Summary
هنا ، نصف استخدام لوحات التدرج المحفزة لتقييم حركة الاحتشاد البكتيري مع الحصول في نفس الوقت على استجابات تركيز متعددة.
Abstract
حركة الاحتشاد البكتيري هي نمط ظاهري ميكروبيولوجي شائع تستخدمه المجتمعات البكتيرية للهجرة فوق الأسطح شبه الصلبة. في التحقيقات المتعلقة بحركية السرب المستحثة ، قد لا يتمكن التركيز المحدد للمحفز من الإبلاغ عن الأحداث التي تحدث ضمن نطاق التركيز الأمثل للحصول على الاستجابات المطلوبة من الأنواع. تستخدم الصفائح شبه الصلبة التي تحتوي على تركيزات متعددة بشكل شائع للتحقيق في الاستجابة داخل نطاق تركيز المحرض. ومع ذلك ، فإن الألواح شبه الصلبة المنفصلة تزيد من الاختلافات في اللزوجة المتوسطة ومحتوى الرطوبة داخل كل لوحة بسبب وقت التصلب غير المنتظم.
تصف هذه الورقة طريقة من خطوة واحدة لاختبار حركة الاحتشاد السطحي في وقت واحد على لوحة تدرج واحدة ، حيث تسمح آبار الاختبار المرتبة بشكل متساوي القياس بالاكتساب المتزامن للاستجابات متعددة التركيزات. في هذا العمل ، تم تقييم الاحتشاد السطحي للإشريكية القولونية K12 و Pseudomonas aeruginosa PAO1 استجابة لتدرج تركيز المحفزات مثل ريسفيراترول وأرابينوز. بشكل دوري ، تم تصوير مورفولوجيات السرب باستخدام نظام تصوير لالتقاط عملية احتشاد السطح بأكملها.
تم الحصول على القياس الكمي لمورفولوجيا السرب باستخدام برنامج ImageJ ، مما يوفر معلومات قابلة للتحليل لمنطقة السرب. تقدم هذه الورقة طريقة بسيطة لصفيحة سرب التدرج توفر معلومات نوعية وكمية حول تأثيرات المحفزات على الحشود السطحية ، والتي يمكن توسيعها لدراسة آثار المحفزات الأخرى على مجموعة أوسع من الأنواع البكتيرية المتحركة.
Introduction
تشير حركية الاحتشاد البكتيري إلى الهجرة الجماعية للخلايا البكتيرية عبر سطح المادة. بالإضافة إلى ألواح الأجار شبه الصلبة المعدة خصيصا في المختبر1، لوحظ هذا النمط الظاهري أيضا على بعض الركائز الرخوة مثل الأنسجة الحيوانية2 والأسطح المائية3 وجذور النباتات4. في حين يعتبر السطح شبه الصلب أحد الشروط الأساسية لاحتشاد البكتيريا، فإن بعض الأنواع تتطلب أيضا وسيطا غنيا بالطاقة لدعم حركتها الكثيفة5. يعمل دوران السوط على كل من السباحة والسباحة الحركية - تصف السباحة الحركة أحادية الخلية داخل بيئة سائلة ، في حين أن السرب هو الحركة المتزامنة لمجموعة ميكروبية عبر الأسطح شبه الصلبة.
لزوجة الركيزة تؤثر على الحركة البكتيرية. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على الميكروبات المسببة للأمراض، مثل هيليكوباكتر بيلوري، أن حركية العامل الممرض تتغير اعتمادا على لزوجة طبقة الميوسين، التي تتأثر بالتحمض البيئي في المضيف البشري6. لتكرار هذه البيئات ، فإن الدراسات السابقة التي استخدمت تركيز أجار أعلى من 0.3٪ (ث / v) تقيد حركة السباحة البكتيرية لإحداث تحول تدريجي في الاحتشاد السطحي. إن استخدام تركيز الأجار فوق 1٪ (ث / ف) يمنع حركة الاحتشاد للعديد من الأنواع 7. أنماط المستعمرة التي تشكلت على السطح متنوعة ، بما في ذلك mat8 عديمة الميزات ، عين الثور 9 ، التشعبات 10 ، والدوامة11.
