로 Lysogeny 국물 (LB) 분말을 준비하십시오. 각 플라스크에는 트립톤 2g, 염화나트륨 2g, 효모 추출물 1g 및 한천 1.4g이 들어 있습니다. 이중 증류수 (ddH2O)를 첨가하고 자석 교반 막대를 사용하여 현탁액을 저어줍니다. 추가 ddH2O를 추가하여 최종 부피를 200 mL로 조정하십시오.
- 용액을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다. 공기 투과성 캡 또는 병 밀봉 필름을 공기 통풍구와 함께 사용하십시오.
참고 : 한천은 오토클레이브에서 가열하면 용해됩니다. - 온도가 65°C로 떨어지면, 균질성을 보장하기 위해 용액을 혼합하고, 배지를 65°C 인큐베이터 또는 수조로 옮겨 단기 사용을 위해 한다.
- 바닥층 떼 매질의 제조
참고: 바닥층 배지는 떼 배지와 유도제 원액의 혼합물입니다. 유도제 구배 떼 플레이트의 제형을 표 1에 나타내었다.- 동결건조된 레스베라트롤 분말 114.12 mg을 디메틸설폭사이드(DMSO) 5 mL에 용해시켜 100 mM 레스베라트롤 원액을 제조하고, 이 용액을 -20°C에서 보관하였다.
- 6g의 아라비노스 분말을 ddH2O 30mL에 용해시켜 20%(w/v) 아라비노스 원액을 준비하고; 아라비노스가 용해 될 수 있도록 10-15 분 동안 기다리십시오. 용액을 실온에서 보관하십시오.
- 배지를 65°C 인큐베이터에서 꺼내어 실온에서 놓고; 삼각플라스크가 충분히 차가워질 때까지 떼 배지를 식히십시오 (~ 50 °C). 떼 배지를 실온에서 오랜 기간 동안 두지 마십시오.이 경우 한천이 응고됩니다.
- 필요한 부피의 유도제 원액을 50°C에서 떼 배지에 첨가한다(표 1). 피펫을 사용하여 유도제 용액을 붓는 대신 분배하십시오. 부드럽게 소용돌이 치며 유도제를 떼 배지와 혼합하십시오.
참고: 이 단계는 오토클레이브할 수 없는 유도제를 위한 것입니다. 매체에 거품이 생기지 않도록 주의하십시오.
- 이중층 구배 떼 플레이트의 제조
참고: 상층 배지는 0.7%(w/v) 한천을 함유하는 LB 배지이다.- 유도기 이름과 변형이 있는 13 x 13cm 정사각형 페트리 접시에 라벨을 붙이고 뚜껑 가장자리 위에 접시를 올려 놓습니다(그림 1B).
- 50 mL 피펫 또는 50 mL 원심분리 튜브를 사용하여 40 mL 가온 바닥층 배지 (50°C)를 첨가한다.
참고: 또는 13 x 13cm 정사각형 페트리 접시의 경우 40mL 바닥 및 상층 배지가 적합합니다. 10 x 10cm 정사각형 페트리 접시의 경우 25mL 바닥 레이어 및 상층 매체가 적합합니다. - 바닥층 매체가 층류 후드 내부에서 1 시간 동안 덮이지 않은 채로 경화되도록하십시오. 매체가 굳어지는 동안 사각형 페트리 요리를 방해하지 마십시오.
참고: 바닥층을 경화시키는 동안, 유도제를 함유하지 않는 떼 배지는 65°C 인큐베이터 또는 수조에서 유지되어야 한다. - 바닥층이 완전히 굳어지면 뚜껑을 제거하고 사각형 페트리 접시를 층류 후드 안에 놓습니다.
- 50 mL 피펫 또는 50 mL 원심분리 튜브를 사용하여 40 mL의 따뜻한 상층 배지 (50°C)를 첨가한다.
참고: 상층 매질은 유도제를 함유하지 않는다. - 벤치 탑의 이중층 플레이트를 덮고 1 시간 동안 방해받지 않고 치료하십시오. 제조된 플레이트를 최대 24시간 동안 4°C에서 보관한다.
참고 : 경화 시간이 길면 수분 함량이 감소하고 떼지어 운동성이 제한됩니다.