وعلى الرغم من أن أهمية هذه الأنماط لا تزال غير واضحة، يبدو أن هذه الأنماط تعتمد على الإشارات البيئية والكيميائية12. تغطي الإشارات البيئية جوانب مختلفة ، بما في ذلك درجة الحرارة والملوحة والضوء ودرجة الحموضة ، في حين تشمل الإشارات الكيميائية وجود جزيئات استشعار النصاب الميكروبي ، والمنتجات الثانوية الكيميائية الحيوية ، والمواد المغذية. يمكن أن تؤثر جزيئات إشارات استشعار النصاب الذاتي مثل AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) على الحشود السطحية من خلال تنظيم إنتاج الفاعل بالسطح13,14. ريسفيراترول ، وهو مركب فيتواليكسين ، يمكن أن يحد من حركة الاحتشاد البكتيري 15.
في هذا العمل ، نقوم بالتحقيق في تأثير تركيزات التدرج من ريسفيراترول على سلالة الإشريكية القولونية K12 من النوع البري ونحقق في حركية السرب المستحثة بأرابينوز لأنواع E. coli K12-YdeH و Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. يتم تحفيز إنتاج إنزيم YdeH بواسطة arabinose عبر مروج araBAD ، مما يؤدي إلى اضطراب c-di-GMP الخلوي ويؤثر على حركية الاحتشاد البكتيري 16,17. تتم دراسة سلوك الاحتشاد المستحث هذا باستخدام ألواح سرب التدرج أرابينوز مع سلالات E. coli K12-YdeH و P. aeruginosa PAO1-YdeH.
يتم تحضير ألواح السرب المتدرجة عن طريق تصلب وسط مزدوج الطبقة على التوالي (الشكل 1B). تتكون الطبقة السفلية من الوسط المضاف مع المحفز ، ويسكب على جانب واحد من طبق بتري مدعوم. عند تصلب الطبقة السفلية ، يتم إرجاع طبق بتري إلى سطح مستو ، حيث تتم إضافة الطبقة العليا التي تحتوي على الوسط بدون المحفز من الجانب الآخر من اللوحة. بعد أن يتم تصلب ألواح السرب بالكامل ، يتم إنتاج آبار الاحتفاظ المرتبة بشكل متساوي القياس عن طريق ثقوب مملة على ألواح السرب بعد تخطيط ثابت (الشكل 1C) أو عن طريق طباعة الآبار باستخدام نموذج مطبوع ثلاثي الأبعاد لغطاء اللوحة يحتوي على أوتاد أثناء عملية المعالجة المتوسطة (الشكل التكميلي S1). يستخدم نظام التصوير الهلامي لالتقاط مورفولوجيات السرب في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 2). يوفر تحليل الاحتشاد السطحي باستخدام برنامج ImageJ (الشكل التكميلي S2) نتائج كمية لعملية الاحتشاد السطحي (الشكل 3).
وبالتالي ، نقترح طريقة بسيطة لاختبار حركة السرب السطحي داخل نطاق تركيز من المحرضات. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار استجابات تركيز متعددة للمحفزات الأخرى عن طريق خلط المحفز في وسط الطبقة السفلية ويمكن تطبيقها على الأنواع المتحركة الأخرى (على سبيل المثال ، Bacillus subtilis ، Salmonella enterica ، Proteus mirabilis ، Yersinia enterocolitica). يمكن أن يوفر هذا النهج نتائج نوعية وكمية موثوقة لفحص محفز كيميائي واحد ، ويمكن استخدام لوحات منفصلة لتقييم المزيد من المحفزات الكيميائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد لوحات سرب التدرج
- إعداد وسط سرب
ملاحظة: انظر قسم المناقشة للحصول على مقارنة موجزة بين مختلف اللزوجة المتوسطة؛ تم استخدام 0.7٪ (ث / v) تركيز أجار من وسط السرب في هذا البروتوكول.- تحضير مسحوق مرق Lysogeny (LB) مع أجار في قارورتين مخروطيتين ؛ تحتوي كل قارورة على 2 غرام من التربتون ، و 2 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 1 غرام من مستخلص الخميرة ، و 1.4 غرام من الأجار. أضف الماء المقطر المزدوج (ddH2O) وحرك التعليق باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. اضبط مستوى الصوت النهائي إلى 200 مل عن طريق إضافة ddH2O إضافي.
- قم بتعقيم المحلول عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم غطاء منفذا للهواء أو فيلم مانع لتسرب الزجاجة مع فتحة تهوية.
ملاحظة: سوف يذوب Agar عند تسخينه في الأوتوكلاف. - عندما تنخفض درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية ، امزج المحلول لضمان التجانس ، وانقل الوسط إلى حاضنة 65 درجة مئوية أو حمام مائي للاستخدام على المدى القصير.