2. 대장균 K12와 P. aeruginosa PAO1의 성장
- 트립톤 5g, NaCl 5g, 효모 추출물 2.5g을 ddH2O에 첨가하여 LB 배지 500 mL를 준비하고, 용액 500 mL를 충전하였다. 용액을 121°C에서 20분 동안 액체 사이클에 오토클레이브하고, 이를 4°C에서 저장한다.
- 트립톤 1g, NaCl 1g, 효모 추출물 0.5g, 한천 1.5g을 ddH2O에 첨가하여 1.5%(w/v) LB-한천 배지 100mL를 준비하고 용액 100mL를 충전한다. 용액을 121°C에서 20분 동안 액체 사이클에 오토클레이브한다. 배지를 50°C 수조로 옮겨 한천이 응고되는 것을 방지한다.
- LB-agar 배지 플라스크가 편안하게 유지될 때, 25 mL 피펫을 사용하여 페트리 접시(직경 10cm)에 LB-아가 배지 20 mL를 첨가한다. 플레이트를 실온에서 밤새 방치하고, LB-아가 플레이트를 4°C에서 저장한다.
- 일회용 접종 루프를 사용하여 LB-agar 페트리 접시에 - 80°C, 줄무늬 대장균 K12, 대장균 K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1, 및 P. aeruginosa PAO1-YdeH 균주에 보관된 스톡 배양물을 취한다. 37°C에서 하룻밤 동안 반전된 페트리 접시를 인큐베이션한다.
- 페트리 접시로부터 상이한 균주에 대한 단일 콜로니를 선택하고, 각 콜로니를 5 mL의 LB 배지에 접종하고, 배양물을 220 rpm으로 설정된 실험실 오비탈 진탕기에서 37°C에서 인큐베이션한다.
- 배양 밀도가 OD600nm ∼1.0에 도달하면, 진탕기에서 배양물을 제거하고 실온에서 놓는다. 단계 3.2.1에 기재된 바와 같이 배양 밀도를 OD600nm = 1.0으로 조정한다.
3. 구배 떼 플레이트의 접종 및 배양
- 접종 웰의 제조
참고: 표준 거리로 분리된 웰을 생성할 수 있는 3D 프린팅 커버 모델은 아래에 설명된 방법 대신 사용할 수 있습니다(보충 그림 S1).- 그림 1C에 표시된 A4 용지에 우물 위치를 표시하십시오. 두 개 또는 세 번의 반복실험으로 하나의 사각형 페트리 접시에 세 개의 시험 농도를 설정합니다.
- 표시된 A4 용지를 응고된 그라디언트 플레이트 아래에 놓습니다. 100 μL 피펫 팁의 더 넓은 면을 표시된 위치의 반고체 매질 표면으로 밀어 넣습니다. 피펫 팁이 상층 매체의 바닥에 도달할 때까지 누릅니다.
- 팁이 바닥에 닿으면 팁에 수직 힘을 가하지 마십시오. 팁을 부드럽게 돌려 원통형의 함량을 잘 분리하십시오.
- 피펫 팁을 매우 작은 거리를 따라 수평으로 움직여 공기 흐름이 옆으로 떨어진 좁은 곳으로 흐르도록하십시오. 엄지 손가락과 가운데 손가락을 사용하여 피펫을 잡고 팁 내부의 가스 흐름을 차단하려면 검지 손가락으로 팁을 누릅니다.
- 팁을 세로로 당겨 팁의 내용물을 유지하면서도 밖으로 당깁니다.
참고: 우물 내용물이 미끄러지면 집게 손가락으로 약간 더 압력을 가하여 팁을 완전히 밀봉하십시오. - 표시된 모든 위치에서 3.1.2~3.1.5단계를 반복합니다. 예방 접종 전에 떼 접시를 덮으십시오.
- 구배 플레이트 접종 및 배양
- 밤새 성장 배양 밀도를 OD600nm = 1.0 으로 조정한다.
- 80 μL의 피펫을 모든 웰 내로 밤새 성장 배양하였다. 박테리아 배양물을 우물 밖으로 흘리지 마십시오.
- 플레이트를 씰링 필름으로 감싸십시오. 장기 관찰 (3-5 일)을 위해 멸균 실험실 고무 테이프로 플레이트를 감싸십시오.