- إعداد وسط سرب الطبقة السفلية
ملاحظة: وسط الطبقة السفلية هو مزيج من وسط السرب وحلول الأسهم المحرضات. ويبين الجدول 1 صياغة ألواح سرب التدرج المحفزة.- قم بإعداد محلول مخزون ريسفيراترول 100 مللي متر عن طريق إذابة 114.12 ملغ من مسحوق ريسفيراترول المجفف بالتجميد في 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وتخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
- تحضير محلول مخزون أرابينوز بنسبة 20٪ (ث / v) عن طريق إذابة 6 غرام من مسحوق أرابينوز في 30 مل من ddH2O ؛ انتظر لمدة 10-15 دقيقة للسماح للأرابينوز بالذوبان ؛ وتخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
- أخرج الوسط من الحاضنة 65 درجة مئوية وضعه في درجة حرارة الغرفة ؛ اترك وسط السرب ليبرد حتى تبرد قارورة Erlenmeyer بما يكفي للاحتفاظ بها (~ 50 درجة مئوية). لا تضع وسط السرب في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة ، لأن هذا سيؤدي إلى تصلب الأجار.
- أضف الحجم المطلوب من محلول مخزون المحفز إلى وسط السرب عند 50 درجة مئوية (الجدول 1). استخدم ماصة لتوزيع محلول المحفز بدلا من سكبه. تدور بلطف لخلط المحفز مع وسط السرب.
ملاحظة: هذه الخطوة مخصصة للمحفزات التي لا يمكن تعقيمها. احرص على عدم إدخال فقاعات في الوسط.
- إعداد لوحات سرب متدرجة مزدوجة الطبقة
ملاحظة: وسط الطبقة العليا هو وسط LB يحتوي على 0.7٪ (ث / v) أجار.- ضع علامة على أطباق بتري مربعة مقاس 13 × 13 سم مع اسم المحفز والسلالات ، وادعم الأطباق على حافة الأغطية (الشكل 1B).
- أضف 40 مل من الطبقة السفلية الدافئة المتوسطة (50 درجة مئوية) باستخدام ماصة سعة 50 مل أو أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، بالنسبة لأطباق بتري مربعة 13 × 13 سم ، فإن الطبقة السفلية 40 مل والطبقة العليا المتوسطة مناسبة. لأطباق بتري مربعة 10 × 10 سم ، الطبقة السفلية 25 مل والطبقة العليا المتوسطة مناسبة. - اسمح لوسط الطبقة السفلية بالمعالجة المكشوفة لمدة 1 ساعة داخل غطاء التدفق الرقائقي. لا تزعج أطباق بتري المربعة بينما يتصلب الوسط.
ملاحظة: أثناء معالجة الطبقة السفلية ، يجب الحفاظ على وسط السرب الذي لا يحتوي على محفزات في حاضنة 65 درجة مئوية أو حمام مائي. - بمجرد تصلب الطبقة السفلية بالكامل ، قم بإزالة الأغطية ووضع أطباق بتري المربعة داخل غطاء تدفق صفائحي.
- أضف 40 مل من وسط الطبقة العليا الدافئ (50 درجة مئوية) باستخدام ماصة سعة 50 مل أو أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
ملاحظة: لا يحتوي وسط الطبقة العليا على محفزات. - علاج لوحات الطبقة المزدوجة على سطح الطاولة مغطاة وغير منزعجة لمدة 1 ساعة. قم بتخزين الألواح المعدة على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
ملاحظة: أوقات المعالجة الأطول من شأنها أن تقلل من محتوى الرطوبة وتقيد حركة الاحتشاد.
2. نمو E. coli K12 و P. aeruginosa PAO1
- تحضير 500 مل من الوسط LB عن طريق إضافة 5 غرام من التربتون ، 5 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 2.5 غرام من مستخلص الخميرة إلى ddH2O ، وزيادة المحلول إلى 500 مل. قم بتعقيم المحلول على دورة سائلة لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.
- تحضير 100 مل من 1.5٪ (ث / v) LB-agar المتوسطة عن طريق إضافة 1 غرام من التربتون ، 1 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.5 غرام من مستخلص الخميرة ، و 1.5 غرام من أجار في ddH2O وتعبئة المحلول إلى 100 مل. قم بتعقيم المحلول على دورة سائلة لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية. انقل الوسط إلى حمام مائي 50 درجة مئوية لمنع الأجار من التصلب.
- عندما تكون قارورة LB-agar المتوسطة مريحة للحمل ، أضف 20 مل من وسط LB-agar إلى طبق Petri (قطره 10 سم) باستخدام ماصة 25 مل. اترك اللوحة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل ، وقم بتخزين لوحة LB-agar عند 4 درجات مئوية.
- خذ مزارع المخزون المخزنة عند -80 درجة مئوية ، وسلالات E. coli K12 ، و E. coli K12-YdeH ، و P. aeruginosa PAO1 ، و P. aeruginosa PAO1-YdeH على أطباق LB-agar Petri باستخدام حلقات التلقيح التي يمكن التخلص منها. احتضن أطباق بتري المقلوبة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
- اختر مستعمرات مفردة لسلالات مختلفة من أطباق بتري ، وقم بتلقيح كل مستعمرة في 5 مل من وسط LB ، واحتضن الثقافة عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري مختبري يبلغ 220 دورة في الدقيقة.
- عندما تصل كثافة الثقافة إلى OD600nm ~ 1.0 ، قم بإزالة الثقافة من الخلاط وضعها في درجة حرارة الغرفة. اضبط كثافة الثقافة إلى OD600nm = 1.0، كما هو موضح في الخطوة 3.2.1.
3. التلقيح والحضانة من لوحات سرب التدرج
- إعداد آبار التلقيح
ملاحظة: يمكن استخدام نماذج غلاف الطباعة ثلاثية الأبعاد القادرة على توليد آبار مفصولة بمسافة قياسية بدلا من الطريقة الموضحة أدناه (الشكل التكميلي S1).- ضع علامة على مواضع البئر على ورق A4 الموضح في الشكل 1C. اضبط ثلاثة تركيزات اختبار في طبق بتري مربع واحد مع اثنين أو ثلاثة تكرارات.
- ضع الورق A4 المميز تحت لوحة تدرج صلبة. ادفع الجانب الأوسع من طرف ماصة 100 ميكرولتر إلى السطح المتوسط شبه الصلب في الموضع المحدد. اضغط على طرف الماصة حتى يصل إلى الجزء السفلي من وسط الطبقة العليا.
- عندما يلمس الطرف الجزء السفلي ، لا تطبق أي قوة رأسية على الطرف ؛ قم بتدوير الطرف بلطف لعزل محتوى البئر الأسطواني.
- حرك أطراف الماصة أفقيا على طول مسافة صغيرة جدا للسماح بتدفق الهواء إلى المكان الضيق الموضوعة جانبا. اضغط على الطرف بإصبع السبابة لمنع تدفق الغاز داخل الطرف أثناء الإمساك بالماصة باستخدام الإبهام والإصبع الأوسط.
- اسحب الطرف للخارج عموديا ، مع الحفاظ على محتوى البئر في الطرف أثناء سحبه للخارج.
ملاحظة: إذا انزلق محتوى البئر ، فقم بالضغط أكثر قليلا بإصبع السبابة لإغلاق الطرف تماما. - كرر الخطوات من 3.1.2 إلى 3.1.5 في كل موضع تم وضع علامة عليه. قم بتغطية لوحة السرب قبل التلقيح.
- تلقيح الصفائح المتدرجة والحضانة
- اضبط كثافة ثقافة النمو بين عشية وضحاها على OD600nm = 1.0.
- ماصة 80 ميكرولتر من ثقافة النمو بين عشية وضحاها في كل بئر. لا تسكب الثقافة البكتيرية خارج الآبار.
- لف الألواح بفيلم ختم. للمراقبة طويلة الأجل (3-5 أيام) ، لف الألواح بشريط مطاطي مختبري معقم.
ملاحظة: الشريط المطاطي أقل عرضة للكسر. - ضع دورقا مملوءا ب ddH2O في الحاضنة للحفاظ على الرطوبة داخل الحاضنة. احتضان لوحات سرب التدرج عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لا تحتضن ألواح السرب رأسا على عقب. هذا سوف يتسبب في تسرب الثقافة البكتيرية من الآبار. - قم بتصوير لوحة السرب مباشرة بعد التلقيح ، وسجل ذلك كنقطة زمنية 0 ساعة.
4. تصوير الاحتشاد السطحي البكتيري
- أخرج ألواح السرب ، واحدة تلو الأخرى ، من الحاضنة كل 12 ساعة ، مع الاحتفاظ باللوحة أفقيا ، وضعها في نظام تصوير الجل (انظر جدول المواد).