참고: 고무 테이프는 파손될 가능성이 적습니다. - ddH2O로 채워진 비커를 인큐베이터에 배치하여 인큐베이터 내부의 습도를 유지하십시오. 구배 떼 플레이트를 37°C에서 인큐베이션한다.
참고 : 떼 접시를 거꾸로 배양하지 마십시오. 이로 인해 박테리아 배양물이 우물에서 누출됩니다. - 접종 직후에 떼 접시를 이미지화하고, 이것을 0 h 시점으로 기록한다.
4. 박테리아 표면 떼 이미징
- 12시간마다 인큐베이터에서 떼 플레이트를 한 번에 하나씩 꺼내 플레이트를 수평으로 잡고 젤 이미징 시스템에 배치 합니다(재료 표 참조).
참고 : 플레이트 표면에 지문을 남기지 마십시오. 깨끗한 장갑으로 떼 접시의 측면을 잡으십시오. - 젤 이미징 모드를 선택; 떼 판을 백색광에 노출시킵니다. 초점 거리를 조정하여 떼를 가장 명확하게 볼 수 있습니다.
참고: 주어진 배치의 모든 플레이트에 대해 동일한 초점 거리를 사용하십시오. - 노출 시간을 300ms로 조정하여 명확한 관찰을 위해 떼의 밝기를 향상시킵니다. 임계값을 조정하여 배경광으로부터의 간섭을 최소화합니다.
주: 임계값은 겔 이미징 시스템의 작동 인터페이스에서 조정됩니다. 배경광으로부터의 간섭을 최소화하기 위해 왼쪽의 값을 증가시킨다; 떼의 밝기를 향상시키기 위해 오른쪽의 값을 줄입니다. 이 프로토콜에서 지역은 일반적으로 6,000에서 50,000 사이입니다. - 추가 분석을 위해 이미지 파일을 저장합니다. 이미징 시간, 유도기 유형, 그라디언트 방향 및 변형을 .txt 파일에 기록합니다.
5. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 떼 영역을 정량화하십시오.
- 젤 이미징 시스템을 사용하여 획득한 이미지 파일을 가져옵니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 배율 표시줄을 설정하고 모든 이미지에 적용합니다.
- 선 도구를 클릭하여 보드의 길이를 표시하는 선 세그먼트를 만듭니다.
- | 분석을 클릭합니다. 배율을 설정하여 배율 설정 창을 엽니다.
- 알려진 거리 와 길이 단위에 실제 길이를 입력합니다.
참고 :이 작업에는 13 x 13cm 정사각형 페트리 접시가 사용되었으므로 실제 길이는 '130'이고 길이 단위는 'mm'입니다. - 전역 상자를 선택합니다.
- | 분석을 클릭하여 배율 표시줄 삽입 도구 | 막대 크기를 조정하고 너비(mm), 높이(픽셀 단위), 글꼴 크기를 입력하고 드롭다운 메뉴에서 색상, 배경 및 위치를 선택합니다. 또는 확인란을 선택하여 굵게 표시된 텍스트, 텍스트 숨기기, 세리프 글꼴 및 오버레이 를 선택합니다.
참고: 이러한 매개 변수의 선택은 사용자와 이미지의 속성에 따라 결정됩니다. 이 프로토콜 에서 너비(mm) 는 25로, 높이는 픽셀 단위로 20으로, 글꼴 크기는 80으로 설정되었으며, 위치 |를 선택하여 눈금 막대를 오른쪽 아래 모서리에 배치했습니다. 오른쪽 아래. 다른 파라미터들은 사용자에 의해 선택될 수 있다.
- 프로세스 |를 클릭합니다. 그림자는 이미지의 선명도, 특히 경계선을 향상시킨다(보충 도 S2A). 프로세스 |를 클릭합니다. 이미지를 처리하기 위한 배치입니다.
참고: 이 단계의 목적은 보다 정확한 경계 경계를 제공하는 것입니다.- 프로세스 |를 클릭하여 이미지를 참조로 처리 그림자 | 남쪽.
- 프로세스 |를 클릭합니다. 배치 | 매크로 를 사용하여 배치 프로세스 창을 엽니다. 창에 표시된 다음 명령을 찾습니다.
실행 ( "남쪽");
실행 ( "저장");
닫기 (); - 배치 프로세스 창에서 프로세스를 클릭하여 원본 이미지의 폴더 주소와 출력 파일 주소를 입력합니다.