ملاحظة: لا تترك بصمات الأصابع على سطح اللوحات. عقد جانب لوحة السرب مع قفازات نظيفة. - حدد وضع التصوير الهلامي ؛ تعريض لوحة السرب للضوء الأبيض ؛ وضبط البعد البؤري لإعطاء أوضح رؤية للأسراب.
ملاحظة: استخدم نفس البعد البؤري لجميع اللوحات في دفعة معينة. - عزز سطوع الأسراب للمراقبة الواضحة عن طريق ضبط وقت التعرض إلى 300 مللي ثانية. اضبط العتبة لتقليل التداخل من ضوء الخلفية.
ملاحظة: يتم ضبط العتبة على واجهة التشغيل لنظام التصوير الهلامي. زيادة القيم على اليسار لتقليل التداخل من ضوء الخلفية ؛ تقليل القيم على اليمين لتعزيز سطوع الأسراب. في هذا البروتوكول ، عادة ما تكون المنطقة بين 6000 و 50000. - احفظ ملف الصورة لمزيد من التحليل. سجل وقت التصوير ونوع المحفز واتجاه التدرج والسلالات في ملف .txt .
5. تحديد مساحة السرب باستخدام برنامج ImageJ
- استيراد ملف الصورة الذي تم الحصول عليه باستخدام نظام التصوير الهلامي.
- اضبط شريط المقياس باستخدام برنامج ImageJ وقم بتطبيقه على جميع الصور.
- قم بإنشاء مقطع خط يحدد طول اللوحة بالنقر فوق أداة الخط.
- انقر على تحليل | قم بتعيين مقياس لفتح نافذة تعيين مقياس.
- اكتب الطول الفعلي في المسافة المعروفة ووحدة الطول.
ملاحظة: نظرا لاستخدام أطباق بتري مربعة مقاس 13 × 13 سم في هذا العمل، فإن الطول الفعلي هو "130"، ووحدة الطول هي "مم". - حدد المربع عمومي .
- إدراج شريط مقياس بالنقر فوق تحليل | أدوات | شريط القياس، اكتب العرض بالملليمتر، الارتفاع بالبكسل، حجم الخط، وحدد اللون، الخلفية، والموقع من القائمة المنسدلة. بدلا من ذلك، اختر نص غامق وإخفاء نص وخط Serif وتراكب عن طريق تحديد خانات الاختيار.
ملاحظة: يتم تحديد اختيار هذه المعلمات بواسطة المستخدمين وخصائص الصور. في هذا البروتوكول، تم تعيين العرض بالملليمتر إلى 25، والارتفاع بالبكسل إلى 20، وحجم الخط إلى 80، وتم وضع شريط المقياس في الزاوية السفلية اليسرى عن طريق تحديد الموقع | أسفل اليمين. يمكن اختيار معلمات أخرى من قبل المستخدم.
- انقر على معالجة | ظلال لتعزيز حدة الصورة، وخاصة الحدود (الشكل التكميلي S2A). انقر على معالجة | دفعة لمعالجة الصور.
ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو توفير ترسيم حدود أكثر دقة.- معالجة صورة كمرجع من خلال النقر على معالجة | | الظلال الجنوب.
- انقر على معالجة | | الدفعات ماكرو لفتح نافذة العملية الدفعية . ابحث عن الأوامر التالية المعروضة في النافذة:
تشغيل ("الجنوب") ؛
تشغيل ("حفظ") ؛
إغلاق (); - اكتب عنوان مجلد الصور الأصلية وعنوان ملف الإخراج بالنقر فوق عملية في نافذة العملية الدفعية .
ملاحظة: يوصى بتصدير الصور ذات الظلال إلى مجلد آخر والاحتفاظ بنسخة من الصور الأصلية.
- استخدم أداة العصا (التتبع) لتحديد الأسراب بشكل فردي وضبط التسامح (انقر نقرا مزدوجا فوق أداة العصا (التتبع) ) حتى يتناسب الخط الذي تم إنشاؤه مع حدود السرب بشكل صحيح (الشكل التكميلي S2B).
ملاحظة: أولا، انقر فوق أداة العصا (التتبع) وحدد سربا على صورة واحدة. إذا لم يتم تصوير الحدود بشكل صحيح، فانقر نقرا مزدوجا فوق أداة العصا (التتبع) لفتح إطارات أداة العصا ، حيث يمكن ضبط التفاوت . - انقر على تحليل | قياس لتصدير قيمة المنطقة.
- كرر الخطوات 5.1.1-5.1.5 حتى يتم قياس كافة الأسراب، احفظ النتائج في ملف .csv لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1B سير العمل الذي يتكون من إعداد ألواح سرب متدرجة ، والتلقيح ، والحضانة. لإنشاء ألواح سباحة متدرجة ، يتم سكب وسط الطبقة السفلية في أطباق مدعومة عند ~ 4.3 درجة من المستوى الأفقي (الشكل التكميلي S3) ، متبوعا بصب وسط الطبقة العليا بعد تصلب الطبقة السفلية بالكامل. ويبين الجدول 1 تكوين الوسط ذي الطبقة المزدوجة. بعد ذلك ، يتم سحب المستنبتة البكتيرية المستزرعة بين عشية وضحاها إلى آبار الاختبار وتحضينها عند 37 درجة مئوية ، مع الحفاظ على مستويات مناسبة من الرطوبة. يتم تعيين تركيزات اختبار متعددة في صفيحة سرب واحدة متدرجة مع اثنين أو ثلاثة من النسخ المتماثلة (الشكل 1C). يظهر الخيار البديل لنموذج الطباعة ثلاثية الأبعاد لغطاء الغطاء مع البروز العمودي على نقاط الاختبار في الشكل التكميلي S1.
تم اختبار نوعين هندسيين ، E. coli K12-YdeH و P. aeruginosa PAO1-YdeH ، على لوحات تدرج أرابينوز. ويبين الشكل 2 ألف اختبار عملية الاحتشاد السطحي في خمسة آبار، مع حدوث تداخل بين الآبار المجاورة. تم وضع ثلاثة آبار اختبار في لوحة واحدة ، كما هو موضح في الشكل 2B ، C ، مما مكن من تشكيل حدود غير متداخلة. تم تعزيز حركية السرب البكتيري مع زيادة في تركيز أرابينوز من أدنى تركيز ولكن تم تقييده تدريجيا بتركيزات أرابينوز أعلى. الإشريكية القولونية تم اختبار سلالة K12 من النوع البري على ألواح تدرج ريسفيراترول (الشكل 2C) ، ضمن نطاق تركيز 0-400 ميكرومتر. لوحظ وجود تقييد متواضع لحركية السرب مع زيادة تركيز ريسفيراترول. تم تحديد مناطق السرب كميا بواسطة برنامج ImageJ (الشكل التكميلي S2). تعرض منحنيات الاحتشاد استجابات التركيز المتعددة (الشكل 3).
الشكل 1: مخطط لإعداد صفيحة سرب التدرج المحرض ، والتلقيح ، والحضانة. (أ) النمو الليلي للثقافة البكتيرية عند 37 درجة مئوية. (ب) سير عمل صفيحة سرب التدرج المحرض مزدوج الطبقة. ط) دعم أطباق بتري مربعة. ب) صب الطبقة السفلية المتوسطة وتصلب في درجة حرارة الغرفة. ج) ضع أطباق بتري المربعة مسطحة ، وصب الطبقة العليا المتوسطة. د) معالجة اللوحات. v) جعل الآبار المقابلة للمواقع المحددة. vi) ثقافة بكتيرية ماصة في الآبار. سابعا) التفاف لوحات باستخدام فيلم مانع للتسرب أو شريط مطاطي. viii) ضع ألواح السرب في حاضنة 37 درجة مئوية. ج) رسم خريطة للآبار على ورق A4 أو نموذج الطباعة ثلاثية الأبعاد. ثلاثة آبار مع I) ثلاثة نسخ متماثلة و II) اثنين من النسخ المتماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عمليات الاحتشاد السطحي على ألواح التدرج المحفزة. يتم التقاط عمليات الاحتشاد السطحي البكتيري باستخدام نظام تصوير هلام في غضون 5 أيام من التلقيح. (أ) عملية الاحتشاد السطحي المستحث بالأرابينوز من E. coli K12-YdeH. (ب) عملية الاحتشاد السطحي المستحث بالأرابينوز من P. aeruginosa PAO1-YdeH. (ج) عملية الاحتشاد السطحي لسلالة E. coli K12 البرية على صفيحة تدرج ريسفيراترول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تمثل منحنيات الاحتشاد السطحي استجابات تركيز متعددة على ألواح التدرج المحرضات. تتكون كل نقطة بيانات قابلة للقياس الكمي من ثلاث نسخ متماثلة. (أ) حركية السرب الناجم عن الأرابينوز للبكتيريا P. aeruginosa PAO1-YdeH؛ التركيزات التقريبية داخل آبار الاختبار هي 0.17٪ (ث / ف) ، 0.25 ٪ (ث / ف) و 0.42 ٪ (ث / ف). (ب) سلالة E. coli K12 من النوع البري على صفيحة سرب التدرج ريسفيراترول ؛ التركيزات التقريبية داخل آبار الاختبار هي 67 ميكرومتر و 200 ميكرومتر و 335 ميكرومتر .