참고: 그림자가 있는 이미지를 다른 폴더로 내보내고 원본 이미지의 복사본을 유지하는 것이 좋습니다.
- 지팡이(추적) 도구를 사용하여 떼를 개별적으로 선택하고 생성된 선이 떼 경계에 올바르게 맞을 때까지 공차를 조정(지팡이(추적) 도구)을 조정합니다(그림 S2B 보충).
참고: 먼저 지팡이(추적) 도구를 클릭하고 한 이미지에서 떼를 선택합니다. 경계가 올바르게 표시되지 않은 경우 Wand(추적) 도구를 두 번 클릭하여 공차를 조정할 수 있는 Wand 도구 창을 엽니다. - | 분석을 클릭하십시오. 영역 값을 내보내도록 측정합니다.
- 모든 떼가 측정될 때까지 5.1.1-5.1.5단계를 반복하고 추가 분석을 위해 결과를 .csv 파일에 저장합니다.
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Representative Results
구배 떼 플레이트의 준비, 예방 접종 및 배양으로 구성된 워크 플로우는 그림 1B에 나와 있습니다. 경사 수영 플레이트를 생성하기 위해, 바닥 층 매체를 수평면으로부터 ~4.3°로 프로핑된 접시에 붓고(보충 그림 S3), 바닥층이 완전히 응고된 후에 상층 매체를 부어준다. 이중층 매질의 조성은 표 1에 나타내었다. 이어서, 하룻밤 동안 배양된 박테리아 배양물은 시험 웰 내로 피펫팅되고, 37°C에서 인큐베이션되고, 적절한 수준의 습도를 유지한다. 여러 시험 농도는 두 개 또는 세 번의 반복실험이 있는 하나의 구배 떼 플레이트에 설정됩니다(그림 1C). 테스트 지점에 기둥 모양의 돌출부가 있는 덮개 뚜껑의 3D 인쇄 모델의 대체 옵션은 보충 그림 S1에 나와 있습니다.
두 개의 조작된 종인 대장균 K12-YdeH와 P. aeruginosa PAO1-YdeH를 아라비노스 구배 플레이트에서 시험하였다. 도 2A는 인접한 웰들 사이에서 중첩이 발생하는 다섯 개의 웰에서의 표면 떼 공정 시험을 보여준다. 세 개의 테스트 웰이 그림 2B,C에 표시된 것처럼 한 플레이트에 설정되었으며, 이는 겹치지 않는 경계의 형성을 가능하게 하였다. 박테리아 떼 운동성은 가장 낮은 농도에서 아라비노스 농도의 증가와 함께 촉진되었지만 더 높은 아라비노스 농도로 점차 제한되었다. 대장균 K12 야생형 균주를 레스베라트롤 구배 플레이트 상에서 시험하였고 (도 2C), 0-400 μM의 농도 범위 내에서. 레스베라트롤 농도가 증가함에 따라 떼지어 운동성의 겸손한 제한이 관찰되었습니다. 떼 영역은 ImageJ 소프트웨어에 의해 정량화되었다(보충 그림 S2). 떼 지어 오는 곡선은 여러 농도 반응을 표시합니다(그림 3).