| الطبقة العليا متوسطة / متوسطة المرق lysogeny (لكل 100 مل) | ||
| تريبتون: 1 غرام | ||
| كلوريد الصوديوم: 1 غرام | ||
| مستخلص الخميرة: 0.5 جم | ||
| أجار: 0.7 غرام | ||
| الطبقة السفلية متوسطة / متوسطة تحتوي على محفز (لكل 100 مل) | ||
| تريبتون: 1 غرام | تركيز العمل: | تركيز محلول المخزون: |
| كلوريد الصوديوم: 1 غرام | ||
| مستخلص الخميرة: 0.5 جم | - ريسفيراترول: 400 ميكرومتر | - ريسفيراترول: 100 مللي متر |
| أجار: 0.7 غرام | ||
| المحفز: | - أرابينوز: 0.5٪ (ث / ف) | - أرابينوز: 20٪ (ث / ف) |
| - محلول مخزون ريسفيراترول: 400 ميكرولتر | أو 1٪ (ث / v) | |
| - محلول مخزون أرابينوز: 2.5 مل أو 5 مل | ||
الجدول 1: المواصفات المتوسطة لسرب مزدوج الطبقة.
الشكل التكميلي S1: نماذج الطباعة ثلاثية الأبعاد لغطاء لوحة السرب. (أ) 3 × 3 آبار بما في ذلك ثلاثة آبار وثلاثة تكرارات. (ب) 3 × 2 آبار بما في ذلك ثلاثة آبار واثنين من النسخ المتماثلة. (ج) جعل الآبار مع نماذج الطباعة 3D. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: القياس الكمي لمساحة السرب السطحي باستخدام برنامج ImageJ. (أ) إضافة "ظلال" إلى الصور الأصلية (عملية | الظلال) لتوليد أسراب قابلة للقياس الكمي بحدود واضحة. (ب) تعيين شريط المقياس (تحليل | تعيين المقياس)، وتحديد الأسراب باستخدام أدوات العصا (التتبع)، وتصدير منطقة السرب (تحليل | القياس). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: طبق بتري مربع مدعوم لصب وسط الطبقة السفلية. زاوية الميل هي ~ 4.3 درجة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يكون التحقيق في حركة الاحتشاد البكتيري على ألواح التدرج شبه الصلبة مهمة صعبة18،19،20 ، لأنها تنطوي على عوامل متعددة مثل لزوجة الركيزة والرطوبة والمكونات المتوسطة. من بين هذه العوامل ، يلعب تركيز الأجار دورا حاسما في تحديد الارتداد الميكروبي إما إلى السباحة أو حركية الاحتشاد. مع زيادة تركيز الأجار من 0.3٪ (w / v) إلى 1٪ (w / v) ، سيتم تقييد حركة السباحة البكتيرية والتحول تدريجيا إلى الاحتشاد السطحي ، وسيحظر تركيز الأجار فوق 1٪ (w / v) كل من السباحة وحركية الاحتشاد 7. تم تثبيت تركيز الأجار عند 0.7٪ (ث / ف) بناء على التجارب الأولية ، حيث أظهر أداء أفضل من التركيزات الأخرى.
كما تم استخدام تركيز الأجار هذا سابقا لدراسة التاكسي الكيميائي الميكروبي21. ويؤدي انخفاض تركيز الأجار إلى زيادة مساحة السرب، مصحوبة بتداخلات بين الآبار المجاورة، مما يزيد من صعوبة تحديد مساحة السرب بسبب عدم وضوح ترسيم الحدود. يؤدي تركيز الأجار المرتفع نسبيا إلى منطقة سرب صغيرة ، مما يقلل من إمكانية التداخل. ومع ذلك ، فإن الأجار المفرط (>1.0٪) يمكن أن يمنع احتشاد السطح البكتيري. وبالتالي ، من الضروري اختيار تركيز أجار مناسب يمكن تطبيقه على جميع أنواع الاختبار لتوليد نتائج قابلة للمقارنة بلزوجة قياسية.
توفر الآبار المرتبة بشكل متساوي القياس مساحة متساوية ومناسبة للبكتيريا للتجمع. يمكن أن يكون ترتيب الآبار مختلفا اعتمادا على احتياجات ألواح السرب المتدرجة. يمكن أن يتداخل السرب السطحي بسبب المسافة غير الكافية بين آبار الاختبار (الشكل 2 أ) ، مما يعوق تحديد كمية منطقة السرب ، خاصة في دراسة مطولة. تم وضع ثلاثة آبار اختبار داخل صفيحة سرب واحدة لاختبار استجابات تركيز متعددة مع منع تداخل المستعمرة (الشكل 2B ، C).
وبالمقارنة مع إبرة التلقيح22، توفر الآبار القابضة المحضرة في هذه الألواح شبه الصلبة حجم تلقيح موحد. كما تم العثور على آبار قابضة للحفاظ على الثقافة البكتيرية ، ومنع انتشار البكتيريا التي لوحظت في طرق أخرى مثل سحب 23. الآبار القابضة المصنوعة عن طريق إدراج نماذج الطباعة 3D تقدم مواقع بدء تلقيح أكثر وضوحا وموحدة. على الرغم من أن هذه الآبار تتطلب إعدادا إضافيا ، إلا أنها تقلل من الانحراف بين نقاط الاختبار عن طريق وضع علامات على مواقع التلقيح في القالب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن حساب الأعداد البكتيرية الدقيقة في كل بئر عقد ، مما يحسن من قابلية تكرار البيانات. وكإجراء احترازي، يمكن أن يؤدي التحضير المتسرع أو المهمل للآبار إلى تكسير الآبار، مما يؤدي إلى تباين في احتشاد السطح أثناء الهجرة، حيث تميل الميكروبات إلى التحرك عبر الشقوق.
يجب توخي الحذر لتجنب تناثر ثقافة المبتدئين الميكروبية أثناء إعداد بئر التحميل وتحميل العينات ، خاصة في ألواح السرب منخفضة اللزوجة. علاوة على ذلك ، يجب تحسين حجم المستنبتة البكتيرية المحملة لتقليل الوقت اللازم للميكروبات لتوسيع نطاق الجدران الداخلية لكل بئر عقد مع منع إمكانية الانسكاب أثناء نقل اللوحة (لأغراض التصوير). في هذا العمل، قمنا بتقليل حجم تحميل المستنبتة البكتيرية لتقليل احتمال الانسكاب، مما أدى إلى تأخير في الهجرة البكتيرية التي عادة ما يتم الخلط بينها وبين تأخر السرب24.
من الضروري تكييف التركيبة المتوسطة بسبب الاختلافات في اللزوجة ومصادر المغذيات المطلوبة بين الأنواع المتحركة. بالنسبة لبعض الأنواع (على سبيل المثال ، Bacillus subtilis25) ، يمكن أن يكون السرب السطحي سريعا. لذلك ، يجب تقصير الفاصل الزمني للتصوير. يعطي تحديد مساحة السرب بمساعدة الكمبيوتر معلومات أكثر دقة من قياس المسافة لنصف القطر26. لإنشاء حدود واضحة لحساب مساحة السرب بواسطة برنامج ImageJ ، تم استخدام طريقة مضمنة في هذا البروتوكول تضيف ظلالا إلى الصور الأصلية التي تم الحصول عليها باستخدام نظام التصوير الهلامي. إذا اندمجت حدود السرب مع الحدود المجاورة ، منع الهجرة نحو الحدود ، حيث تفضل هذه المجتمعات الهجرة نحو المناطق غير المأهولة من ألواح الاحتشاد (الشكل 2 أ). وتمثل هذه العوامل المقيدة الناتجة عن الحدود المتداخلة تحديا كبيرا في تحديد مسافة الهجرة للاحتشاد السطحي، حيث لا يمكن دمج هذه القيم في عملية الاحتشاد الحر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم دعم تطوير هذه التقنية من خلال الأموال المقدمة من خطة البحث والتطوير الرئيسية الوطنية لوزارة العلوم والتكنولوجيا (2018YF0902604) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية التابعة لصندوق أبحاث الصين للعلماء الشباب الدوليين (22050410270) والصناديق الخارجية لمعاهد شنتشن للتكنولوجيا المتقدمة (DWKF20190001). نود أن نقدم خالص امتناننا للآنسة تشن شينيي لمساعدتها في التدقيق اللغوي للوثيقة وإدارة المختبر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P.
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