도 1: 유도제 구배 떼 플레이트 준비, 접종 및 배양의 개략도. (A) 37°C에서 박테리아 배양의 밤새 성장. (B) 이중층 유도제 구배 떼 플레이트의 워크플로우. i) 정사각형 페트리 요리를 소품. ii) 바닥층 매체를 붓고 실온에서 응고시킨다. iii) 사각형 페트리 접시를 평평하게 놓고 상층 매체를 부어 넣으십시오. iv) 플레이트 경화. v) 표시된 위치에 해당하는 우물을 만듭니다. vi) 우물로 피펫 박테리아 배양. vii) 씰링 필름 또는 고무 테이프를 사용하여 플레이트를 랩하십시오. viii) 떼 플레이트를 37°C 인큐베이터에 놓는다. C) A4 종이 또는 3D 인쇄 모델에 우물의 스케치지도. I) 세 번의 반복실험과 II) 두 번의 반복실험이 있는 세 개의 웰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유도기 구배 플레이트의 표면 떼 공정. 박테리아 표면 떼 과정은 접종 후 5 일 이내에 젤 이미징 시스템을 사용하여 캡처됩니다. (A) 아라비노스 유도 표면 떼 처리 과정인 대장균 K12-YdeH. (b) 아라비노오스 유도 표면 떼 처리 P. aeruginosa PAO1-YdeH. (c) 레스베라트롤 구배 플레이트 상의 대장균 K12 야생형 균주의 표면 떼 처리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 표면 떼 곡선은 유도기 구배 플레이트에 대한 다중 농도 반응을 나타냅니다. 정량화 가능한 모든 데이터 요소는 세 번의 반복실험으로 구성됩니다. (a) 아라비노오스-유도된 P. aeruginosa PAO1-YdeH의 떼 모성; 테스트 웰 내의 대략적인 농도는 0.17%(w/v), 0.25%(w/v) 및 0.42%(w/v)입니다. (b) 레스베라트롤 구배 떼 플레이트 상에 떼를 지어 있는 대장균 K12 야생형 균주; 테스트 웰 내의 대략적인 농도는 67μM, 200μM 및 335μM입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 상층 배지/리소제니 육즙 배지(100 mL 당) | ||
| 트립톤: 1 g | ||
| 염화나트륨:1 g | ||
| 효모 추출물:0.5 g | ||
| 한천:0.7 g | ||
| 바닥층 매체/유도제 함유 배지(100mL당) | ||
| 트립톤: 1 g | 작업 집중: | 원액 농도: |
| 염화나트륨:1 g | ||
| 효모 추출물:0.5 g | - 레스베라트롤: 400 μM | - 레스베라트롤: 100 mM |
| 한천:0.7 g | ||
| 유도자: | - 아라비노오스: 0.5% (승 / v) | - 아라비노오스: 20% (승 / v) |
| - 레스베라트롤 원액: 400 μL | 또는 1% (승 / v) | |
| - 아라비노스 원액: 2.5 mL 또는 5 mL | ||
표 1: 더블 레이어 떼 매체 사양.
보충 그림 S1 : 떼 플레이트 뚜껑의 3D 인쇄 모델. (A) 3개의 웰과 3개의 반복실험을 포함하는 3 x 3개의 웰. (B) 3개의 웰과 2개의 반복실험을 포함하는 3 x 2개의 웰. (C) 3D 인쇄 모델로 우물을 만듭니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: ImageJ 소프트웨어를 사용하여 표면 떼 영역의 정량화. (A) 원본 이미지에 '그림자' 추가(프로세스 | 그림자)를 사용하여 명확한 경계를 가진 정량화 가능한 떼를 생성합니다. (B) 스케일 바 설정(분석 | 배율 설정), 지팡이(추적) 도구를 사용하여 떼를 선택하고 떼 영역을 내보내고(| 분석) 측정). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3 : 바닥 층 매체를 붓기위한 사각형 페트리 접시. 경사각은 ~ 4.3 °입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
반고체 구배 플레이트에서 박테리아 떼 운동성에 대한 조사는 기판 점도, 습도 및 중간 성분과 같은 여러 요인을 포함하기 때문에 어려운 작업이 될 수 있습니다.18,19,20. 이러한 요인 중에서 한천 농도는 수영이나 떼 지어 운동성으로의 미생물 역전을 결정하는 데 결정적인 역할을합니다. 한천 농도가 0.3 % (w / v)에서 1 % (w / v)로 증가함에 따라 박테리아 수영 운동성이 제한되고 점차적으로 표면 떼로 이동하며 1 % (w / v) 이상의 한천 농도는 수영과 떼 지어 운동성을 모두 금지합니다7. 한천 농도는 다른 농도보다 더 나은 성능을 보였기 때문에 예비 실험을 기반으로 0.7 % (w / v)로 고정되었습니다.
이 한천 농도는 또한 이전에 미생물 화학주성을 연구하기 위해 사용되었다21. 한천 농도가 감소하면 인접한 웰 간의 겹침과 함께 더 큰 떼 면적이 생겨 경계 경계가 불분명하여 떼 면적을 정량화하기가 어려워집니다. 상대적으로 높은 한천 농도는 작은 떼 면적을 초래하여 겹침의 가능성을 줄입니다. 그러나 과도한 한천 (>1.0 %)은 박테리아 표면이 떼지어지는 것을 막을 수 있습니다. 따라서, 표준 점도로 비교 가능한 결과를 생성하기 위해 모든 시험 종에 적용될 수 있는 적절한 한천 농도를 선택하는 것이 필수적이다.
등각 적으로 배열 된 우물은 박테리아가 떼를 지어 갈 수있는 동등하고 적절한 공간을 제공합니다. 우물의 배열은 그라디언트 떼 플레이트의 필요에 따라 다를 수 있습니다. 표면 떼는 테스트 웰 사이의 거리가 불충분하기 때문에 겹칠 수 있으며(그림 2A), 특히 장기간의 연구에서 떼 영역의 정량화를 방해합니다. 콜로니 겹침을 방지하면서 여러 농도 반응을 테스트하기 위해 하나의 떼 플레이트 내에 세 개의 테스트 웰을 설정하였다(그림 2B,C).
접종 바늘(22)과 비교하여, 이들 반고체 플레이트에서 제조된 홀딩-웰은 표준화된 접종 부피를 제공한다. 홀딩-웰은 또한 박테리아 배양물을 유지시켜 피펫팅 23과 같은 다른 방법에서 관찰되는 박테리아 확산을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 3D 인쇄 모델을 삽입하여 만든 홀딩 웰은 더 명확하고 표준화된 접종 시작 부위를 제공합니다. 이러한 웰은 추가 준비가 필요하지만 템플릿에 접종 위치를 표시하여 테스트 지점 간의 편차를 줄입니다. 또한, 각 홀딩 웰의 정확한 박테리아 카운트를 계산할 수 있어 데이터의 재현성이 향상됩니다. 예방 조치로서, 우물의 성급하거나 부주의 한 준비는 우물의 균열을 초래할 수 있으며, 미생물이 균열을 통해 이동하는 경향이 있기 때문에 이동 중에 떼를 지어 표면이 변형 될 수 있습니다.
로딩 웰 및 샘플 로딩, 특히 저점도 떼 플레이트에서 로딩을 준비하는 동안 미생물 스타터 배양물이 튀지 않도록 주의해야 한다. 또한, 로딩된 박테리아 배양물의 부피는 미생물이 플레이트 수송 동안 유출의 가능성을 방지하면서 (이미징 목적으로) 각각의 홀딩 웰의 내벽을 스케일링하는 데 필요한 시간을 최소화하도록 최적화되어야 한다. 이 연구에서, 우리는 유출의 가능성을 최소화하기 위해 박테리아 배양 로딩량을 줄였으며, 이로 인해 일반적으로 떼 지연으로 오인되는 박테리아 이동이 지연되었습니다.24.
점도의 차이와 운동성 종 사이의 필요한 영양 공급원으로 인해 배지 제형을 적응시킬 필요가 있습니다. 일부 종 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스25)의 경우, 표면 떼가 급속할 수 있고; 따라서 이미징 간격을 줄여야합니다. 컴퓨터 지원 떼 영역 정량화는 반지름26의 거리 측정보다 더 정확한 정보를 제공합니다. ImageJ 소프트웨어로 떼 면적을 계산하기 위한 명확한 경계를 생성하기 위해 이 프로토콜에는 젤 이미징 시스템을 사용하여 획득한 원본 이미지에 그림자를 추가하는 기본 제공 방법이 사용되었습니다. 떼의 경계가 인접한 경계와 합쳐지면 경계로의 이동이 금지되며, 여기서 이러한 커뮤니티는 떼를 지어 놓은 판의 비어있는 지역으로 이동하는 것을 선호합니다 (그림 2A). 겹치는 경계로 인한 이러한 제한 요인은 표면 떼의 철새 거리를 결정하는 데 중요한 도전 과제를 제시하며, 여기서 이러한 값은 자유 떼 공정에 통합 될 수 없습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 기술의 개발은 과학 기술부의 국가 핵심 R & D 계획 (2018YF0902604), 국제 젊은 과학자를위한 중국 연구 기금 (22050410270)의 국립 자연 과학 재단 및 심천 첨단 기술 연구소 외부 기금 (DWKF20190001)의 기금으로 지원되었습니다. 우리는 문서 교정 및 실험실 관리에 도움을 주신 Chen Xinyi 양에게 진심으로 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
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